СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2005 года по МПК A61K35/66 A23K1/165 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления бактериальных препаратов для профилактики болезней животных.

Известна кормовая добавка, содержащая смесь живых молочнокислых бактерий и дицитроборатоксихинолин в соотношении 5-20 к 1 по сухому весу (патент РФ №2136173, бюл. 25, опубл. от 10.09.99).

Однако недостатком указанной добавки наличие побочных эффектов за счет ввода в ее состав химического соединения, которое в ряде случаев способно вызвать дисбактериоз. Кроме того, пробиотическая активность у разных штаммов различается и трудно стандартизировать данный препарат.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммов энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus fa'cium ВГНКИ - 27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную жидкость охлаждают до температуры 15-20°С и концентрируют в 10-15 раз, полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°С. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием в полупериодическом режиме работы (патент РФ №2065305, кл. А. 61 К 35/74, бюл. №23, опубл. 1996 г.).

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, необходимость использования гидролизата казеина значительно удорожает препарат. Во-вторых, использование в качестве метода концентрирования ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрации на плоских мембранах делает данный метод дорогостоящим и требующим больших капиталовложений и высокой подготовки персонала. Также обезвоживание значительно усложняет технологический процесс и, увеличивая стоимость, приводит одновременно к потере активности живых микроорганизмов, входящих в состав препарата. Кроме того, использование в качестве смешанной пробиотической культуры только двух видов бактерий делает эту смешанную популяцию неустойчивой, что снижает эффективность ее применения.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения пробиотика для ветеринарии, предусматривающий выращивание лактобактерий и культивирование на соево-печеночной среде в термостате при температуре 36-38°С, причем дополнительно выращивают чистые культуры Bacillus subtilis, Rhuminococcus albus, из лактобактерий Lactobacillus plantarum, культивирование проводят раздельно в течение 72 часов, после чего полученные культуральные жидкости смешивают в равных количествах (патент РФ №2084233, кл. 6 А 61 К 35/66, бюл. №20, 20.07.97 - прототип).

Однако в известном способе используется в качестве одного из компонентов пробиотического препарата Lactobacillus plantarum, который благодаря своим свойствам широко используется в силосовании зеленой массы растений, но мало используется для нормализации работы желудочно-кишечного тракта. Кроме того, в данном способе не указывается источник, откуда выделены используемые в препарате микроорганизмы, что не может обеспечивать высокую эффективность предлагаемого препарата. Следует отметить, что пробиотик, полученный по указанному способу, получится дорогостоящим для применения в животноводстве и птицеводстве, так как каждый вид микроорганизмов культивируется отдельно, что усложняет технологический процесс и требует дополнительного оборудования. Следует отметить, что такой препарат не может обладать комплексным действием: пробиотическим, антимикробным, иммуномодулирующим и располагать целлюлозолитической активностью.

Известные способы не позволяют получать эффективный препарат для профилактики и лечения животных и птицы, сочетающего противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки при использовании дешевого сырья для получения препарата и упрошенной схемы производства.

Техническим решением задачи является сочетание противомикробного и стимулирующего эффекта препарата с одновременным увеличением конверсии корма с высоким содержанием клетчатки для повышения продуктивности животных и птицы, и расширение ассортимента лечебно-профилактических препаратов природного происхождения при использовании дешевого сырья для получения препарата и упрощенной схемы производства за счет совместного культивирование Lactobacillus acidophilus Scav. и Rhuminococcus albus.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения жидкого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus, Rhuminococcus albus. Bacillus subtilis до заданного достижения титра каждого микроорганизма и смешивание полученных культуральных жидкостей, причем из микроорганизма Lactobacillus используют Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis - Bacillus subtilis B-8130, при этом Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr. выращивают на жидкой питательной среде состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясо-пептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция при следующих соотношениях, масс %:

Рубцовая жидкость4,80-5,20Шрот подсолнечниковый0,70-0,80Мясо-пептонный бульон0,45-0,55Хлористый натрий0,08-0,12Сульфат магния0,08-0,12Двузамещенный фосфорнокислый калий0,08-0,12Сульфат аммония0,18-0,22Карбонат кальция0,18-0,22ВодаОстальное,

в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10⁸, а микроорганизм Bacillus subtilis B-8130 выращивают в жидкой питательной среде состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция при следующих соотношениях, мас.%:

Дрожжи0,18-0,22Шрот подсолнечниковый0,70-0,80Меласса0,10-0,20Глютен0,08-0,12Сульфат магния0,08-0,12Двузамещенный фосфорнокислый калий0,18-0,22Хлористый кальций0,10-0,20ВодаОстальное,

доводя до рН - 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis B-8130 1·10⁸-2·10⁸, затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяются при следующих соотношениях, мас.%:

Культуральная жидкость микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625 и Rhuminococcus albus Kr45-55Культуральная жидкость микроорганизмов Bacillus subtilis B-813045-55.

Заявленный способ получения жидкого пробиотического препарата отличается от прототипа соотношением микроорганизмов в нем, схемой совместного культивирования, составом питательной среды и видовым эпитетом Lactobacillus.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию "новизна".

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение поставленной задачи и не выявлены при изучении патентной и научно-технической литературы данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию "изобретательский уровень".

Для получения жидкого пробиотического препарата смешивают между собой культуральные жидкости микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625, Rhuminococcus albus Kr и Bacillus subtilis B-8130. Причем микроорганизмы Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, Rhuminococcus albus Kr выращивают совместно на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясопептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция. Для оценки оптимального варианта питательной среды для выращивания данной клеточной суспензии провели опыты по их культивированию с различным составом и оценивали титр выросших микроорганизмов. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1ПоказателиВариант питательной среды12345Компоненты питательной среды, мас.%:Рубцовая жидкость4,604,805,005,205,40Шрот подсолнечниковый0,650,700,750,800,85Мясо-пептонный бульон0,400,450,500,550,60Хлористый натрий0,060,080,100,120,14Сульфат магния0,060,080,100,120,14Двузамещенный фосфорнокислый калий0,060,080,100,120,14Сульфат аммония0,160,180,200,220,24Карбонат кальция0,160,180,200,220,24Водаосталь
ноеосталь
ноеосталь
ноеосталь
ноеосталь
ное

Количество микроорганизмовТитр Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, кл/мл5·10⁷0,5·10⁸2·10⁸2·10⁸4·10⁸Титр Rhuminococcus albus Kr., кл/мл7·10⁷0,3·10⁸2·10⁸2·10⁸7·10⁸

Как видно из данных, представленных в таблице 1, оптимальным является вариант №3, так как в вариантах с меньшим содержанием солей титр микроорганизмов низкий, а увеличение концентрации соединений приводит к удорожанию питательной среды, без значительного увеличения содержания культивируемых микроорганизмов.

Температурой культивирования является интервал 37-40°С, а временем 37-40°С. Если температуру снизить ниже 37°С, тост культуры будет медленный, и она не достигнет необходимого титра за 5 суток. Если температура культивирования окажется выше 40°С, то рост культуры также будет снижаться, а ее дальнейшее повышением может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому для достижения необходимого титра культурами оптимальным временем культивирования является 5 суток при температуре 38°С.

Микроорганизмы Bacillus subtilis B-8130, выделенные из слепых отростков кишечника глухаря, выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция. Для оценки оптимального варианта питательной среды для выращивания данной клеточной суспензии провели опыты по их культивированию с различным составом и оценивали титр выросших микроорганизмов. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2ПоказателиВариант питательной среды 12345Компоненты питательной среды, мас.%:Дрожжи0,160,180,200,220,24Шрот подсолнечниковый0,650,700,750,800,85Меласса0,050,100,150,200,25Глютен0,060,080,100,120,14Сульфат магния0,060,080,100,120,04Двузамещенный фосфорнокислый калий0,60,180,200,220,24Хлористый кальций0,050,100,150,200,25Водаостальн
оеостальн
оеостальн
оеостальн
оеостальн
оеКоличество микроорганизмовТитр Bacillus subtilis B-8130, кл/мл9·10⁷1,5·10⁸2·10⁸2·10⁸3·10⁸

Как видно из данных, представленных в таблице 2, оптимальным является вариант №3, так как в вариантах с меньшим содержанием солей количество микроорганизмов будет низкий, а увеличение концентрации соединений приводит к удорожанию питательной среды, без значительного увеличения содержания культивируемых микроорганизмов.

Температурой культивирования является интервал 37-45°С, а временем 4-6 суток. Если температуру снизить ниже 37°С, тост культуры будет медленный, и она не достигнет необходимого титра за 5 суток. Если температура культивирования окажется выше 45°С, то рост культуры также будет снижаться, а ее дальнейшее повышением может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому для достижения необходимого титра культурами оптимальным временем культивирования является 5 суток при температуре 41°С.

Полученные, таким образом, суспензии микроорганизмов объединяют. Если внести в препарат Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr меньше 45%, то пробиотической активности препарата не будет, т.к. количество бактерий будет недостаточно, и целлюлозолитическая активность препарата не будет регистрироваться, т.к. количество бактерий будет недостаточно для эффективного процесса разрушения клетчатки. Если внести более 55% суспензии бактерий видов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr, то антимикробный эффект не увеличивается, скорость разрушения клетчатки не увеличиться, так как субстрата для их развития будет недостаточно и поэтому нет необходимости вводить больше бактерий. Для того, чтобы эффективность препарата была оптимальной количество молочнокислых бактерий вида Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и целлюлозолитических бактерий Rhuminococcus albus Kr. должно составлять 50% от общего количества микроорганизмов в предлагаемом препарате. Если внести в препарат Bacillus subtilis B-8130 меньше 45%, то антимикробная и иммуностимулирующая активности препарата будут низкие, так как количество бактерий будет недостаточно. Если внести более 55%, то увеличение требуемого эффекта наблюдаться не будет. Для того, чтобы эффективность препарата была оптимальной, количество бацилл вида Bacillus subtilis B-8130 должно составлять 50%.

Пример конкретного осуществления способа получения влажного пробиотического препарата осуществлялся в ФГУ "Краснодарский биоцентр" г.Краснодар.

Выращивание бактериальных культур Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625 и Rhuminococcus albus Kr осуществляют на жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали состав, указанный ниже, на который после автоклавирования при 1 атм в течение 1 час, и охлаждения засевали чистую культуру микроорганизмов, методом смыва со кошеного агара:

рубцовая жидкость50 млшрот подсолнечниковый7,5 гмясопептонный бульон5,0 гхлористый натрий1,0 гсульфат натрия1,0 гфосфат калия однозамещенный1,0 гсульфат аммония2,0 гмел2,0 г

Культивирование осуществляли в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 5 суток при температуре 37-40°С до получения титра бактериальных клеток 2·10⁸ клеток/мл среды.

Одновременно культивируют Bacillus subtilis B-8130 на жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали состав, указанный ниже, на который после автоклавирования при 1 атм в течение 1 час и охлаждения засевали чистую культуру микроорганизмов, методом смыва со кошеного агара:

дрожжи20 гмеласса15 гшрот подсолнечниковый7,5 гсульфат магния1,0 гфосфат калия однозамещенный2,0 гхлористый кальций1,5 гглютен10 гpH7,2-7,4

Культивирование осуществляли в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 5 суток при температуре 37-45°С до получения титра бактериальных клеток 1·10⁸ клеток/мл среды. Полученные таким образом культуральные жидкости объединяются стерильно в соотношении 1:1 по объему.

Промышленная эффективность пробиотического препарата полученного по предлагаемому способу иллюстрируется примерами.

Пример 1. Испытание препарата, полученного по предлагаемому способу, было проведено на птицефабрике "Кубань", Усть-Лабинского района Краснодарского края в виде добавки при выращивании цыплят-бройлеров кросса "СК-Русь". Схема опыта представлена в таблице 3.

Таблица 3Схема опыта на цыплятах-бройлерахГруппаКоличество головХарактеристика кормления (уровень клетчатки в рационе)Контрольная120Основная кормовая смесь составлена по нормам ВНИТИП - содержание клетчатки 3,9-4,2% по периодам выращиванияI опытная120OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-4,2-4,8II опытная120OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-4,5-5,0III опытная120OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-5,0-5,5IV опытная120OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-5,0-6,0

Основные результаты оценки эффективности предлагаемого препарата в рационах цыплят-бройлеров с разным уровнем клетчатки представлены в таблице 4.

Как свидетельствуют данные таблицы 4, повышение уровня клетчатки в рационах бройлеров до 6% на финише, при применении предлагаемого препарата, позволило получить вполне удовлетворительные результаты сравнимые с контролем, где уровень клетчатки не повышался выше 4,8% на финишном рационе. Таким образом, предлагаемый препарат позволяет значительно изменить структуру рационов для цыплят-бройлеров, увеличивая ввод шротов из подсолнечника, что позволяет снизить стоимость кормов.

Таблица 4Основные результаты оценки эффективности предлагаемого препарата в рационах цыплят-бройлеров с разным уровнем клетчаткиГруппаУровень клетчатки в рационе по периодам, %Живая масса птицы в 49 суток, кгЗатраты кормов на 1 голову, кгЗатраты кормов на 1 кг привеса живой массыСтоимость кормов на 1 голову, рублейСтоимость кормов на 1 кг живой массы, рублейКонтро
льная3,9-4,2-4,81,7404,1782,457,274,26I опыт
ная3,9-4,2-4,81,8504,1802,307,264,00II опыт
ная3,9-4,5-5,01,7904,1772,387,254,13III опыт
ная3,9-5,0-5,51,7704,1722,407,224,16IY опыт
ная3,9-5,0-6,01,7504,1702,437,184,19

Пример 2. Научно-хозяйственный опыт на курах-несушках кросса УК-Кубань 123 был проведен на птицефабрике "Ново-Мышастовская", Красноармейского района. Краснодарского края. Рацион контрольной и опытной групп состоят из кормов растительного происхождения, основу которых составили пшеница, ячмень, кукуруза, шрот подсолнечный, рисовая мучка, минеральные и витаминные добавки. В опытной группе добавляли препарат, полученный по предлагаемому способу, в расчете 2 кг на 1 тонну кормосмеси. Результаты опыта приведены в таблице 5.

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый пробиотический препарат увеличивает сохранность птицы, ее яйценоскость, снижая затраты кормов на 10 яиц и не ухудшая качества яиц.

Пример 3. Опыт на телятах проводился в АО им. М.Горького, Ленинградского района. Краснодарского края. Предлагаемый препарат применялся на поголовье телят. В контрольной и опытной группах было по 15 голов в возрасте 1-180 дней. Пробиотическая добавка вводилась в корм опытной группы в возрасте до 5 дней по 4 г в сутки на голову, а в дальнейшем в количестве 0,4% к сухому веществу рациона ежедневно в соответствии с "Временным наставлением по применению препарата пробиотического препарата".

Анализируя данные опыта, можно отметить, что предлагаемый препарат ускорял формирование микрофлоры рубца, снижал заболеваемость опытных животных и повышал поедаемость грубых кормов. В опытной группе продуктивность животных (среднесуточные привесы) повысилась на 18-25%, сохранность - на 10%, расходов кормов снизился на 15% по сравнению с контрольной. Побочных действий и осложнений при применении предлагаемого препарата в рекомендованных дозах не установлено.

Пример 4. Опыт на откормочных свиньях проводился в АО "2-я пятилетка" Ленинградского района Краснодарского края. Предлагаемый препарат применялся на фоне рационов с высоким содержанием клетчатки. Результаты откорма свиней на рационах такого типа позволили получить приросты живой массы 550 г, что на 10 г хуже контроля. Однако стоимость 1 тонны таких комбикормов примерно на 350 рублей ниже контрольных. Таким образом, применение предлагаемого препарата при откорме свиней экономически оправдано.

Таблица 5Данные опыта по кормлению кур-несушек предлагаемым препаратомПоказательГруппаконтрольнаяопытнаяЖивая масса на начало опыта, г18021818Живая масса на конец опыта, г17701760Сохранность поголовья, %98100Яйценоскость, шт.,%72,280,7Затраты корма на 1 гол./г124,7122,9Затраты корма в кг на 10 шт. яиц1,731,52Получено яиц (всего штук)15111694Толщина скорлупы35,0335,10Вес яиц (средний), г59,959,5

Как показали результаты хозяйственных и научно-производственных испытаний по примерам 1, 2, 3, 4, полученный по заявляемому способу пробиотический препарат эффективно сочетает противомикробные и стимулирующие свойства при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки за счет наличия целлюлозолитической активности, что выражается в более высокой продуктивности и повышенной сохранности в опытных группах животных и птицы в сравнении с контрольными группами во всех опытах.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления пробиотических бактериальных препаратов для профилактики болезней животных. Проводят раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis - Bacillus subtilis B-8130. Причем Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Кг выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясопептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция и воды при заданном соотношении компонентов в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10⁸. Штамм Bacillus subtilis B-8130 выращивают в жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция, и воды при заданном соотношении компонентов, доводя до рН - 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis B-8130 1·10⁸-2·10⁸. Затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяют при следующих соотношениях, мас.%: Культуральная жидкость микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr 45-55, Культуральная жидкость микроорганизмов Bacillus subtilis B-8130 45-55. Способ повышает эффективность профилактики и лечения животных и птицы, сочетающего противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки и расширении ассортимента лечебно-профилактических препаратов природного происхождения. 5 табл.

Способ получения жидкого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus, Rhuminococcus albus, Bacillus subtilis до заданного достижения титра каждого микроорганизма и смешивание полученных культуральных жидкостей, отличающийся тем, что из микроорганизма Lactobacillus используют Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis - Bacillus subtilis B-8130, при этом Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясо-пептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция при следующих соотношениях, мас.%:

Рубцовая жидкость4,80-5,20Шрот подсолнечниковый0,70-0,80Мясо-пептонный бульон0,45-0,55Хлористый натрий0,08-0,12Сульфат магния0,08-0,12Двузамещенный фосфорнокислый калий0,08-0,12Сульфат аммония0,18-0,22Карбонат кальция0,18-0,22ВодаОстальное

в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10⁸, а микроорганизм Bacillus subtilis В-8130 выращивают в жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция при следующих соотношениях, мас.%:

Дрожжи0,18-0,22Шрот подсолнечниковый0,70-0,80Меласса0,10-0,20Глютен0,08-0,12Сульфат магния0,08-0,12Двузамещенный фосфорнокислый калий0,18-0,22Хлористый кальций0,10-0,20ВодаОстальное

доводя до рН - 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis В-8130 1·10⁸-2·10⁸, затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяют при следующих соотношениях, мас.%:

Культуральная жидкость микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr45-55Культуральная жидкость микроорганизмов Bacillus subtilis В-813045-55