СПОСОБ АДАПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 1997 года по МПК A61K38/20 A61K38/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам адаптивной иммунотерапии, особенно при лечении больных с распространенными гнойно-септическими процессами: разлитой гнойный перитонит, сепсис, нагноительные заболевания легких или их комбинации.

Известен способ (PCT N 89/04665, кл. А 61 К 37/02, 1989 г.) лечения инфекционных заболеваний у детей, вызываемых основной иммунологической недостаточностью клеточной иммунной функции в организме, при котором ребенку назначают иммунотерапевтически активное эффективное количество интерлейкина-2 (ИЛ-2).

Известен способ использования ИЛ-2 при вакцинации лиц с ослабленной иммунологической резистетностью врожденных аутоиммунных болезней (патент Германии N 3818054, кл. А 61 К, 1989 ). По данному способу используют комбинацию ИЛ-2 с антигенами или вакцинами для превентивного или терапевтического восстановления ослабленной иммунологической резистентности.

Известен также метод лечения инфекционных болезней комбинацией ИЛ-2 и иммуноглобулинов человека (патент Германии N 3818055, кл. А 61 К 37/02, 1989 ).

Известен также способ лечения с использованием только ИЛ-2 при расширенных бактериальных инфекциях (патент Германии N 3910011, А 61 К 37/02, 1990 ). По этому способу введение ИЛ-2 внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно приводит к усилению неспецифического клеточного ответа, что способствует снижению числа бактерий в перитонеальной полости и снижению эндотоксинов в плазме крови. Способ по патенту может быть использован путем введения ИЛ-2 в дозе 1-3,5•10⁶ ЕД/кг в послеоперационном периоде, состояниях после тяжелой травмы, распространенной грамположительной и грамотрицательной инфекции, перитоните, иммунодепрессивных состояниях.

Однако использование высоких доз ИЛ-2 может вызывать развитие токсических реакций и является чрезвычайно дорогостоящим.

Известен способ адаптивной иммунотерапии при лечении некоторых онкологических заболеваний [1] именно, метастазирующей меланомы и рака почки, заключающийся в заборе крови у пациента, выделении мононуклеарных клеток, культивировании их с ИЛ-2 и возврате пациенту. Забор крови и выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) осуществляют на сепараторе клеток крови (прибор "Blond cell separator"). Эритроциты сразу возвращают в кровь пациенту. МНК в концентрации- 1-2^o10⁶ кл/мл культивируют с ИЛ-2 в дозе 1000 ЕД/мл в течение 2-5 суток. Затем МНК в сочетании с инфузиями высоких доз ИЛ-2 возвращают пациенту. Инкубация МНК с ИЛ-2 приводит к генерации лимфокин-активированных киллеров, способных убивать опухолевые клетки.

Недостатками метода являются ограниченность сферы использования (эффективность в виде 25% клинического ответа регистрируется только при меланоме и раке почки), токсичность высоких доз ИЛ-2 и дороговизна метода.

Задачей изобретения является расширение сферы использования, повышение эффективности, снижение себестоимости способа.

Задача решается в изобретении тем, что в способе адоптивной иммунотерапии, заключающемся в заборе крови у пациента, выделении мононуклеарных клеток, культивировании их с ИЛ-2 и возврате пациенту, выделение мононуклеарных клеток проводят в два этапа, на первом из которых получают лейковзвесь, а втором из лейковзвеси выделяют мононуклеарные клетки; эритроциты подвергают двухкратной процедуре отмывания и модифицируют путем связывания с комбинацией цитокинов, после чего возвращают обратно пациенту, причем при наличии гнойной полости перед введением пациенту культивированных с ИЛ-2 мононуклеарных клеток полость промывают раствором, содержащим комбинацию цитокинов, полученных при культивировании МНК с ИЛ-2.

В стерильный флакон вводят 7,5 тыс ЕД гепарина, забирают 300-400 мл венозной крови больного, добавляют 20% раствора желатиноля и инкубируют 45 мин при 37^oC. Лейковзвесь собирают в отдельный флакон, центрифугируют при 1000 об/мин 20 мин и удаляют недостаток. Клетки лейковзвеси ресуспендируют в фосфат-забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и центрифугируют в градиенте плотности фиколла-верографина при 3000 об/мин 20 мин. После чего клетки интерфазы (МНК) собирают и трехкратно отмывают Р. Выделение МНК ресуспендируют в полной культуральной среде RPMI-1640, дополненной 5% сыворотки доноров IV (AB) группы, доводят до концентрации 2•10⁶ кл/мл и культивируют в стеклянных матрацах с ИЛ-2 в дозе 50-100 ЕД/мл в течение 48 ч. Затем клетки однократно отмывают ЗФР, ресуспендируют в 100 мл физиологического раствора и вводят пациенту. Оставшиеся во флаконе (после забора лейковзвеси) эритроциты однократно отмывают физиологическим раствором и модифицируют путем инкубации в течение 1 ч при 37^oC с раствором, содержащим комбинацию цитокинов, в присутствии биологически приемлемого фиксатора. После инкубации эритроциты однократно отмывают физиологическим раствором, доводят до исходного объема крови физиологическим раствором и возвращают пациенту. У больных с наличием гнойных полостей (абсцессы, плеврит, перитонит) перед введением ИЛ-2-активированных МНК полость промывают раствором, содержащим комбинацию цитоксинов.

Пример 1. Мужчина, 43 лет. Поступил в 3 хирургическое отделение Муниципальной Клинической Больницы N 12 11.04.94 г. с диагнозом острый аппендицит, диффузный перитонит.

11.04.94 г. операция: лапаротомия, дренирование сальниковой сумки, холецистостомия, дренирование брюшной полости. В брюшной полости большое количество серозно-геморрагического выпота: поджелудочная железа тотально поражена отечна, багрового цвета.

Больному проводилась антибактериальная, дезинтоксикационная, антиферментная терапия, плазмоферез, форсированный диурез, нейровегетативные блокады в эпидуральное пространство.

Несмотря на проводимую интенсивную терапию состояние больного оставалось тяжелым: вялость, заторможенность, бледность кожных покровов, влажный язык, умеренно болезненный живот без четких перитональных симптомов, тошнота, рвота, плохой аппетит, гипертермия до 38,5^oC, жесткое дыхание с сухими и влажными хрипами. В крови токсическая зернистость нейтрофилов, токсическая анемия, высокая дистаза мочи.

Нагноение послеоперационной раны, расплавление жировой клетчатки соком поджелудочной железы, расхождение апоневроза на всем протяжении послеоперационной раны.

Диагноз: острый жировой панкреонекроз.

Осложнение: формирующийся панкреатический свищ. Разливной серно-геморрагический перитонит. Колибактериальный сепсис. Двусторонняя пневмония. Обширная рана брюшной полости.

От проводимого лечения положительной динамики нет. Вероятность летального исхода высокая. Адаптивная терапия начата 04.05.94 г. Однократная гемоэксфузия (400 мл крови), в день гемоэксфузии введение модифицированных аутоэритроцитов и 06.05.97 г. в/в инфузия ИЛ-2-активированных М К (650•10⁶ клеток). Перед инфузией ИЛ-2-активированных МНК проведена перфузия брюшной полости раствором, содержащим комбинацию цитокинов.

Через 3-4 дня после проведенной АИТ нормализовалась температура тела, появился аппетит, больной стал активен, лапаростомная рана стала быстро очищаться и заполняться грануляциями. По лабораторным анализам: уменьшилась анемия, исчезла токсическая зернистость, нормализовался общий белок крови, амилаза крови, дистаза мочи. С 10.05.94 г. посевы крови стерильные (до этого высевали E.Coli).

В последующем больной адекватно реагировал на всю проводимую терапию. 03.06.94 г. выписан в удовлетворительном состоянии (сформировавшийся околопанкреотический свищ, чистая срединная рана с активной краевой эпителизацией и яркими грануляциями). Прибавка в весе, хороший аппетит, явления пневмонии купированы.

Пример 2. Мужчина, 45 лет, поступил в 3 хирургическое отделение Муниципальной Клинической Больницы N 12 19.12.93 г. с диагнозом: абсцедирующая пневмония справа, пиопневмоторакс справа.

Рентгенологически: уровень жидкости до 1 ребра, средостение резко смещено влево. Правое легкое коллабировано почти полностью.

Лабораторно: анемия, лейкоцитоз, высокая СОЭ.

Выполнена плевральная пункция, дренирование плевральной полости с активной аспирацией (около 2 л гнойной жидкости), проводится антибактериальная, инфузионная, дезинтоксикационная и физиотерапия). 24.12.93 г. вскрытие флегмоны грудной стенки, сформировалась гнойная полость. Состояние больного оставалось тяжелым: температура тела 38-39^oC, частый кашель с мокротой.

31.12.93 г. вскрытие флегмоны, дренирование гной ной полости, послеоперационный период осложнился инфекционно-токсическим шоком.

Интенсивная терапия в условиях РО.

03.01.94 г. ухудшение состояния (боли в животе, тошнота, рвота, сухость во рту), обусловленное прорывом гнойника из плевральной в брюшную полость с развитием перитонита.

04.01.94 г. лапаротомия, санация, дренирование брюшной полости (около 1 л гнойного экссудата), плевроторакальный свищ справа. В п/операционном периоде прогрессирующий перитонит, по поводу чего неоднократно проводились санации брюшной полости. У больного сохраняется анемия, гипопротеинемия, выраженная интоксикация.

Клиническая картина сепсиса.

13.01.94 г. произошла эвентрация петель тонкого кишечника.

14.01.94 г. лапаротомия. Состояние больного остается стабильно тяжелым.

Диагноз: Абсцедирующая пневмония справа. Пиопневмоторакс справа. Флегмона грудной клетки справа.

Осложнения: эмпиема плевры, плевроторакальный свищ справа, разлитой гнойно-фибринозный перитонит, подпеченочный абсцесс, эвентрация петель тонкого кишечника.

Эффективности от проводимого лечения нет. Вероятность летального исхода высокая.

Адоптивная иммунотерапия начата 18.01.94 г. Проведено 2 процедуры гемоэксфузии (по 250 мл крови), ремнфузия модифицированных аутоэритроцитов в дни забора крови и возврат ИЛ-2-активированных МНК (1,3•10⁹ и 3•10₁₀ клеток, соответственно). Перед введением ИЛ-2-активированных МНК проведена перфузия плевральной и брюшной полостей раствором, содержащим комбинацию цитокинов.

После проведенной терапии состояние больного улучшилось: уменьшилась интоксикация, дыхательная недостаточность, разрешился парез кишечника, отмечается быстрая положительная динамика в течение раневого процесса на грудной стенке (рана активно гранулирована, значительно сократилась гнойная полость).

22.01.94 г. этапная санация брюшной полости, зашивание брюшной стенки. Послеоперационный период без осложнений.

22.02.94 г. выписан в удовлетворительном состоянии с поверхностными гранулирующими ранами.

Пример 3. Женщина, 52 года. Поступила в 3 хирургическое отделение Муниципальной Клинической Больницы N 12 22.04.94 г. с диагнозом: остеомиелит головки левой бедренной кости, коксит левого тазобедренного сустава.

Назначена консервативная терапия (антибиотики, витамины, физиолечение). Несмотря на проводимое лечение состояние больной ухудшается, присоединилась двусторонняя пневмония, нарастает интоксикация.

29.04.94 г. переведена в палату интенсивной терапии.

30.04.94 г. артротомия, вскрытие параатикуллярной флегмоны (удалено около 500 мл гнойного экссудата).

Послеоперационный диагноз: гнойный коксит слева, остеомиелит головки и шейки левой бедренной кости, параартикуллярная флегмона левого тазобедренного сустава. Стафилококковый сепсис.

Адоптивная иммунотерапия начата 04.05.94 г. Гемоэксфузия (400 мл крови), реинфузия модифицированных аутоэритроцитов и 06.05.94 г. введение ИЛ-2-активированных МНК.

Через 2 недели процедуру повторили. После первой процедуры отмечено: уменьшение количества отделяемого из раны; отделяемое стало приобретать серозный характер. На 6-7 сутки перестали беспокоит боли в ране, нормализовалась температура тела. На 10 сутки отмечено появление грануляций, краевая эпителизация.

После повторной процедуры АИТ больная стала активна, рана и раневая полость значительно со4кратились в размерах, отделяемого из раны нет. Посевы крови стерильные.

23.06.97 г. больная выписана в удовлетворительном состоянии с заживающими ранами.

Далее представлены сравнительные данные по проценту летальности при проведении лечения по предложенному способу и традиционному методу.

Группа больных Летальность
Всего (n-24) 16% (4/24)
Данные литературы^* 28-49%
^* Стручков В.И. Гостищев В.К. Стручков Ю.В. Руководство по гнойной хирургии / АМН СССР М. Медицина, 1984. 512 с.

Из этих данных видно, что эффективность предложенного способа существенно выше, чем при использовании традиционных схем терапии гнойно-септических больных (антибактериальная, дезинтоксикационная, инфузионная и т.д.).

Изобретение относится к медицине, используется, в частности, при лечении больных с гнойно-септическими процессами. Сущность изобретения: при способе адаптивной иммунотерапии выделение мононуклеарных клеток проводят в два этапа, на первом из которых получают лейковзвесь, а на втором - из лейковзвеси выделяют мононуклеарные клетки; эритроциты подвергают двукратной процедуре отмывания и модифицируют путем связывания с комбинацией цитокинов, после чего возвращают их обратно пациенту, причем при наличии гнойной полости перед введением пациенту культивированных с интерлейкином-2 мононуклеарных клеток, гнойную полость промывают раствором, содержащим комбинацию цитокинов, полученных при культивировании мононуклеарных клеток с интерлейкином-2.

Способ адаптивной иммунотерапии, заключающийся в заборе крови у пациента, выделении мононуклеарных клеток, культивировании их с интерлейкином-2 и возврате их пациенту, отличающийся тем, что выделение мононуклеарных клеток проводят в два этапа, на первом из которых получают лейковзвесь, а на втором из лейковзвеси выделяют мононуклеарные клетки, эритроциты подвергают двукратной процедуре отмывания и модифицируют путем связывания с комбинацией цитокинов, после чего возвращают их обратно пациенту, причем при наличии гнойной полости перед введением пациенту культивированных с интерлейкином-2 мононуклеарных клеток гнойную полость промывают раствором, содержащим комбинацию цитокинов, полученных при культивировании мононуклеарных клеток с интерлейкином-2.