СПОСОБ ОЦЕНКИ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЗАРОДЫШЕВЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ЭХИНОКОККА in vitro Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии эхинококкоза. С целью профилактики рецидивов эхинококковой болезни при хирургическом вмешательстве путем обезвреживания зародышевых элементов эхинококка в фиброзной полости и на поверхности тканей больного применяется ряд химических агентов и физических факторов. В качестве таких агентов были испробованы 10% йодоформоглицериновая эмульсия, 2-5% настойка йода, 3% раствор борной кислоты, раствор фурациллина 1:5000, риванола 1:1000, 1-15% водные и глицериновые растворы формалина, 1% диоксидина, различные антибиотики, 3-30% растворы поваренной соли, 80-100% глицерин, горячий физиологический раствор, бетадин и др. [1, 2, 3]. Большая часть из вышеприведенных препаратов не получила широкого применения из-за высокой токсичности для тканей хозяина либо слабой обезвреживающей активности.

Использование некоторых физических факторов (лазер, рентгеновское облучение, УФО, УВЧ, плазменный поток, местная гипертермия, криовоздействие, ультразвук низкой частоты) не дало обнадеживающих клинических результатов, хотя экспериментальные данные свидетельствовали об их высокой эффективности [2].

В настоящее время поиск эффективных способов обеззараживания стенок фиброзной капсулы гидатидного эхинококка, грудной, брюшной полостей, особенно при прорыве эхинококковых кист, не оказывающих повреждающее действие на ткани организма, особенно легочную и брюшинный покров, продолжает быть актуальным.

Ключевым моментом подобных исследований является объективность критериев оценки жизнеспособности зародышевых элементов паразита, на обезвреживание которых направлено воздействие. Таковыми являются: двигательная активность протосколексов при температуре 37-40°С, количество известковых телец и морфологическая структура паренхимы, короны крючьев и кутикулярной оболочки [3]. Кроме того, оценивается способность протосколексов окрашиваться в нативном препарате и вызывать образование эхинококковых кист у лабораторных животных при постановке биологической пробы.

К недостаткам вышеуказанных критериев относятся трудность регистрации возникающих изменений в нативном препарате (за исключением прекращения движения), а также необходимость постоянного и длительного наблюдения за одним и тем же полем зрения. При этом на нативный препарат оказывают дополнительное повреждающее действие колебания температуры и подсыхание. Кроме того, приведенные критерии являются лишь косвенными признаками, по которым приходится судить о неспособности обработанного материала вызывать развитие болезни при попадании на ткани больного. Требуется постановка биологической пробы [3], для которой необходимы высокочувствительные к болезни лабораторные животные и длительное (несколько месяцев) наблюдение за ними.

Наиболее близким нашему изобретению является способ, предложенный Ф.П.Коваленко с соавт. (Коваленко Ф.П., Расулов С.М., Хакбердиев П.С. и др. Способ определения жизнеспособных протосколексов эхинококка в пробе in vitro. - Авторское свидетельство №1635961. Бюл. №11 от 1991 г.). Данный способ взят в качестве прототипа.

Способ-прототип состоит в следующем.

На предметное стекло помещают две капли взвеси исследуемых протосколексов (после воздействия испытуемым агентом) в физиологическом растворе. Первая капля контрольная, вторая опытная. С помощью фильтровальной бумаги из второй капли удаляют физиологический раствор и наносят на протосколексы одну каплю глицерина. Обе капли покрывают покровным стеклом и тотчас подвергают микроскопии при малом увеличении микроскопа. У живых протосколексов под влиянием глицерина наблюдается контрактура тела. При этом протосколексы уменьшаются в размере 1,5-2 раза по сравнению с контролем, утрачивают округлую форму, приобретают неправильные очертания, паренхима тела протосколексов просветляется, известковые тельца становятся невидимыми. По внешнему виду протосколексы напоминают кристаллы. Указанные изменения наступают через 1-2 секунды и наблюдаются в течение 30-40 минут после добавления глицерина. У погибших протосколексов при добавлении глицерина указанные изменения при сравнении с контролем не наблюдаются.

К недостаткам прототипа следует отнести следующие моменты.

1. Используемый критерий - появление контрактуры у живых протосколексов и отсутствие таковой у погибших - являются лишь косвенным признаком, по которому приходится судить об эффективности антипаразитарного воздействия и неспособности обработанных зародышевых элементов вызывать болезнь, т.е. формировать кисты.

2. Регистрация сокращения и обездвиживание возможны только у протосколексов, у которых в исходном состоянии движения заметны и активны. У большинства интактных протосколексов в эхинококковой кисте движения малозаметны, а в выводковых капсулах - вообще трудно фиксируемы. После воздействия агентов, обладающих гипертоническими свойствами (3-30% NaCl, спирт, 80-100% глицерин и др.), протосколексы уже находятся в состоянии контрактуры, что ограничивает использование способа.

3. После воздействия сколексоцидным агентом в клинической ситуации протосколексы попадают на благоприятные условия для своего развития. При этом не исключается обратимость изменений в протосколексах, что не учитывается в прототипе. Напротив, протосколексы подвергаются дополнительному воздействию неблагоприятных факторов, что может повлечь за собой ложноположительную оценку эффективности воздействия.

Целью изобретения является создание объективного и приближенного к биологической пробе способа тестирования методов обезвреживания зародышевых элементов эхинококка, применяемых для профилактики рецидивов болезни.

Сущность изобретения

Соблюдая стерильность, в пробирку помещают взвесь из однократно отмытого в физиологическом растворе осадка из свежевзятого содержимого гидатидной кисты. Производят микроскопию нативного препарата из осадка. Пригодным для эксперимента считается материал, в котором имеются зрелые протосколексы и выводковые капсулы.

По 0,2-0,5 мл взвеси зародышевых элементов помещают в пробирки с испытуемыми препаратами, в т.ч. физиологическим раствором (для контроля) либо воздействуют тестируемыми физическими факторами необходимое количество времени. После необходимой экспозиции зародышевые элементы отмываются физиологическим раствором и флаконы с ними помещаются в термостат при температуре 32-38°С на 12-48 часов. Все процедуры проводятся с соблюдением стерильности.

По истечении срока инкубации оцениваются наличие и количество микроацефалоцист в каждом флаконе. В контрольном флаконе у большей части протосколексов из ножки формируются микроацефалоцисты (см. чертеж: нативный препарат, увеличение 8×8; поз.1 - протосколекс, поз.2 - микроацефалоциста).

Воздействие на зародышевые элементы эхинококка считается эффективным, если микроацефалоцисты не сформировались.

Пример конкретного использования предлагаемого способа

Способ, предложенный в качестве изобретения, применен для изучения антипаразитарной активности 3% формалина при экспозиции в течение 2 минут.

Соблюдая стерильность, в пробирку поместили взвесь из однократно отмытого в физиологическом растворе осадка свежевзятого содержимого гидатидной кисты больного. При микроскопии осадок содержит зрелые протосколексы и выводковые капсулы.

По 0,5 мл взвеси зародышевых элементов поместили в пробирку с 3% формалином и с 0,9% раствором NaCl (контроль). После необходимой экспозиции зародышевые элементы отмыли 4-кратно теплым физиологическим раствором и флаконы с ними поместили в термостат при температуре 32-38°С. Все процедуры проводились с соблюдением стерильности.

По истечении 12-48 часов инкубации при микроскопии содержимого осадка из флаконов оценивались наличие и количество микроацефалоцист в каждом флаконе. В контрольном флаконе у большей части протосколексов из ножки сформировались микроацефалоцисты размером до 1/3-1/2 объема протосколекса. Во флаконе с обработанными 3% формалином зародышевыми элементами микроацефалоцист не обнаружено.

Признаки, отличающиеся от прототипа

В отличие от известных способов изучения эффективности повреждающего действия различных способов на зародышевые элементы эхинококка, проводимых in vitro, в том числе и в прототипе, в предлагаемом способе оценивается сохранение способности протосколексов формировать микроацефалоцисты (начальную стадию эхинококковой кисты) после воздействия испытуемых сколиксоцидных агентов, тем самым проба приближена к биологической пробе.

Положительный эффект изобретения

Ключевым моментом исследований по поиску оптимальных сколиксоцидных агентов является объективность учитываемых критериев оценки жизнеспособности зародышевых элементов паразита, на обезвреживание которых направлено воздействие. К настоящему моменту известными критериями являются двигательная активность протосколексов при температуре 37-40°С, количество известковых телец и морфологическая структура паренхимы, короны крючьев и кутикулярной оболочки [1]. Кроме того, оценивается способность протосколексов окрашиваться в нативном препарате и вызывать образование эхинококковых кист у лабораторных животных при постановке биологической пробы. За исключением последнего критерия (биологической пробы) все остальные критерии являются косвенными признаками неспособности обработанных зародышевых элементов вызывать болезнь (эхинококкоз), т.к. для микроорганизмов могут быть характерны свойства регенерации организма из отдельной их части или нескольких клеток.

Оценка способности формирования микроацефалоцист из зародышевых элементов, учитываемая по предлагаемому способу, является более объективным и приближенным к биологической пробе критерием, по сравнению с другими критериями, оцениваемыми in vitro.

Кроме того, при тестировании ограничивается до минимума воздействие других повреждающих моментов на испытуемые зародышевые элементы эхинококка, которые имеют место при других способах (окрашивание, колебания температуры и т.д.). В способе учитывается возможность обратимости изменений в протосколексах, происходящих после воздействия агентами. Более того, моделируется ситуация, приближенная к клинической, при которой обработанные сколексоцидными агентами протосколексы попадают в благоприятные условия.

Способ прост в исполнении, не требует дополнительного оборудования и больших материальных затрат.

Информация, принятая во внимание

RU 1635961, 23.03.1991. - прототип.

1. Бирюков Ю.В. и др. Обработка полости кист при гидативном эхинококкозе. Хирургия, 1984, №5, с.27-29.

2. Гилевич М.Ю. Выбор метода обработки полости фиброзной капсулы при эхинококкэктомии. Хирургия, 1984, №4, с.74-76.

3. Коваленко Ф.П. и др. Влияние низкочастотного ультразвука на жизнеспособность зародышевых элементов ларвоцистоднокамерного и многокамерного эхинококков в эксперименте in vitro. Мед. паразитол., 1986, №6, с.31-36.

Изобретение относится к области медицины. Изобретение заключается в том, что оценивается способность зародышевых элементов формировать микроацефалоцисты, что является более объективным и приближенным к биологической пробе критерием по сравнению с другими критериями, оцениваемыми in vitro. При тестировании ограничивается до минимума воздействие других повреждающих моментов на испытуемые зародышевые элементы эхинококка, учитывается возможность обратимости изменений в протосколексах, возникших после воздействия формалином при t° 32-38°C в течение 12-48 часов. Моделируется ситуация, приближенная к клинической, при которой обработанные сколексоцидными агентами протосколексы попадают в благоприятные условия. Способ прост в исполнении, не требует дополнительного оборудования и больших материальных затрат. 1 ил.

Способ оценки сохранения жизнеспособности зародышевых элементов эхинококка после воздействия физическим или химическим фактором in vitro и проведения микроскопии, отличающийся тем, что проводят инкубацию зародышевых элементов эхинококка, обработанных химическим веществом или физическим фактором при температуре 32-38°С в течение 12-48 ч, после чего оценивают жизнеспособность по наличию и количеству развившихся микроацефалоцист.