РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИН-5'-ТРИФОСФАТА Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/66 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) на основе фермента - люциферазы светляков.

Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, прямо пропорциональна концентрации АТФ. Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицине, промышленности и экологии. С использованием реагента для определения аденозин-5'-трифосфата разработаны методики быстрого контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и напитков. Расчеты показывают, что потребности в определении АТФ для этих целей могут достигать миллионов определений в год, если стоимость реагента будет достаточно низкой, а активность и стабильность реагента будут достаточно высокими.

Наиболее близким к заявляемому является Патент РФ №2164241, 1999, (Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата"), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75%-ным сульфатом аммония, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза иммобилизованная0,05-0,20Люциферин0,014-0,056Сульфат магния0,2-0,3Трис-(оксиметил)-аминометан0,12-0,60Уксусная кислота0,01-0,60Этилендиаминтетраацетат натрия0,04-0,08Дитиотреитол0,05-0,10Бычий сывороточный альбумин0,05-0,20D-(+)-трегалоза5,0-20,0ВодаОстальное

Недостатком прототипа является невысокая каталитическая активность иммобилизованной люциферазы, поскольку при иммобилизации теряется около 80% активности фермента, что делает необходимым использовать для анализа АТФ относительно высокие количества реагента и тем самым увеличивает расход реагента для определения АТФ. Недостатком прототипа также является неоднородность суспензии иммобилизованной люциферазы, что приводит к довольно высокой погрешности результатов при определении ультрамалых концентраций АТФ. Недостатком прототипа является, кроме того, и то, что иммобилизация усложняет процедуру получения реагента, при этом используют дорогостоящий импортный носитель, а в качестве одного из дополнительных стабилизаторов используют высокие концентрации трегалозы.

Задачей настоящего изобретения является повышение активности реагента для определения АТФ, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ, снижение расхода фермента для получения реагента, упрощение процедуры приготовления реагента, а также использование более доступных и эффективных дополнительных стабилизаторов.

Для решения поставленной задачи предлагаются реагенты для определения АТФ, включающие 0,001-0,01 мас.% растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис-(оксиметил)-аминометана, 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминтетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, воду, а также дополнительный стабилизатор в количестве, эффективном для стабилизации композиции, в качестве которого используют или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%.

Преимуществом предлагаемых реагентов является снижение расхода фермента при приготовлении, повышение активности, упрощение процедуры получения реагентов, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ и использование в качестве дополнительных стабилизаторов более доступных по сравнению с трегалозой веществ.

Получение плазмид, штаммов E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы, наращивание биомассы клеток, выделение и очистку люциферазы проводят по методу, описанному в прототипе. Реагенты получают добавлением к концентрированному раствору люциферазы, содержащему 20-100 Е/мл активного фермента, определенного объема трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего люциферин, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и воду, и в качестве дополнительного стабилизатора - или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%. После тщательного перемешивания раствор в стерильных условиях фильтруют через бактериальный фильтр, разливают во флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5-5 Е/мл.

Изобретение поясняется следующими примерами, которые имеют иллюстративный, но не ограничительный характер.

Пример 1. Приготовление реагента для определения АТФ на основе растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы святляков

а. К 1 мл раствора люциферазы, полученной, как описано в прототипе, с активностью 20 Е/мл в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, добавляют 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 0,002 мг/мл полибрен, тщательно перемешивают, фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 1,0 мл, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон с лиофилизованным реагентом добавляют 1,0 мл деионизованной стерильной воды. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая0,001Люциферин0,014Сульфат магния0,5Трис(оксиметил аминометан)4,8Уксусная кислота0,2Этилендиаминтетраацетат натрия0,15Дитиотреитол0,04Бычий сывороточный альбумин1,0Полибрен0,0002ВодаОстальное

б. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл полибрен. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая0,001Люциферин0,028Сульфат магния0,75Трис(оксиметил аминометан)4,8Уксусная кислота0,2Этилендиаминтетраацетат натрия0,22Дитиотреитол0,04Бычий сывороточный альбумин5,0Полибрен0,02ВодаОстальное

в. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 1 мл раствора люциферазы с активностью 100 Е/мл и 19 мл 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Люцифераза растворимая0,01Люциферин0,014Сульфат магния0,5Трис-(оксиметил аминометан)2,4Уксусная кислота0,1Этилендиаминтетраацетат натрия0,15Дитиотреитол0,08Бычий сывороточный альбумин1,0N-Фталил-хитозан0,02ВодаОстальное

г. Все операции проводят, как описано в примере 1в, но для приготовления реагента используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 1 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая0,01Люциферин0,028Сульфат магния0,75Трис(оксиметиламинометан)4,8Уксусная кислота0,2Этилендиаминтетраацетат натрия0,22Дитиотреитол0,08Бычий сывороточный альбумин5,0N-Фталил-хитозан0,1ВодаОстальное

д. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 5 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая0,001Люциферин0,014Сульфат магния0,5Трис(оксиметиламинометан)2,4Уксусная кислота0,1Этилендиаминтетраацетат натрия0,15Дитиотреитол0,04Бычий сывороточный альбумин1,0Поливинилпирролидон0,5ВодаОстальное

е. Все операции проводят, как описано в примере 1д, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 10 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая0,001Люциферин0,014Сульфат магния0,5Трис(оксиметиламинометан)2,4Уксусная кислота0,1Этилендиаминтетраацетат натрия0,15Дитиотреитол0,04Бычий сывороточный альбумин5,0Поливинилпирролидон1,0ВодаОстальное

ж. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют люциферазу с активностью 50 Е/мл и 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 100 мг/мл сахарозу и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:

Люцифераза растворимая0,005Люциферин0,014Сульфат магния0,5Трис(оксиметиламинометан)4,8Уксусная кислота0,2Этилендиаминтетраацетат натрия0,15Дитиотреитол0,04Бычий сывороточный альбумин1,0Сахароза10,0ВодаОстальное

з. Все операции проводят, как описано в примере 1ж, но используют буферный раствор, содержащий 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 200 мг/мл сахарозы. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:

Люцифераза растворимая0,005Люциферин0,014Сульфат магния0,5Трис(оксиметиламинометан)4,8Уксусная кислота0,2Этилендиаминтетраацетат натрия0,15Дитиотреитол0,04Бычий сывороточный альбумин5,0Сахароза20,0ВодаОстальное

Пример 2. Методика измерения концентрации АТФ

0,05 мл реагента, полученного, как описано в примере 1, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен 0. Добавляют 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции. Операцию повторяют не менее двух раз. Измерения повторяют для растворов АТФ различной концентрации. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру 1, показаны в таблице 1. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10^-13 до 10^-8 М. По полученным данным строят градуировочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше, используя градуировочный график. При работе с концентрациями АТФ от 10^-11 Ми выше предпочтительнее использовать реагент, описанный в примерах 1д-1з, с концентрациями АТФ от 10^-12 М и выше - реагент, описанный в примерах 1в и 1 г, а с концентрациями АТФ от 10^-13 М и выше - реагент, описанный в примерах 1а и 1б.

Пример 3. Испытание стабильности реагента

Раствор реагента, приготовленного, как описано в примере 1, инкубируют при 20°С и через определенные интервалы времени отбирают пробу и определяют интенсивность биолюминесценции, как описано в примере 2, для раствора АТФ с фиксированной концентрацией. Из данных зависимости интенсивности биолюминесценции от длительности инкубации определяют полупериод инактивации реагента в растворе. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 1Результаты измерения концентрации АТФ с использованием реагента, полученного по примерам 1а-1зКонцент-
рация АТФ в кювете, МИнтенсивность биолюминесценции, усл.ед.Реагент по примеру 1аРеагент по примеру 1бРеагент по примеру 1вРеагент по примеру 1 гРеагент по примеру 1дРеагент по примеру 1eРеагент по примеру 1жРеагент по примеру 1зАктивность люциферазы, Е/мл →0,50,55,05,00,50,51,251,251×10^-858006615109861166224052544489050605×10^-9356035704956615612651538235024211×10^-913731374129011902694014684555×10^-1089411005596591161322562601×10^-10370412140127293041425×10^-112802404849151622251×10^-11125137191845565×10^-128590661122,11×10^-12405122    1×10^-12910      

Таблица 2Испытание стабильности реагентаРеагент по способуПолупериод инактивации, дниПрототип2,0Реагент, предлагаемый по примерам: 1а-1б3,21в-1г2,51д-1е2,21ж-1з3,0

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине, экологии, фармацевтике и пищевой промышленности. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата представляет собой водный раствор люциферазы светляков, содержащий люциферин, сульфат магния, трис(оксиметиламинометан), уксусную кислоту, этилендиаминотетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и стабилизатор, выбранный из группы, включающей полибрен, поливинилпирролидон, N-фталилхитозан и сахарозу. Применение изобретения позволяет повысить точность и воспроизводимость определения АТФ. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,0002-0,02% полибрена и воду.2. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,5-1,00 мас.% поливинилпирролидона и воду.3. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,02-0,1 мас.% N-фталилхитозана и воду.4. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 10-20 мас.% сахарозы и воду.5. Реагент по пп.1-4, отличающийся тем, что в качестве люциферазы используют люциферазу, выделенную из клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков.