Способ получения иммобилизованной люциферазы светляков Советский патент 1987 года по МПК C12N11/12 C12N11/14 

13

Изобретение относится к биотехнологин, а именно к способу получения иммобилизованной люциферазы светляков.

Цель изобретения - повышение удельной активности и стабильности препарата.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве носителей для иммобилизации используют гидрофильные носители, которые хорошо адсорбируют ли- пиды (фосфо- или нейтральные липи- ды); а именно мембраны на основе производных целлюлозы: ацетил-, нит- ро- или тринитроцеллюлозу; или кремнеземные носители, например силика- гель, силохром. Иммобилизацию люциферазы осуществляют путем физической адсорбции фермента из буферного раствора на носителе, предварительно обработанном липидом. В качестве ли- пидов могут быть использованы разнообразные липиды: фосфолипиды или нейтральные липиды, например лецитин, сфингомиелин, холестерин, стеариновая кислота, а также,сложные смеси природных липидов, например смесь выделенную экстракцией из лампочек светляков, которая кроме вьшеназван- ных липидов включает монофосфатиди-i линозит,, лизофосфатидилхолин, фосфа- тидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидную кислоту, высшие жирные кислоты, их триглицериды и эфиры жирных кислот и стеринов. Носители, предварительно не обработанные липидом, плохо адсорбируют люциферазу и при промывке фермент легко отделяется от носителя. После обработки носителя раствором липида носитель приобретает способность прочно адсорбировать большие коЛи- чества люциферазы. Для такой обработки носителя навеску его погружают в раствор липида так, чтобы носитель был полностью покрыт жидкостью. Концентрация липида в используемом растворе составляет 1 - 15%. Использование более разбавленных растворов липидов не позволяет получать иммобилизованную люциферазу с высокой удельной активностью. Использование более концентрированных растворов липида экономически неоправдано, так как это не влияет на активность получаемого иммобилизованного фермента. Инкубирование носителя в растворе липида в течение 0,2-1 ч оказывается

189

достаточным для завершения процесса адсорбции липида на носителе. При более коротком времени обработки процесс адсорбции не доходит до равновесия, особенно при использовании разбавленных растворов липида, а более длительная инкубация не приводит к дополнительному положительному

эффекту. После инкубации носителя в растворе липида отделяют Носитель от раствора любым известным методом и высушивают в токе воздуха или другого газа при комнатной температуре.

5 Отработанный раствор липида используют для обработки новой партии носителя. Это приводит к экономии липида.

Затем липидизиройанный носитель полностью погружают в раствор ферQ мента, охлажденный до , и инкубируют при осторожном перемешивании 20 ч. Активность люциферазы в растворе составляет (0,2 - 20)10 мВ/мл. При использовании растворов с меньшей

5 активностью люциферазы получают препарат с низкой удельной активностью, а использование растворов с активностью люциферазы выше чем 20 «10 мВ/мл не приводит к дальнейше0 увеличению активности препарата. Раствор фермента должен обладать ионной силой 0,3 - 0,8 моль. При использовании концентраций соли ниже 0,3 моль наблюдается ухудшение ад-, сорбции, снижение стабильности люци 5 феразы, а увеличение концентрации вьшге 0,8 моль приводит к кристаллизации соли при пониженной температуре . Предпочтительным является использование 0,1 М трис-ацетатного буфера, содержащего в качестве стабилизирующих добавок 15-25% глицерина и 0,8 - 1,2 мг/мл дитиотрейтола. Но положительный эффект достигается и при использовании О,1 М фосфатного буфера 5 без стабилизирующих добавок.

После инкубирования носителя в ра- створе фермента носитель отделяют от раствора и промывают небольшими пор-

50 циями буферного раствора того же состава, .что используют для приготовления раствора фермента. Отработанный раствор фермента используют для обработки новой партии носителя.

55 Получают препараты иммобилизованной люциферазы с удельной активностью (25-70)40 мВ/мг носителя, что в 10 раз вьпле, чем в прототипе. Для мембран, содержащих иммобилизованную лю40

3

циферазу, активность в расчете на 1 см составляет 100 - 300 тыс мВ. В процессе иммобилизации не происходит химической модификации фермента, которая является одной из причин уменьшения активности люциферазы при кова лентном связывании. Иммобилизация .происходит за счет физической адсорбции люциферазы на липидизированном носителе, и иммобилизованная люцифе- раза сохраняет около 100% активности от исходной.

Получаемые препараты без лиофили- зации сохраняют высокую активность в течение 10-20 дней при хранении их при 4°С, в то время как препараты люциферазы, иммобилизованной на сефа- розе, в тех же условиях за 20 дней теряет 50% активности.

Люцифераза, иммобилизованная на липидизированных мембранах, имеет в 10-50 раз более высокую активность и стабильность, чем люцифераза, иммобилизованная ковалентно на целлю- лозных пленках. Поэтому люцифераза, иммобилизованная на липидизированных мембранах, хорошо пригодна для аналитического определения микроколичеств АТФ, причем одну и ту же пленку ис- пользуют многократно. Полученную описанным способом иммобилизованную лю- циферазу используют для определения АТФ. Предел обнаружения АТФ составляет 10- М.

Изобретение поясняется следующи- ми примерами.

Пример 1. Нитроцеллюлозную мембрану площадью 1,5 см погружают в 1%-ный раствор лецитина-в спирте и инкубируют смесь в течение 0,2 ч, затем мембрану извлекают из раствора высушивают в токе воздуха в течение 15 мин и погружают в раствор люциферазы с активностью О,210 мВ/мл,Раствор люциферазы готовят в 0,1 М трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8,содержащем 0,3 моль КС1, 15% глицерина, 0,8 мг/мл дитиотреитола. Смесь инкубируют 20 ч при 4 С, Затем мембрану извлекают из раствора фер- мента и промывают тремя порциями по 1 мл вышеуказанного охлажденного буферного раство ра, а затем 2 порциями 0,1 М трис ацетатного буферного раствора, рН 7,8. Для измерения ак- тивности иммобилизованной люциферазы полученную мембрану- помещают в кювету для измерения люминесценции, куда предварительно добавляют 1,1 мл

Ъ

-

- „п

25 п 35

40 , 45 50 55

189

О,1 М трис-ацетатного буферного раствора, 0,1 мл 0,1 М MgSO и 0,15 МЛ| 0,01 мМ раствора ТАФ в том же буферном растворе. Кювету с мембраной и раствором субстратов помещают в измерительное отделение люминометра, измеряют фоновое свечение, затем добавляют 0,15 мл 1 мМ раствора люцифери- на в том же буферном растворе. Удельная активность полученной иммобилизованной люциферазы составляет 20 10з мВ/мг носителя Или 80-Ю мВ/см мембраны при насыщающих концентрациях субстратов. Отработанные растворы липида и фермента используют многократно для обработки новых образцов мембран вплоть до полного расходования растворов липида и фермента. Мембрану с иммобилизованной на ней люциферазой хранят в 0,1 М трис-ацетатном буферном растворе, содержащем 0,3 моль КС1 и 0,8 МГ/МЛ дитиотреитола, рН 7,8 при 4 С в течение 10 дней, измеряя каждьй день активность люциферазы. Через 10 дней хранения мембрана сохраняет 70% от исходной активности .

И р и М е р 2. Нитроцеллюлозную мембрану площадью 1,5 см погружают в 10%-ный раствор лецитина в спирте, инкубируют смесь в течение 0,5 ч, затем мембрану извлекают из раствора, высушивают в токе воздуха в течение 15 мин и погружают в раствор люцифе- разы с активностью 10 10 мВ/мл. Раствор люциферазы готовят в О,1 М трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 0,6 моль КС1, 20% глицерина, 1 мг/мл дитиотреитола. Смесь инкубируют 20 ч при 4 С. Затем мембрану извлекают из раствора и промывают так, как описано в примере 1, используя буферный раствор указанного в примере 2 состава. Далее измеряют активность иммобилизованной люциферазы, как описано в примере 1. Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 70-10 мВ/мг или 300 -10 мВ/см мембраны. Все остальные операции выполняют,, как описано в примере 1, но для хранения используют буферный раствор, содержащий 0,6 моль КС1 и 1 мг/мл дитиотреитола. После 10 дней хранения мембрана сохраняет 90% от исходной активности.

Приме р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но носитель обрабатывают 15%-ным раствором лецитина в спирте в течение 1 ч и исполь10

15

20

51341189

уют раствор люциферазы с активностью 010 мВ/мл в О,1 М трис-ацетатном уферном растворе, рН 7,8, содержащем 0,8 моль.КС, 1,2 мг/мл дитиотреито- а и 25% глицерина. Получают препаат иммобилизованной люциферазы с ктивностью 50-10 мВ/мг или 200« хЮ мВ/см. Полученную мембрану хранят в О,1 М трис-ацетатном буферном астворе, содержащем 0,8 моль КС1 и 1,2 мг/мл дитиотреитола После 10 ней хранения мембрана сохраняет 90% исходной активности люциферазы.

Пример4. 50 мг силикагеля инкубируют в 0,5 мл 10%-ного раствора лецитина в спирте в течение 20 мин, носитель затем отделяют от-раствора на стеклянном фильтре и высушивают на воздухе в течение 15-20 мин. Затем носитель помещают в 0,5 мл раствора люциферазы с активностью 10 10 мВ/мл в О,1 М трис-ацетатном буферном растворе, рН 7., 8, который содержит 0,6 моль КС1, 20% глицерина, 1 мг/мл- дитиотреитола. Смесь инкубируют в течение 20 ч при . Затем раствор фермента, отделяют от носителя на стеклянном фильтре, и носитель промывают так, как описано в примере 2. Затем приготовляют суспензию иммобилизованной люциферазы, которая содер жит 2 мг носителя на 1 мл буферного раствора, состав которого указан в примере 1 при определении активности фермента. Активность иммобилизованной люциферазы определяют, как описано в примере 1, используя вместо мембра- ны с иммобилизованной люциферазой 0,1 мм суспензии носителя, со.держа- щего иммобилизованную люциферазу.Получают препарат иммоби.лизованной люциферазы с активностью 50 10 мВ/мг носителя. Отработанные растворы фермента и липида используют повторно для обработки новой партии носителя. До полного расходования взятых объемов растворов.

са ме зы ча ци но

т н

25

30 з

п

4Q н

и

g з

о о н 50 в . Ю сл

П р и М е р 5, Способ осуществляют согласно примеру 2, но для обработки носителя используют различнгле липиды или смесь липидов, вьщеленную из лампочек светляков. При этом получают препараты с удельной активностью, которая у.казана ниже:

ЛипидАктивность .мембраны, мВ/мг

Холестерин 20 10

Стеариновая

кислота30 - 10

Сфингомиел ш 25 10 Смесь липидов 50 - 10 П р и М е р 6. Выполняют, как описано в примере 2, однако используют мембраны на основе тринитроцеллюло- зы и ацетилцеллюлозы. При этом получают препараты иммобилизованной люциферазы с активностью и стабильностью, которые указаны в таблице.

70 103 70 103

90 90

Пример 7. Способ осуществляют согласно примеру 2, однако исполь30 зуют для иммобилизации люциферазу в 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 0,6 моль КС1,Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 25-102 мВ/мг носителя, или 100103 мВ/см мембраны, После 10 дней хранения при 4°С мемб- р ана сохраняет 80% активности.

Пример 8. Все операции.вы- полняют как описано в примере 4, од4Q нако вместо силикагеля испол ьзуют

50 мг силохрома. Получают препарат иммобилизованной люциферазы с актив- костью 30-10 мВ/мг носителя.

Пример 9, Препарат иммобили g зованной люциферааы, полученный, как

описано в примере 2, используют для определения ультрамалых концентраций АТФ. Измерения проводят, как описано в примере 1, но концентрацию АТФ 50 в измерительной кювете изменяют от . Ю до М. При этом получают следующие сигналы биолюминесценции: Концентрация АТФ в Сигнал биолюми- измеряемом раство- несценции, мВ

55 .,

. 10 , 2

10.4,25

,75

1341

Таким образом, при использовании полученных препаратов иммобилизованной люциферазы детектируют ультрамалые концентрации АТФ.

Пример 10. Способ осуществляют согласно примеру 2, После промывания мембраны ее используют для изме-; рения биолюминесценции при концентрации АТФ в измеряемом растворе 10 М.

10

Состав измеряемого раствора такой же, как указано в примере 1 для определения активности люциферазы. Показания для сигнала биолюминесценции следующие :

змерения, № 1 2 3 4 .5 6

7 . 10

13

16

Сигнал, мВ 50 48 46 42 49

. 45 39

42 43 46

Таким образом, мембрана с иммобилизованной люциферазой может быть использована многократно.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить активность препаратов иммобилизованной люциферазы по сравнению с известными способами в 10 раз, а стабильность - в 2 раза, сократить расход фермента за счет полного сохранения активности люциферазы после иммобилизации и за счет многократного использования мембраны с иммобилизованной люциферазой для определения микроколичеств

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 4400/30

Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

8

АТФ. Благодаря высокой активности препаратов иммобилизованной люциферазы, получаемой предлагаемым способом, предел обнаружения АТФ снижается до .

Формула изобретения

I 1. Способ получения иммобилизованной люциферазы светляков, предусматривающий инкубирование люциферазы в смеси с нерастворимым носителем в буферном растворе, отличающийся тем, что, с целью повьше- ния уйельной активности и стабильности препарата, инкубирование проводят в буферном растворе с ионной силой 0,3 - 0,8 моль, при этом используют гидрофильные носители, предваритель- но обработанные в течение 0,2 - 1,0ч раствором фосфолипида или нейтрального липида, или их смесью в концентрации 1 - 15%, а активность люциферазы в растворе составляет (0,2-10) 10 мВ/мл.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют кремнеземные носители или мембраны на основе нитро- тринитро- или ацетилцеллюлозы,

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что из липи- дов используют лецитин или сфингомиелин, или холестерин, или стеариновую кислоту, или смесь липидов, выделенную из лампочек светляков,

4.Способ по пп, 1 - 3, о т л и- чающийся тем, что используют 0,1 М трис-ацетатный буферный раствор рН 7,8 содержащий 0,3 0,8 моль КС1, 15-25% глицерина, 0,8- 1,.2 мг/мл дитиотрейтола.

Составитель Т. Мелентьева

Техред Л.Сердюкова Корректор С, Шекмар

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения иммобилизованной люциферазы светляков. Цель изобретения - повы- шение удельной активности и стабильности препарата. Инкубирование люциферазы в смеси с носителем ведут в буферном растворе с ионной силой от 0,3 до 0,8, при этом активность люциферазы в растворе составляет от 0,2-10® до 20-10 мВ/мл. Носитель предварительно обрабатывают в течение 0,2 - 1,0 ч лецитином или сфин- гомиелином, или холестерином, или стеариновой кислотой, или смесью ли- пидов, выделенной из лампочек светляков. Используют 0,1 М трис-ацетат- . ный буферный раствор с рН 7,8, содер- жащий 0,3-0,8 И КС1, 15-25% глицерина, 0,8-1,2 мг/мл дитиотрейтола. 3 з.п. ф-лы. 1 табл. i (Л со 4 оо со