РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИН-5'-ТРИФОСФАТА Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/66 C12N11/12 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5'- трифосфата (АТФ) на основе иммобилизованной люциферазы светляков.

Интенсивность биолюминесценции, возникающей в люциферинлюциферазной системе светляков в присутствии АТФ, пропорциональна концентрации АТФ в широком диапазоне его концентраций, поэтому эта система широко используется в аналитических целях для определения АТФ. Анализ АТФ необходим в медицинской диагностике, в контроле загрязнений окружающей среды. На его основе разработаны методы "быстрой микробиологии", например, определение микробной зараженности биологических жидкостей, смывов с технологического оборудования и других по количеству микробного АТФ [1].

В работе [2] , принятой за прототип, предложен реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, выделенную из светляков и иммобилизованую на полисахаридном носителе, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора и воду. В качестве полисахаридного носителя используют сефарозу, ультрадекс, ультрагель, активированные бромцианом, или целлюлозную пленку. Предел обнаружения АТФ с использованием реагента с приведенной композицией составляет 10^-13 М.

Недостатками прототипа являются наличие высокого фонового сигнала (биолюминесценции, наблюдаемой до добавления АТФ к реагенту), что снижает чувствительность анализа, и недостаточно высокая стабильность реагента при комнатной температуре, что создает неудобства при работе: необходимо специальное охлаждение и периодическая проверка калибровочного графика концентрации АТФ - интенсивность свечения.

Целью предлагаемого изобретения является снижение фонового сигнала, повышение чувствительности анализа и повышение стабильности реагента для определения АТФ, особенно при комнатной температуре.

Поставленная цель достигается тем, что реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора и воду, содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75% сульфатом аммония, и дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Люцифераза, выделенная из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков и очищенная осаждением 35-75% сульфатом аммония, иммобилизованная на полисахаридном носителе - 0,05-0,20
Люциферин - 0,014-0,056
Сульфат магния - 0,2-0,3
Трис-(оксиметил)-аминометан - 0,12-0,60
Уксусная кислота - 0,01-0,02
Этилендиаминтетраацетат натрия - 0,04-0,08
Дитиотреитол - 0,05-0,10
Бычий сывороточный альбумин - 0,05-0,20
Трегалоза - 5,0-20,0
Вода - Остальное
В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75% сульфатом аммония, и иммобилизованную на полисахаридном носителе. Клонирование гена люциферазы светляков, получение плазмид, содержащих ген люцифераз светляков, и штаммов клеток Е.coli, синтезирующих активную люциферазу светляков, проводят по известным методикам [3]. Для приготовления реагента наращивают биомассу клеток Е.coli трансформированных плазмидой, содержащей ген люциферазы светляков. Клетки разрушают известным способом и получают лизат клеток Е.coli, содержащий активную люциферазу светляков. Лизат очищают от примесей и концентрируют путем осаждения 35-75% сульфатом аммония. Осаждение сульфатом аммония проводят в две стадии; на первой стадии к лизату клеток Е.coli при перемешивании и охлаждении добавляют сухой сульфат аммония до 35% насыщения, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. К супернатанту при перемешивании и охлаждении добавляют сухой сульфат аммония до 75% насыщения, осадок, содержащий люциферазу светляков, отделяют центрифугированием, растворяют в буферном растворе для иммобилизации, и проводят иммобилизацию полученного препарата на полисахаридном носителе. При концентрации сульфата аммония до 35% насыщения происходит осаждение белков, содержащихся в лизате клеток Е.coli, а люцифераза светляков остается в растворе. При концентрации сульфата аммония от 35% до 75% насыщения люцифераза выпадает в осадок, и, таким образом, происходит концентрирование фермента и частичная очистка люциферазы от примесей как белков, так и низкомолекулярных веществ. Люцифераза светляков полностью выпадает в осадок при концентрации сульфата аммония до 75% насыщения, и дальнейшее повышение концентрации сульфата аммония не приводит к повышению выхода белка.

В случае прототипа иммобилизацию люциферазы проводят из экстракта светляков. Фоновый сигнал реагента обусловлен примесями АТФ, адсорбированными на носителе из экстракта светляков или лизата клеток Е.coli. Поскольку для иммобилизации рекомбинантных люцифераз используют лизат, предварительно очищенный и сконцентрированный путем осаждения сульфатом аммония, концентрация АТФ в растворе для иммобилизации значительно ниже, чем при использовании экстракта светляков, что и приводит к значительному снижению фонового свечения. Фоновый сигнал у предлагаемого реагента оказывается в 50-100 раз ниже, чем у прототипа непосредственно после приготовления, а через 3-4 час после приготовления практически равен 0.

Повышение чувствительности анализа АТФ с помощью предлагаемого реагента достигается за счет увеличения удельной активности препарата иммобилизованной люциферазы до (0,01-0,1) Е/мг носителя по сравнению с (3·10^-4-1·10^-3) Е/мг носителя у прототипа и увеличения соотношения (сигнал в присутствии АТФ)/(фоновый сигнал). Использование заявляемого реагента снижает предел обнаружения АТФ с 10^-13 М до 10^-14 М.

Увеличение удельной активности позволяет проводить анализ АТФ с меньшим количеством реагента, что приводит к экономии дорогостоящего препарата.

Повышение стабильности реагента осуществляется за счет добавления дополнительного стабилизатора - смеси бычьего сывороточного альбумина и трегалозы. Период полуинактивации заявляемого реагента при 4^oC составляет 80-90 суток (прототип - 40-50 суток) в водной суспензии и 300 суток в лиофилизованном состоянии. При комнатной температуре предлагаемый реагент может храниться без потери активности в течение 10 суток.

Реагент получают добавлением к концентрированной суспензии иммобилизованной люциферазы в трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буфере растворов люциферина, сульфата магния, ЭДТА, дитиотреитола в том же буфере, и сухого бычьего сывороточного альбумина и трегалозы по навеске.

Пример 1. Приготовление рекомбинантной люциферазы, иммобилизованной на полисахаридном носителе
а. Люциферазу получают из клеток Е.coli, штамм CA (1 л), содержащих плазмиду pGK2 с геном люциферазы светляков [3]. Клетки выращивают в среде Лурия-Бертани (LB) (бактотриптон, 10 г/л, дрожжевой экстракт, 5 г/л, NaCl, 10 г/л, pH 7,5), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, до A₅₉₀ = 5,0 и отделяют центрифугированием при 5000 g, 10 мин. Осадок суспендируют в 45 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 8,0, содержащего 2 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 1 мМ дитиотреитола, 8% сахарозы, 0,5 Тритона Х-100, добавляют 5 мл раствора лизоцима (20 мг/мл) в том же буфере, и инкубируют 1 час при 4^oC, по окончании лизиса добавляют 4 мл раствора протаминсульфата (25 мг/мл) в том же буфере и центрифугируют при 50000 g 20 мин для осаждения клеточных стенок и ДНК Е.coli. К надосадочному раствору при охлаждении и перемешивании постепенно прибавляют сухой сульфат аммония до 35% насыщения, и центрифугируют при 50000 g 20 мин. Осадок отбрасывают. К супернатанту при охлаждении и перемешивании постепенно прибавляют сухой сульфат аммония до 75% насыщения, и центрифугируют при 50000 g 20 мин. Осадок, содержащий люциферазу светляков, растворяют в 10 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 0,1 М NaCl, и используют для иммобилизации. Иммобилизацию проводят на полисахаридном носителе по известной методике [4]. Активность полученного препарата иммобилизованной люциферазы составляет 0,01 Е/мг носителя.

б. Люциферазу получают из клеток Е.coli, как описано в примере 1,a, но используют штамм Е.coli LE 392, содержащий плазмиду pJGR с геном люциферазы светляков [3]. В этом случае люцифераза, синтезируемая клетками Е.coli, содержит 11 дополнительных аминокислотных остатков со стороны N-конца: Met-Asn-Lys-Cys-Ile-Pro-Met-Ile-Ala-Ser-Lys-Met люциферазы светляков. Иммобилизацию проводят на полисахаридном носителе по известной методике [4]. Активность полученного препарата иммобилизованной люциферазы составляет 0,1 Е/мг носителя.

в. Люциферазу получают из клеток Е.coli, как описано в примере 1,a, но используют штамм Е.coli LE 392, содержащий плазмиду pLR с геном люциферазы светляков [5]. В этом случае структура люциферазы, синтезируемой клетками Е. coli, аналогична структуре природной люциферазы светляков, а количество рекомбинантной люциферазы в клетках Е.coli такое, как в клетках, содержащих плазмиду pJGR (пример 16). Иммобилизацию проводят на полисахаридном носителе по известной методике [4]. Активность полученного препарата иммобилизованной люциферазы составляет 0,1 Е/мг носителя.

Пример 2. Приготовление реагента для определения АТФ на основе рекомбинантной люциферазы, иммобилизованной на полисахаридном носителе
а. К 0,5 мл суспензии рекомбинантной люциферазы, полученной, как описано в примере 1,a, иммобилизованной ковалентно на ультрадексе по известному методу [4], с концентрацией 10 мг/мл и активностью 0,01 Е/мг носителя в 0,01 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, pH 7,8, содержащем 1 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 0,5 мг/мл дитиотреитола, добавляют 4,5 мл 1,1 мМ раствора люциферина и 5 мл 16 мМ раствора сульфата магния в том же буферном растворе. В полученную суспензию добавляют 5 мг бычьего сывороточного альбумина и 500 мг трегалозы. Получают реагент при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Люцифераза, выделенная из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков и очищенная осаждением 35-75% сульфатом аммония, иммобилизованная на полисахаридном носителе - 0,05
Люциферин - 0,014
Сульфат магния - 0,2
Трис-(оксиметил)-аминометан - 0,12
Уксусная кислота - 0,01
Этилендиаминтетраацетат натрия - 0,04
Дитиотреитол - 0,05
Бычий сывороточный альбумин - 0,05
Трегалоза - 5,0
Вода - Остальное
б. К 1 мл суспензии рекомбинантной люциферазы, полученной, как описано в примере 1,б, иммобилизованной ковалентно на ультрагеле, по известному методу [4] , с концентрацией 10 мг/мл и активностью 0,05 Е/мг носителя в 0,02 М трис-(оксиметил)- аминометанацетатном буферном растворе, pH 7,8, содержащем 1,5 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 0,7 мг/мл дитиотреитола, добавляют 4,0 мл 2,5 мМ раствора люциферина и 5 мл 20 мМ раствора сульфата магния в том же буферном растворе. В полученную суспензию добавляют 10 мг бычьего сывороточного альбумина и 1 г трегалозы. Получают реагент при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Люцифераза, выделенная из рекомбинантных клеток Е.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков и очищенная осаждением 35-75% сульфатом аммония, иммобилизованная на полисахаридном носителе - 0,1
Люциферин - 0,028
Сульфат магния - 0,25
Трис-(оксиметил)-аминометан - 0,25
Уксусная кислота - 0,015
Этилендиаминтетраацетат натрия - 0,06
Дитиотреитол - 0,07
Бычий сывороточный альбумин - 0,1
Трегалоза - 10,0
Вода - Остальное
в. К 2 мл суспензии рекомбинантной люциферазы, полученной, как описано в примере 1, в, иммобилизованной ковалентно на сефарозе, активированной бромцианом, по известному методу [4], с концентрацией 10 мг/мл и активностью 0,1 Е/мг носителя в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, pH 7,8, содержащем 2 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 1 мг/мл дитиотреитола, добавляют 3,0 мл 6,67 мМ раствора люциферина и 5 мл 24 мМ раствора сульфата магния в том же буферном растворе. В полученную суспензию добавляют 20 мг бычьего сывороточного альбумина и 2 г трегалозы. Получают реагент при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Люцифераза, выделенная из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков и очищенная осаждением 35-75% сульфатом аммония, иммобилизованная на полисахаридном носителе - 0,20
Люциферин - 0,056
Сульфат магния - 0,3
Трис-(оксиметил)-аминометан - 0,60
Уксусная кислота - 0,02
Этилендиаминтетраацетат натрия - 0,08
Дитиотреитол - 0,10
Бычий сывороточный альбумин - 0,20
Трегалоза - 20,0
Вода - Остальное
Пример 3. Методика определения АТФ
1,0 мл реагента, полученного, как описано в примерах 1 и 2, вводят в цилиндрическую кювету объемом 3 мл и диаметром 1 см. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал. Затем вводят 10 мкл раствора АТФ с известной концентрацией, не прерывая регистрации интенсивности свечения. Разность между величиной сигнала интенсивности биолюминесценции в присутствии и в отсутствие АТФ является величиной, пропорциональной концентрации АТФ. Процедуру повторяют для растворов АТФ в том же диапазоне концентраций, в котором предполагается проводить измерения. Результаты измерений с использованием реагента, полученного по примеру 2в, показаны в табл. 1; на их основании строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10^-14 до 10^-5 М. При работе с концентрациями АТФ от 10^-11М до 10^-5 М предпочтительнее использовать реагент, описанный в примере 2а или 2б, с концентрациями АТФ от 10^-14 М до 10^-11 М - реагент, описанный в примере 2в. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, возникающей при добавлении 10 мкл раствора АТФ неизвестной концентрации к 1 мл реагента, используя калибровочный график, описанный выше. Предел обнаружения АТФ с использованием указанного реагента составляет 10^-14 М.

Пример 4. Испытания активности реагента
Результаты испытания измерения активности реагента и фонового сигнала в отсутствии АТФ приведены в табл. 2. Удельная активность предлагаемого реагента по крайней мере в 100 раз выше, чем у прототипа, а фоновый сигнал практически отсутствует.

Пример 5. Испытание стабильности реагента
В табл. 3 указаны значения периода полуинактивации предлагаемого реагента в водной суспензии и в лиофилизованном состоянии. Для сравнения приведены аналогичные показатели для реагента-прототипа. Эти данные показывают, что стабильность предлагаемого реагента как в водной суспензии, так и в лиофилизованном состоянии по крайней мере в два раза превышает стабильность реагента-прототипа.

Литература
1. Н.Н. Угарова, Л.Ю. Бровко, Г.Д. Кутузова. - Биохимия, 1993, т. 58, N 9, с. 1351-1372.

2. Н.Н. Угарова, Л.Ю. Бровко, Е.И. Беляева, И.В. Березин. - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата. Патент РФ N 1041568, МКИ C 12 Q 1/66, 29.06.93.

3. Г. Д. Кутузова, Е.И. Дементьева, Т.О. Болдвин, Н.Н. Угарова. - Биотехнология, 1992, N 5, с. 43-51.

4. И. В. Березин, Н.Н. Угарова, Л.Ю. Бровко. - Способ получения иммобилизованной люциферазы светляков. Авторское свидетельство СССР N 660378, МКИ C 12 N 9/02, 1977.

5. I.A. Lundovskikh, Е.I. Dementieva, N.N. Ugarova. - Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 1998, v. 13, p. 217.

Изобретение относится к области биохимии. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата включает люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E. coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35 - 75%-ным сульфатом аммония, иммобилизованную на полисахаридном носителе, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду. При определении аденозин-5'-трифосфата реагент обеспечивает повышение чувствительности определения (минимальная определяемая концентрация АТФ 10^-14 М), значительное уменьшение фонового сигнала. Реагент обладает стабильностью при хранении как в водной суспензии, так и в лиофилизованном состоянии. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора и воду, отличающийся тем, что, с целью снижения фонового сигнала, повышения чувствительности анализа и стабильности реагента, он содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35 - 75%-ным сульфатом аммония, и дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Люцифераза, выделенная из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков и очищенная осаждением 35 - 75%-ным сульфатом аммония, иммобилизованная на полисахаридном носителе - 0,05 - 0,20
Люциферин - 0,014 - 0,056
Сульфат магния - 0,2 - 0,3
Трис-(оксиметил)-аминометан - 0,12 - 0,60
Уксусная кислота - 0,01 - 0,02
Этилендиаминтетраацетат натрия - 0,04 - 0,08
Дитиотреитол - 0,05 - 0,10
Бычий сывороточный альбумин - 0,05 - 0,20
Трегалоза - 5,0 - 20,0
Вода - Остальное
2. Реагент по п.1, отличающийся тем, что он содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, и очищенную осаждением 35 - 75%-ным сульфатом аммония, иммобилизованную на полисахаридном носителе, активированном бромцианом, с удельной активностью (0,01 - 0,1) Е/мг носителя.