Способ получения люциферазы светляков LUcIoLa мINGRеLIса Советский патент 1990 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люциферазы светляков Luciola mirtgrelica.

Цель изобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активности люциферазы и концентрации белка.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является проведение после ионообменной хроматографии аффинной хроматографии на полисахарид- ном носителе, модифицированном голубым- триазиновым красителем, при соотношении белок:носитель 1:30-500, проведение элюирования люциферазы буферным раствором, содержащим 1-15 ммоль АТФ или 1-5 ммоль люциферина.

Пример 1. 2,5г сухих лампо- чек светляков растирают в порошок в охлажденной ступке в смеси с 2,5 г карборунда и экстрагируют 25 мл 0,05 М трис-ацетатного буфера. рИ 7,8, содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,3 М NaCl, в течение 4 ч при Ц9С. Центрифугируют 30 мин (20000 об/мин, , осадок отбрасывают. Полученный экстракт наносят на колонку с сефадек- сом G-25 (грубым), уравновешенным 0,05 М трис-ацетатным буфером, рН 7,8, содержащим 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgS04. Элюируют люциферазу тем же буфером. Фракции, содержащие активную люциферазу, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенной тем же буфером. Затем колонку промывают

сл

о

Јъ

тем же буфером для удаления с носителя несвяэавшихся веществ. Люцифера- зу элюируют тем же буфером, но содержащим 60 мМ MgSO.. Во фракциях, содер-, жащих люциферазу, спектрофотометричес- ким методом определяют концентрацию белка, и полученные фракции наносят на колонку с голубой агарозой в соот- |Ношении белок:носитель 1:30. Несвязэв-jg шиеся белки смывают 0,05 М трис-аце- татным буфером, рН 7,В содержащим 2 мМ ЭДТА, 60 мМ MgS04. Элюцию люци- феразы проводят тем же буфером, содержащим 15 мК АТФ. Получают раствор лю- $ циферазы с концентрацией белка 0,05 мг/мл и удельной активностью 2-109 мВ/мг. Выход по активности составляет 100% от исходной.

Раствор люцифёразы после аффинной JQ хроматографии на голубой агарозе концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией на фильтре Amicon с использованием мембраны УМ-30. При концентрировании сохраняется 100% активности. Получают 25 раствор люцифёразы с концентрацией белка 0,5 мг/мл. При диск-электрофорезе в полнакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат дает одну полосу, что свидетельствует Q о его гомогенности.

Остальные примеры проводят аналогично примеру 1 с изменением носителя, соотношения белок;носитель и концентрации АТФ или люциферина.

Результаты хроматографии люцифера- зы на голубой агарозе и голубой сефа- роае при различных соотношениях белок: носитель и различных концентрациях приведены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ получения люцифёразы обеспечивает получение препарата гомогенной люцифёразы в концентрированном виде с удельной активностью 2-Ю9 мВ/мг. Высокая активность и гомогенность препарата делает возможным его использование в биохимии, медицинском микроанализе для определения ультрамалых количеств АТФ, в генной инженерии.

Формула изобретения

1.Способ получения люцифёразы светляков Luciola mingrelica, включающий получение экстракта светляков, очистку его от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией или высаливанием сульфатом аммония и фракционирование с помощью анионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью обеспечения гомогенности и повышения удельной активности люцифёразы, после анионообменной хроматографии проводят аффинную хроматографию на полисахаридном носителе, модифицированном 1-амино- - ((-хлор-6( (З-сульфофенил)амино) - -1,3, 5 триазин-2-ил) ами но) -3 сульфо- фенил)амино)-9,Ю-дигидро-9 10-диок- со-2-антраценсульфоновой кислотой при соотношении белок:носитель 1:30-500

и элюцию ведут буферным раствором, содержащим 1-15 ммоль аденозин-5 -три фосфата или 1-5 ммоль люциферина.

2.Способ поп.1, отличаю- щ и и с я тем, что, с целью повышения концентрации белка, полученный препарат подвергают ультрафильтрации.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люциферазы светляков LUcIoLa мINGRеLIса, и может быть использовано в медицинском микроанализе, генной инженерии. Цель изобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активности люциферазы и концентрации белка. Способ включает получение экстракта светлячков, гель-фильтрацию экстракта или высаливания сульфатом аммония, анионообменную хроматографию, аффинную хроматографию на полисахаридном носителе, модифицированном 1-амино-4((4-хлор-6 ((3-сульфофенил)амино)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-3-сульфофенил)амино)-9,10-дигидро-9,10-диоксо-2-антраценсульфоновой кислотой (голубой триазиновый краситель). Получают гомогенный препарат люциферазы с удельной активностью 2^.10⁹ мВ/мг. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

5 5

5 0,5

1

15 20