СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЖИДКОГО ОБРАЗЦА Российский патент 1996 года по МПК C12Q1/66 

Изобретение относится к санитарии и медицине и может быть использовано при определении общей микробной обсемененности или содержания coli-форм в пищевых продуктах, биологических жидкостях, смывах с технологического оборудования с помощью биолюминесценции.

В настоящее время для контроля микробной чистоты продукции в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, а также в медицине перспективным является использование методов "быстрой" микробиологии. Одним из таких методов является биолюминесцентный метод определения микробной обсемененности анализируемого образца по количеству внутриклеточного микробного АТФ, отличающийся от традиционного метода подсчета колоний на чашках экспрессностью, простотой исполнения, высокой воспроизводимостью. Метод определения внутриклеточного АТФ основан на способности фермента светляковой люциферазы [1] катализировать реакцию окисления D-люциферина в присутствии соли магния, О₂ и АТФ до оксилюциферина с выделением кванта света. Интенсивность свечения при фиксированном содержании D-люциферина и соли магния в реакционной смеси пропорциональна содержанию АТФ в анализируемом образце, т.е. зависит от содержания в нем жизнеспособных клеток микроорганизмов [2]
В работе [3] принятой за аналог, предложен биолюминесцентный способ количественного определения микроорганизмов в жидких образцах (воде, молоке, крови, моче). Согласно данному способу к образцу, исходно содержащему 1000-5000 кл/мл, добавляют смесь 0,1% Тритона Х-100 и апиразы картофеля (0,01-0,1 ед/мл) и выдерживают 5-20 мин, после чего в ту же кювету вносят NRB-реагент (0,05-2% водный раствор смеси этоксилированных аминов и их четвертичных аммониевых солей), или водный раствор кислоты, или водный раствор основания от 1 до 10 объемов.

В полученном растворе определяют концентрацию микробного АТФ при помощи биолюминесцентного реагента на основе растворимой люциферазы светляков. Если исходное содержание микробных клеток в образце на уровне 1-100 кл/мл, к образцу добавляют 1-2 объема питательной среды и инкубируют 0,2-16 ч или 0,5-15 сут (при определении специфической микрофлоры). Для сокращения времени инкубирования до 4-6 ч образец предварительно концентрируют путем фильтрования под вакуумом через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2-0,5 мкм, после чего наносят на фильтр питательную среду. Полученную суспензию микроорганизмов обрабатывают по указанной выше схеме. Исходное количество микробных клеток в образце определяют по измеренной концентрации АТФ и времени инкубирования с учетом фактора мультиплетности.

К недостаткам способа, описанного в работе [3] относятся:
использование водных растворов кислот, оснований или NRB-реагента, также являющегося смесью разбавленных водных растворов этоксилированных аминов и их четвертичных аммониевых солей;
применение фермента для деградации немикробного АТФ, апиразы из картофеля;
длительность инкубирования в питательной среде образца, исходно содержащего 1-100 кл/мл, после его концентрирования на мембранном фильтре;
фильтрование образца под вакуумом при концентрировании микробных клеток на мембранном фильтре;
использование биолюминесцентного реагента на основе растворимой люциферазы.

В работе [4] принятой за прототип, предложен способ количественного определения микроорганизмов в тканях при диагностике гнойных и раневых инфекций. Для определения концентрации микроорганизмов, согласно данному способу, образец исследуемой ткани гомогенизируют в физиологическом растворе и полученный гомогенат, содержащий исходно 10³-10⁵ кл/мл, инкубируют в воздушном термостате при 37^оС в течение 5 ч. Гомогенат обрабатывают смесью растворов Тритона Х-100 в концентрации 0,05-0,08% и периодата натрия в концентрации 1-5 мМ, выдерживают 1-3 мин, затем добавляют диметилсульфоксид при объемном соотношении 1: (4-9). Далее в полученном растворе определяют концентрацию АТФ при помощи биолюминесцентного реагента на основе иммобилизованной люциферазы светляков. По величине интенсивности биолюминесценции судят о количестве микроорганизмов в образце.

Способ, описанный в работе [4] имеет ограниченную область применения только для образцов инфицированных тканей с высокой исходной обсемененностью 10³-10⁵ кл/мл. Его нельзя использовать для определения микроорганизмов в образце при содержании 1-100 кл/мл, а также в жидких образцах.

Предлагаемый биолюминесцентный способ количественного определения микробной обсемененности в биологических жидкостях, продуктах, смывах с технологического оборудования заключается в том, что к образцу, содержащему не менее 10000 кл/мл, для удаления немикробного и растворенного АТФ добавляют 1-5 мМ раствор периодата натрия в 0,05-0,08% Тритоне Х-100 и выдерживают 1-3 мин. Далее в полученную смесь вносят 50-100 мМ раствора глюкозы и инкубируют 5-20 мин. Аликвоту смеси затем переносят в диметилсульфоксид (ДМСО) при объемном соотношении смесь:ДМСО 1:(4-9) и в полученном растворе определяют концентрацию микробного АТФ биолюминесцентным методом.

Если исходный образец содержит менее 10000 кл/мл микроорганизмов, образец предварительно инкубируют в общей или селективной (при определении coli-форм) питательной среде в течение 3-6 ч, после чего микробные клетки концентрируют путем фильтрования образца под избыточным давлением через мембранный фильтр, а глюкозу наносят на фильтр и выдерживают его в течение 5-20 мин.

Эту операцию лучше проводить путем медленного прокачивания через мембранный фильтр 5-10 мл физраствора, содержащего 1-5 мМ периодата натрия и 0,05-0,08% Тритон Х-100, а затем 5-10 мл физраствора. На фильтр наслаивают 0,05-0,1 мл 50-100 мМ глюкозы, инкубируют 5-20 мин при 37^оС, а затем на фильтр наносят 0,4-0,9 мл диметилсульфоксида. Полученный раствор микробного АТФ используют для биолюминесцентного определения его концентрации по методу внутреннего стандарта. Регистрируемый параметр максимум интенсивности свечения.

В качестве биолюминесцентного реагента используют реагент на основе иммобилизованной люциферазы светляков, содержащий D-люциферин, соль магния, стабилизаторы, компоненты буферного раствора при объемном соотношении раствор: реагент 1:9. Определение исходного содержания микроорганизмов в образце проводят при помощи калибровочной таблицы в зависимости от времени инкубирования образца и измеренной концентрации микробного АТФ.

Отличительными признаками предлагаемого изобретения являются введение глюкозы в раствор после разрушения немикробного АТФ, а также предварительное инкубирование образца, если исходное количество микробных клеток менее 10000 кл/мл. Добавление глюкозы, с одной стороны, останавливает процесс разрушения АТФ под действием периодата натрия, с другой стороны, приводит к повышению содержания внутриклеточного АТФ в 1,5-2 раза и тем самым увеличивает чувствительность биолюминесцентного метода.

Другим отличительным признаком предлагаемого изобретения является проведение инкубирования образца, если содержание клеток менее 10000 в 1 мл, в питательной среде перед его фильтрованием, а также фильтрование через мембранный фильтр под избыточным давлением. Такая последовательность обработки образца позволяет сократить время инкубирования до 4-6 ч, а фильтрование под избыточным давлением оказывает менее травмирующее воздействие на микробные клетки по сравнению с вышеописанным методом фильтрования под вакуумом.

Ожидаемый эффект от предлагаемого способа повышение точности, надежности определения микробного АТФ и сокращение времени анализа в случае малого исходного содержания микробных клеток в образце.

П р и м е р 1. Получение калибровочной таблицы для определения количества клеток по уровню внутриклеточного АТФ без инкубирования и фильтрования образца.

Готовят суспензию клеток Е. coli различной концентрации от 10⁴ до 10⁹ кл/мл. Из каждой пробы в отдельные пробирки отбирают по 0,1 мл, куда вносят по 0,01 мл раствора 10 мМ периодата натрия в 0,5%-ном Тритоне Х-100, перемешивают на магнитной мешалке, через 1 мин добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора глюкозы, инкубируют 5 мин при 37^оС, затем добавляют 0,8 мл ДМСО. Полученный экстракт используют для определения концентрации АТФ. Для этого в прозрачную пробирку объемом 2 мл помещают 0,9 мл АТФ-реагента "Иммолюм". Регистрируют фоновое свечение (I_фон), добавляют 0,1 мл экстракта и регистрируют свечение образца (I_обр. ). В ту же пробирку вводят 0,01 мл раствора АТФ-стандарта и регистрируют приращение интенсивности свечения (I_ст).

Концентрацию АТФ в образце рассчитывают по формуле
[АТФ]_обр= • [АТФ]_ст
где [АТФ]_ст концентрация АТФ-стандарта.

В табл. 1 представлена зависимость содержания АТФ в исходном образце от количества клеток.

Табл.1 можно использовать для определения числа клеток в исследуемом образце, если их количество не ниже 10000 кл/мл.

П р и м е р 2. Определение количества клеток в сыром молоке без предварительного фильтрования и инкубирования образца.

К 0,1 мл сырого молока добавляют 0,05 мл раствора 3 мМ периодата натрия в 0,15% -ном Тритоне Х-100 (что при разбавлении дает концентрацию 1 мМ периодата натрия и Тритона 0,05%). Перемешивают, через 1 мин добавляют 0,05 мл 0,2 М раствора глюкозы и инкубируют 20 мин при 37^оС. Затем добавляют 0,8 мл ДМСО. АТФ в экстракте измеряют, как описано в примере 1. Количество клеток определяют по табл.1. Параллельно количество клеток в сыром молоке определяют методом подсчета колоний. Полученные данные представлены в табл.2.

П р и м е р 3. Определение количества микробных клеток в мороженом с предварительным инкубированием образца.

К 1 г образца (мороженое) добавляют 9 мл питательной среды, помещают на качалку и инкубируют при 37^оС, отбирают пробы объемом 1 мл через 4 и 6 ч инкубирования. К 1 мл пробы добавляют 0,01 мл 0,1 М периодата натрия в 5%-ном Тритоне Х-100, выдерживают при комнатной температуре 1 мин. Из полученной смеси отбирают 0,1 мл и добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора глюкозы и инкубируют 10 мин при 37^оС. Затем туда же вносят 0,8 мл ДМСО. Полученный экстракт используют для определения концентрации АТФ, как описано в примере 1. Полученные данные приведены в табл.3.

П р и м е р 4. Определение количества микробных клеток в крови с предварительным инкубированием образца.

К 0,1 мл крови добавляют 2,4 мл стерильной дистиллированной воды, выдерживают 30 мин, добавляют 2,5 мл питательной среды и инкубируют при 37^оС. Отбор проб, их обработку и измерение АТФ ведут, как в примере 3.

В табл. 4 приведена зависимость концентрации АТФ от содержания микроорганизмов в исходном образце крови.

П р и м е р 5. Определение количества клеток coli-форм в суспензии различных микроорганизмов с предварительным инкубированием образца в специфической питательной среде и фильтрованием.

Готовят суспензии микроорганизмов E.coli с концентрациями 10, 100 и 1000 кл/мл и Bacillus subtilis с концентрацией 100 тыс. кл/мл. К 0,1 мл смеси суспензий добавляют 9,9 мл селективной среды для coli-форм, инкубируют при 37^оС 4 или 6 ч, фильтруют через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при помощи шприца и фильтровальной ячейки (Millipore). Клетки на фильтре промывают 1 мл физраствора, содержащего 1 мМ периодата натрия и 0,05% Тритон Х-100, затем 5 мл физраствора. Фильтр из фильтровальной ячейки переносят в стеклянный бюкс, наслаивают на фильтр 0,1 мл 50 мМ раствора глюкозы, инкубируют в термостате при 37^оС 15 мин. Затем наносят на фильтр 0,4 мл ДМСО и определяют концентрацию АТФ в экстракте, как описано в примере 1. В табл.5 приведена зависимость концентрации АТФ от содержания клеток E.coli в образце на фоне большого избытка клеток Bac.Subtilis.

П р и м е р 6. Определение количества клеток coli-форм в мазках, взятых с поверхности оборудования.

Пробу для анализа обсемененности методом "мазков" берут с помощью ватного тампона. После отбора пробы тампон погружают в селективную среду для coli-форм и вымывают в раствор содержимое с поверхности. Инкубирование смеси, отбор проб и обработку результатов ведут, как в примере 3. Полученные данные представлены в табл.6.

Использование: изобретение относится к санитарии и медицине и может быть использовано при определении общей микробной обсемененности или содержания coli-форм в пищевых продуктах, биологических жидкостях, смывах с технологического оборудования с помощью биолюминесценции. Сущность: к анализируемому жидкому биологическому образцу, содержащему не менее 10000 кл/мл, добавляют раствор периодата натрия в Тритоне X=100 и выдерживают полученную смесь в течение 1-3 мин. Далее в смесь вносят раствор глюкозы в концентрации 50-100 мМ и инкубируют 5-20 мин, после чего аликвоту смеси переносят в диметилсульфоксид при объемном соотношении смесь: диметилсульфоксид 1 :(4-9) и в полученном растворе определяют концентрацию микробного АТФ биолюминесцентным методом. При исходном содержании микробных клеток в образце менее 10000 кл/мл образец предварительно инкубируют в питательной или селективной среде (при определении coli-форм), после чего микробные клетки концентрируют путем фильтрования полученной микробной суспензии через мембранный фильтр под избыточным давлением, а глюкозу наносят на фильтр и выдерживают его в течение 5-20 мин. Фильтр обрабатывают диметилсульфоксидом и полученный раствор микробного АТФ используют для биолюминесцентного определения его концентрации по методу внутреннего стандарта. Регистрируемый параметр - максимум интенсивности свечения. 2 з. п. ф-лы, 6 табл.

1. Способ количественного определения микробной обсемененности биологического жидкого образца, предусматривающий экстракцию из образца с помощью Тритона Х-100 немикробного АТФ, разрушение последнего с использованием периодата натрия и экстракцию микробного АТФ из полученной смеси с помощью диметилсульфоксида при соотношении смесь диметилсульфоксид 1 4 9 с последующим измерением значения интенсивности биолюминесценции в полученном растворе при использовании АТФ-реагента, содержащего иммобилизованную люциферазу светляков, и количественным определением микробной обсемененности биологического жидкого образца по зависимости измеренного значения от концентрации микробного АТФ, отличающийся тем, что после разрушения немикробного АТФ в полученный раствор вводят глюкозу в концентрации 50 100 ммоль и выдерживают эту смесь в течение 5 20 мин. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при содержании микроорганизмов в образце менее 10000 кл/мл образец предварительно инкубируют в общей или селективной питательных средах в течение 4 6 ч. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что образец после инкубирования концентрируют фильтрованием через мембранный фильтр под избыточным давлением, а глюкозу наносят на фильтр и выдерживают его в течение 5 20 мин.