СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОПИЙ ДНК И РНК МИШЕНЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Настоящее изобретение относится к медицинской микробиологии и может найти применение, в частности, для диагностики инфекционных заболеваний.

Известен способ количественного определения ДНК и РНК мишеней методом полимеразной цепной реакции (ПЦ) путем прямого подсчета продукта амплификации (Riccardo Manganelli, Eugenie Dubnau, Sanjay Tyagi, Fred Russell Kramer and Issar Smith Differential expression of 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis Molecular Microbiology (1999) 31(2), 715-724).

Указанный способ может быть осуществлен лишь при небольшом (15-25) количестве циклов на логарифмической стадии амплификации. Малые количества продукта реакции невозможно обнаружить электрофоретически.

Наиболее широко используемым способом количественного определения ДНК и РНК методом ПЦР является способ, в котором используется внутренний калибровочный стандарт, вводимый вместе с исследуемой мишенью (Артемьев М.И., Барановский П.М., Бикетов С.Ф., Сметанина С.Е., Зуева Е.Н., Киселев В.И. "Количественное определение стресс-индукции генов rec A, dna К и sig А М. tuberculosis. Штамм Н 37 Rv посредством измерения количества соответствующих m-RNA методом РТ-ПЦР". Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. М., 2002, стр.102).

Титрованием внутреннего калибровочного стандарта определяется его нижний порог чувствительности (количество копий внутреннего стандарта, при котором минимальные изменения в количестве мишени сказываются на эффективности амплификации внутреннего калибровочного стандарта). Точно определить число копий мРНК мишени возможно в том случае, если полосы свечения на электрофорезе продуктов реакции амплификации мишени и внутреннего калибровочного стандарта совпадают по интенсивности. В хорошо подобранных системах такой подход позволяет улавливать двукратное изменение количества исследуемой мишени.

Основным недостатком общепринятого способа использования внутреннего калибровочного стандарта является необходимость его конструирования для каждой новой мишени, т.к. стандарт и мишень должны иметь одинаковые последовательности для "посадки" одной пары праймеров. Внутренний калибровочный стандарт представляет собой сложный и дорогостоящий генно-инженерный продукт.

Принцип изобретения основан на идее отсутствия конкуренции между двумя мишенями, которые одновременно амплифицируются в одной пробирке при использовании двух различных пар праймеров, одна из которых специфична УВКС, а другая - исследуемой мишени.

Задача изобретения - способ количественного определения ДНК и РНК методом ПЦР, позволяющий вместо конструирования специфического внутреннего калибровочного стандарта использовать подходящие и доступные ДНК или РНК.

Поставленная задача решается способом, в котором в качестве внутреннего калибровочного стандарта используется либо препарат ДНК плазмид E.coli для проведения ПЦР, либо препарат тотальной РНК E.coli, где в качестве УВКС используется 16S РНК для проведения ОТ-ПЦР, а одновременную амплификацию мишени и УВКС проводят в присутствии двух пар праймеров, где праймеры первой пары специфичны к нуклеотидным последовательностям мишени, а праймеры другой пары специфичны к нуклеотидным последовательностям УВКС, причем температура отжига праймеров к УВКС идентична температуре отжига праймеров к исследуемой нуклеиновой кислоте.

В такой системе при постановке ОТ ПЦР и ПЦР используется две различные (гетерологичные) пары примеров.

При постановке ПЦР первая пара праймеров специфична для 16 S рибосомных генов (УВКС), вторая пара праймеров специфична для исследуемой мишени.

При постановке ОТ-ПЦР на стадии обратной транскрипции используется только обратный праймер, специфичный для 16 S рибосомных генов (УВКС), и обратный праймер, специфичный для исследуемой мишени.

ПЦР стадия проводится с использованием двух пар праймеров. Одна пара праймеров специфична для 16S рибосомных генов (16S УВКС), вторая пара праймеров специфична для исследуемой мишени.

Каждая пара праймеров отрабатывает свою мишень независимо друг от друга. Количество наработанного ПЦР-продукта прямо пропорционально количеству исходной мишени. Методом титрования устанавливается минимальное количество копий УВКС и мишени при заданном режиме ОТ ПЦР или ПЦР.

Физическое количество копий УВКС устанавливается по формуле 1, принимая во внимание, что 1 геном - эквивалент Е.coli=3.8×10³ т.п.н. и количество копий 16 S рибосомных генов=10.

Формула 1

где:

N - количество копий исследуемой мишени (ед./мкл);

А - исходная концентрация препарата УВКС (г/мкл);

Б - размер УВКС (число пар нуклеотидов);

В - число копий мишени УВКС на геном;

Пример расчета N для УВКС (16S ДНК Е.coli)

N - количество копий исследуемой мишени (ед./мкл);

А - 1 nг/мкл;

Б - 3.8×10⁶ н.п;

В - 10.

N=10^-9×6.022×10²³×10/3.8×10⁶×666=2.4×10⁶ копий/мкл

Расчет N для - УВКС-(16S РНК Е.coli) проводили по формуле 2

Формула 2

N - количество копий УВКС (ед./мкл);

А - исходная концентрация препарата УВКС (г/мкл);

Б - размер УВКС (число пар нуклеотидов).

Пример расчета N для УВКС (16S РНК E.coli)

N - количество копий 16S РНК-УВКС (ед./ мкл);

А - 1 nг/мкл;

Б - 1776 н.п.

N=10^-9×6.022×10²³×10/1776×333=10⁹ копий/мкл

Праймеры на 16 S РНК E.coli выбирались с учетом соотношения ГЦ/АТ, которое обеспечивает температуру отжига не менее 68°С. Выбор наиболее высокой температуры отжига (68°С и более) позволяет использовать их в сочетании с подавляющим числом мишеней, т.к. температура отжига, как правило, не превышает 68°С. Размер ампликона от УВКС должен отличаться от размера ампликона от мишени 20-100%, чтобы иметь достаточное расхождение ампликонов при электрофорезе, но не превышать 1000 пар нуклеотидов, чтобы не сильно отличаться по эффективности амплификации.

Такой подход позволяет исключить необходимость конструирования для каждой новой мишени своего собственного внутреннего стандарта, имеющего ту же самую пару праймеров, что и исследуемая мишень.

Предлагаемый способ особенно эффективен при работе с медленно растущими микроорганизмами, например M.tuberculosis, т.к. в этом случае оценка числа микроорганизмов традиционным микробиологическим методом может занимать несколько недель против нескольких часов при использовании ПНР технологии.

Наиболее точно определить число копий ДНК мишени можно в том случае, если полосы свечения на электрофорезе продуктов амплификации мишени и внутреннего стандарта совпадают по интенсивности при минимальном значении УВКС. В хорошо подобранных системах такой подход позволяет улавливать двукратное изменение количества исследуемой мишени (см. фиг.1, таблицу и фиг.2 А, В, С).

Получение препарата ДНК E.coli, используемого в качестве УВКС.

Тотальный препарат нуклеиновых кислот E.coli обрабатывали ферментом РНК-зой для удаления РНК. Количество ДНК в препарате определяли методом электрофореза в агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Количество копий 16S ДНК мишени (ДНК-УВКС) определяли, исходя из размера генома E.coli 2×10 ⁶ нуклеотидных пар и числа копий 16S рибосомных генов (10 копий на геном).

Получение препарата РНК E.coli, используемого в качестве УВКС.

Тотальный препарат нуклеиновых кислот E.coli обрабатывали ферментом ДНК-зой для удаления ДНК.

Количество 16S РНК (РНК-УВКС) в тотальном препарате РНК определяли спектрофотометрическим методом, исходя из того, что практически вся РНК состоит из 16S и 23 S РНК в соотношении 1/2.

Таблица № трекаЧисло геном-эквивалентов вируса гепатита В1102203404805800

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине. ДНК или РНК мишень и универсальный внутренний стандарт, в качестве которого используют фрагмент плазмиды E.coli или 16S РНК E.coli, одновременно амплифицируют. Для амплификации используют две пары праймеров с идентичной температурой отжига, причем праймеры первой пары специфичны к нуклеотидной последовательности мишени, а праймеры второй пары - к нуклеотидной последовательности внутреннего стандарта. По данным электрофоретического разделения ампликонов мишени и универсального внутреннего стандарта определяют число копий мишени. Использование изобретения позволяет определять количество копий ДНК и РНК мишеней по упрощенной схеме. 2 ил., 1 табл.

Способ количественного определения копий ДНК и РНК мишеней методом полимеразной цепной реакции с использованием универсального внутреннего калибровочного стандарта (УВКС), предусматривающий одновременную амплификацию мишени и УВКС и определение числа копий мишени по данным электрофоретического разделения ампликонов мишени и УВКС, отличающийся тем, что в качестве УВКС используют 16S РНК Е.coli или фрагмент ДНК плазмиды Е.coli, а одновременную амплификацию мишени и УВКС проводят в присутствии двух пар праймеров, где праймеры первой пары специфичны к нуклеотидной последовательности мишени, а праймеры другой пары специфичны к нуклеотидной последовательности УВКС, причем температура отжига праймеров к УВКС идентична температуре отжига праймеров к исследуемой нуклеиновой кислоте.