Набор праймеров и флуоресцентного зонда для выявления генетического материала (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae для детекции патогенных бартонелл кошек Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора праймеров и флуоресцентного зонда для выявления генетического материала (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae для детекции патогенных бартонелл кошек. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae для детекции патогенных бартонелл кошек и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент высоко консервативной области (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, общий для всех вариантов рода Бартонеллы Bartonella spp.), что позволяет выявлять животных, инфицированных Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae. на любых стадиях заболевания.

Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae кошек в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств патогенных бартонелл кошек Bartonella spp., и может быть использовано в ветеринарии.

Уреаплазмозы – комплексные болезни домашних и диких животных, птиц и человека, вызываемые различными видами уреаплазм, сопровождающиеся патологией половой, мочевыделительной, респираторной, иммунокомпетентной систем, поражением глаз, воспалением желудочно-кишечного тракта, анемией и желтухой, а также артритами и артрозами.

Бартонеллёз – инфекционное бактериальное заболевание, вызванное грамотрицательными бактериями. Болезнь также широко известна под названием «лихорадка от кошачьих царапин». Это зоонозное заболевание, то есть оно может передаваться от животных людям. Кошки обычно заражаются путём контакта с экскрементами блох.

Основными видами бартоннел кошек являются: Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae. Кошки для них являются резервуарным хозяином для данных видов. Заражение происходит только в присутствии блох. В экспериментальных условиях при совместном содержании зараженных и не зараженных кошек в отсутствии блох заражения здоровых кошек не происходит. Локализуются в эндотелиях сосудов и эритроцитах, вызывая длительную бактериемию.

Способы передачи бартонеллеза:

- Кошачьи царапины (при наличии зараженных фекалий блох)

- Самоповреждение при манипуляциях с кошками

- Переливание крови (реципиенту).

Бартонеллы проникают под кожу, поражают первичную нишу (моноцит или дендритная клетка, макрофаг, в которой происходит изначальное размножение), после чего он их транспортирует к эндотелию (однослойный пласт клеток, выстилающих внутреннюю поверхность кровеносных сосудов) сосудов. Где происходит их дальнейшее размножение, после чего они выходят в просвет сосудов и повреждают эритроциты. Размножение проходит внутри эритроцита - гемолиза (разрушение эритроцита) они не вызывают. При повторном заглатывании зараженной крови этот цикл замыкается и бартонеллы вновь попадают в своего переносчика.

Бартонеллы имеют выраженную способность к прилипанию и слипанию между собой в тканях, поражают эритроциты и эндотелиальные клетки. Широкая тканевая специфичность бартонелл обусловлена адгезией с эндотелиальными клетками, которые являются компонентами капилляров. Экспериментальные данные показывают, что B. henselae, взаимодействуя с макрофагами, вызывает стимуляцию ангиогенных факторов роста эндотелия сосудов (VEGF - и интерлейкин -1beta- IL-1бета), который через паракринной механизм, индуцируют пролиферацию эндотелиальных клеток. Белки бартонелл стимулируют эндотелиальные клетки к пролиферации и вызывают неоваскуляризацию или ангиогенез и излияние воспалительных цитокинов, которые вербуют воспалительные клетки (лимфоциты, плазматические клетки и макрофаги). Таким образом, Bartonella вызывают хроническую лимфоцитарную, плазмоцитарную, гранулематозную воспалительную реакцию в высокоразвитых сосудистых тканях во всем организме зараженного животного.

Частые мишени: слизистые оболочки ротовой полости и всего ЖКТ, слизистые оболочки дыхательных путей, ткани глазного яблока, кожа, печень, селезенка и лимфатические узлы. На самом деле, так как капилляры встречаются во всех тканях, все ткани восприимчивы к воспалительным эффектам.

Ослабление иммунитета, синдром иммунодефицита, плохое питание, скученное содержание, ко-инфекции, иммуносупрессивная терапия или нарушение нормальных барьеров организма (как врождённый порок сердца у кошки с эндокардитом) имеет значение в развитии болезни. Подавляющее большинство кошек не имеет явных признаков заболевания во время бактериемии.

Чаще всего наблюдаются неспецифические симптомы: гингивит, стоматит, оральные язвы, инфекции верхних дыхательных путей, включая, синусит и ринит, генерализованная лимфаденопатия, устойчивая лихорадка, увеит, конъюнктивит, кожные заболевания, хронические проблемы ЖКТ (воспалительная болезнь кишечника, хроническая диарея и рвота). Стоит заметить, что роль Bartonella Spp в развитии данных симптомов и симптомо-комплексов изучается.

У кошек, инфицированных Bartonella, редко развивается эндокардит и миокардит. Встречались карпальные и метакарпальные остеомиелиты и системный реактивный ангио-эндотелиоматоз.

Гематологические и биохимические изменения у кошек неспецифичные, часто умеренные (умеренная нерегенераторная анемия, нейтрофилия, тромбоцитопения).

При бартонеллезном эндокардите на рентгене грудной полости наблюдается сердечная недостаточность, с переполнением вен, лёгочным отёком. Уплотнение долей лёгкого, внутригрудная лимфоаденопатия описана у кошек с системным гранулематозным заболеванием и сиалометаплазией.

На эхокардиографии: осциллирующая вегетация клапанов или утолщение и гиперэхогенность створок клапана, которые обычно затрагивают аортальный клапан. Могут быть признаки аортальной регургитации или недостаточности и эксцентрической гипертрофии левого желудочка.

Диагноз ставится на основании клинических признаков (эндокардиты, миокардиты, системные воспалительные, васкулопролиферативные заболевания), гистопатологических данных, положительном посеве или ПЦР из крови или поражённых тканей.

Посев может быть нечувствительным вследствие рецидивирующего характера бактериемии, у собак вообще низкая чувствительность вследствие низкого уровня бактериемии.

ПЦР-диагностика крови до настоящего времени не намного чувствительней посева, ложно-положительные результаты бывают из-за внутрилабораторной контаминации.

ИФА (ELISA) и VESTERN BLOT используют для определения антител. Большинство кошек с высоким титром антител (>1:64) к B. henselae в настоящее время заражены и бактерии часто могут быть выделены из их крови.

При иммуногистохимической окраске (импрегнации серебром) препаратов из поражённых органов, можно увидеть мелкие бациллы. Интерпретировать эту окраску необходимо с осторожностью, потому что некротический дебрис и ядерный материал может имитировать положительный результат.

Уровень техники

При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для диагностики ДНК фрагмента гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae - патогенных бартонелл кошек был проведён сравнительный анализ структуры сиквенсов фрагментов геномов гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).

Амплифицируемый участок ДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к ДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.

При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени ДНК фрагмента гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время патогенным бартонеллам кошек, что повышает достоверность и надежность анализов.

Указанный технический результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции ДНК фрагмента гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae , содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

Последовательности олигонуклеотидов для выявления генетического материала (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК рода Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae патогенных бартонелл кошек

Прямой праймер (Forward primer)

VT-BRT-F 5`- CGGAGGGCTTGTAGCTCAG -3`

Обратный (Reverse primer)

VT-BRT-R 5`- CTGGTGGGCCTGGGAG -3`

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5`→3`

VT-BRT-P 5`- (R6G)- CCTCCGACCTCACGCTTATCAAGC -(BHQ2) -3`

Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда

Показатель VT-BRT-F VT-BRT-R Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-BRT-P Структура от 5’ к 3’ CGGAGGGCTTGTAGCTCAG CTGGTGGGCCTGGGAG (R6G)- CCTCCGACCTCACGCTTATCAAGC -(BHQ2) Длина, нуклеотиды 19 16 22 Т отжига с учётом Т плавления, ºC 60 60 69 GC состав, % 63 75 58 Т работы фермента, °C 54,2 53,1 67,4

Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях фрагмента гена 16S рибосомальной РНК патогенных бартонелл кошек Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время патогенных бартонеллам кошек, что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена 16S рибосомальной РНК.

Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуорсцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце ДНК фрагмента гена 16S рибосомальной РНК патогенных бартонелл кошек Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств вируса. Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущими типоспецифический фрагмент гена 16S рибосомальной РНК патогенных бартонелл кошек Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae патогенных бартонелл кошек.

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.

Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl₂ обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).

Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку)

Компонент Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл ПЦР-буфер ×10 2,5 дНТФ (25 мМ) 0,2 MgCl₂ (50 мМ) 1 Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл) 0.5 Прямой праймер - VT-BRT-F (10 пмоль/мкл) 1 Обратный праймер - VT-BRT-R (10 пмоль/мкл) 1 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-BRT-P (5 пмоль/мкл) 1 Образец (проба с ДНК) 5 diH₂O (бидистилированная) 6

Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР

Этап Т, °С Время, сек. Количество повторов Амплификатор планшетного типа Амплификатор роторного типа Начальная денатурация 95 300 300 1 Денатурация 95 10 10 45 циклов с флуоресцентной детекцией Отжиг 58 25 измерение 25 измерение Элонгация 72 25 40 Хранение 4 ∞ ∞

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).

Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10^-1 до 10^-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Специфичность разработанного способа проверяли на образцах патогенных бартонелл кошек Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении представителей Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».

фИзобретение относится к области биотехнологии. Предложен набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-BRT-F 5'- CGGAGGGCTTGTAGCTCAG -3', VT-BRT-R 5'- CTGGTGGGCCTGGGAG -3' и флуоресцентно-меченого зонда VT-BRT-P 5'- (R6G)- CCTCCGACCTCACGCTTATCAAGC -(BHQ2) -3' к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae для детекции патогенных бартонелл кошек. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда позволяет идентифицировать в реальном времени ДНК фрагмента гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae, обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время патогенным бартонеллам кошек, что повышает достоверность и надежность анализов. 3 табл., 3 ил.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-BRT-F 5'-CGGAGGGCTTGTAGCTCAG-3', VT-BRT-R-5'-CTGGTGGGCCTGGGAG-3' и флуоресцентно-меченого зонда VT-BRT-P 5'-(R6G)-CCTCCGACCTCACGCTTATCAAGC-(BHQ2)-3' к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae для детекции патогенных бартонелл кошек.