СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТУЛИНА И ЛУПЕОЛА Российский патент 2006 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 

Изобретение относится к способу выделения из внешнего слоя коры (бересты) белоствольных берез бетулина (20,29-лупен-3β,28-диола; 3β,28-дигидрокси-луп-20,29-ена) и лупеола (20,29-лупен-3β-ола; 3β-гидрокси-луп-20,29-ена).

Бетулин и лупеол, пентациклические тритерпеноиды ряда лупана, обладают широким спектром биологической активности, а также являются синтетическими предшественниками большого количества соединений с ценными фармакологическими свойствами.

Результаты изобретения позволяют рационально использовать растительное сырье и могут быть применены в химии, медицине, фармации.

Содержание бетулина в бересте колеблется от 10 до 40% в зависимости от вида березы, местности произрастания и сезона сбора коры, в суммарном экстракте бересты доля бетулина составляет примерно 70%. Основным сопутствующим бетулину компонентом экстракта является лупеол, его содержание в суммарных экстрактах около 3%.

Известные способы получения бетулина из бересты предполагают кристаллизацию его из экстракта, методы получения которого делятся на две группы. В первой группе экстракцию бересты осуществляют различными органическими растворителями - хлороформом в присутствии силикагеля [1], 90-95% этиловым спиртом в присутствии активированного угля [2], толуолом [3], ацетоном [4]. Во вторую группу входят способы, предполагающие использование щелочи для отделения кислотных компонент экстракта: а) бересту обрабатывают водноспиртовой щелочью (спирт - МеОН, EtOH, изо-PrOH); б) промывают экстракт раствором щелочи различной концентрации [5-8].

Обе группы методов позволяют получать бетулин низкого качества. Получение соединения с чистотой >95%, необходимой для проведения синтетических работ и биологических испытаний, требует многократной (от одного до пяти раз) перекристаллизации, что существенно снижает его выход (от 11 до 5%) [1, 9].

Основными недостатками этих методов являются трудоемкость получения высокочистого бетулина, отсутствие данных о числе ступеней перекристаллизации, за которое удается получить высоко очищенный бетулин, отсутствие сведений о выходе бетулина указанной квалификации, отсутствие данных о методе контроля за чистотой получаемого бетулина.

Известны способы выделения лупеола из бересты березы экстракцией бензолом с последующим хроматографированием полученного продукта [8] или методом сверхкритической флюидной экстракции системой СО₂-со-растворитель при 40-50°С (Р 3-5 атм). Эти способы также предполагают использование колоночной хроматографии для получения из суммарного экстракта фракций, обогащенных лупеолом, и далее перекристаллизацию полученных концентратов. Выход лупеола, полученного таким образом, составляет 1.0-1.5%, содержание основного вещества 90-95% [10, 11].

Недостатком перечисленных методов является необходимость использования специального оборудования, трудоемких и неэффективных хроматографических методов выделения.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения бетулина из бересты, с хроматографическим выделением сопутствующего ему лупеола. Способ заключается в экстракции бересты смесью петролейный эфир (70-100°С) - толуол в соотношении 1:1-7:3 при температуре кипения экстрагента, последующей кристаллизации из охлажденного экстракта продукта, представляющего собой смесь бетулина и лупеола, и разделении этой смеси методом колоночной хроматографии [6].

К недостаткам метода можно отнести использование высококипящих и токсичных растворителей, неэффективность методов выделения целевых соединений, отсутствие данных о методах контроля за чистотой бетулина, отсутствие сведений о качестве лупеола.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в разработке эффективного способа, исключающего применение трудоемких и затратных хроматографических методов выделения и очистки и позволяющего получать из бересты одновременно два соединения - бетулин и всегда сопутствующий ему лупеол, с высокими выходами в виде индивидуальных субстанций, пригодных для синтетических модификаций и изучения биологической активности.

В заявленном способе лупеол и бетулин с высокой селективностью разделяют кипячением с гексаном продукта, полученного экстракцией бересты метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) и обработанного раствором щелочи. При этом лупеол, обладающий меньшей по сравнению с бетулином полярностью, переходит в раствор гексана, а нерастворимый остаток представляет собой практически чистый бетулин. Однократной перекристаллизацией лупеола из этилацетата (EtOAc) получают соединение с чистотой более 95%.

МТБЭ обладает рядом ценных для экстрагента характеристик: прежде всего в изучаемом объекте он селективно растворяет природные соединения средней полярности, имеет невысокую температуру кипения (52°С), не образует пероксидов (в отличие от других, широко применяемых для экстракци природных соединений, растворителей эфирного типа), плохо смешивается с водой, малотоксичен, имеет низкую стоимость, доступен.

Результатом изобретения является извлечение из растительного сырья бетулина и лупеола с чистотой более 95%.

Сущность изобретения состоит в следующем. Измельченную бересту (влажность <5%) экстрагируют МТБЭ, либо вначале гексаном (извлекая лупеол, содержащий примесь бетулина), а затем продолжают экстракцию МТБЭ. В обоих случаях далее эфирный экстракт обрабатывают 4N раствором NaOH для удаления натриевых солей кислотных компонентов экстракта, затем промывают водой и высушивают осушителем, раствор фильтруют, фильтрат упаривают. Полученный кристаллический остаток, представляющий собой смесь бетулина и лупеола, кипятят с гексаном, не растворимую в гексане часть отфильтровывают. После отгонки из фильтрата растворителя получают смесь лупеола и бетулина, однократной перекристаллизацией которого из EtOAc выделяют лупеол, с массовой долей основного вещества >95%. Не растворимый в гексане кристаллический остаток представляет собой бетулин с чистотой >95%. В полученных образцах бетулина и лупеола по данным тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектров ЯМР ¹Н и ¹³С примеси не обнаруживаются.

Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Кипятят 10 г измельченной бересты 2 ч. в 100 мл МТБЭ, экстракт отфильтровывают, затем добавляют 80 мл МТБЭ и кипятят 40 мин (операцию повторяют 4 раза). Объединенные экстракты промывают 25 мл 4N водным раствором NaOH, затем водой, высушивают MgSO₄, раствор фильтруют, растворитель упаривают на роторном испарителе, получают 1.9 г кристаллического продукта белого цвета, который кипятят с 60 мл гексана 1 ч. (процедуру экстракции повторяют 4 раза), не растворимую в гексане часть отфильтровывают, высушивают на воздухе, получают 1,6 г (16% от веса сухой бересты) бетулина, индивидуального по данным ТСХ, ЯМР ¹Н, ¹³С. Из объединенных гексановых экстрактов упаривают растворитель, получают 0,3 г продукта, однократной перекристаллизацией которого из EtOAc (15 мл) получают 0.28 г (2.8%) лупеола, индивидуального по данным ТСХ, спектров ЯМР ¹Н и ¹³С.

Бетулин: Т. пл. 252-254°С (лит. 254-256°С, EtOH) [11]; [α]_D ²⁰+20°(с 0.016, пиридин), лит. [α]_D ²⁰+20°(пиридин). ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 0.76 с (3Н, СН₃); 0.83 с (3Н, СН₃); 0.97 (3Н, СН₃); 0.98 с (3Н, СН₃); 1.03 с (3Н, СН₃); 1.69 с (3Н, 30-СН₃); 3.20 дд (1H, 3-Н, J 10.7 Гц, 5.0 Гц); 3.35 д (1Н, 28-H_a J 5.4 Гц); 3.80 д (1Н, 28-H_бJ 5.4 Гц); 4.59 с (1Н, 29-Н_а); 4.69 с (1Н, 29-Н_а). ЯМР ¹³С (δ, м.д.): 14.73; 15.33; 15.96; 16.06; 16.28; 19.06; 20.60; 25.16; 27.03; 27.35; 27.96; 29.15; 29.72; 33.94; 34.21; 37.14; 37.27; 38.67; 38.64; 40.69; 42.66; 47.77; 47.77; 48.73; 50.37; 55.26; 60.50 т (28-С); 78.96 (3-С); 109.66 (29-С); 150.45 (20-С).

Лупеол. Т. пл. 213-215°С (EtOAc). Лит. 212-213°С [11]. [α]_D ²⁰+21°(с 9.3, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 0,76 с (3Н, СН₃); 0.79 с (3Н, СН₃); 0.83 с (3Н, СН₃); 0.95 с (3Н, СН₃); 0.97 с (3Н, СН₃); 1.03 с (3Н, СН₃); 1.69 с (3Н, 30-СН₃); 3.19 дд (1Н, 3-Н, J 10.7 Гц, 5.5 Гц); 4.57 с (1Н, 29-Н_а); 4.69 с (1Н, 29-Н_б). Спектр ЯМР ¹³С (δ, м.д.): 14.52; 15.39; 15.94; 16.09; 17.99; 18.29; 19.29; 20.91; 22.64; 25.11; 27.40; 27.96; 29.82; 31.57; 34.25; 35.55; 37.14; 38.03; 38.84; 39.97; 40.81; 42.80; 42.97; 47.97; 48.27; 50.40; 55.28; 78.98 (3-С); 109.29 (29-С); 150.97 (20-С).

Пример 2.

Кипятят 10 г измельченной бересты в 60 мл гексана 1 ч, раствор отфильтровывают (повторяют процедуру экстракции 5 раз), растворитель упаривают на роторном испарителе, получают 0.18 г лупеола, содержащего примесь бетулина. Кору березы заливают 60 мл МТБЭ и кипятят 40 мин (повторяют процедуру 4 раза). Объединенные экстракты промывают 25 мл 4N NaOH, высушивают MgSO₄, растворитель упаривают, получают 1.75 г (21%) продукта, который кипятят с гексаном (35 мл×2). Не растворимую в гексане часть отфильтровывают, высушивают на воздухе, получают 1.6 г (16%) бетулина в виде индивидуального соединения. После упаривания фильтрата получают 0.15 г лупеола, содержащего примесь бетулина. Объединенные фракции лупеола (0.33 г) перекристаллизовывают из EtOAc (см. пример 1), получают 0.28 г (2.8%) лупеола, образец которого идентичен описанному выше.

Литература

1. Пат. US 5750578, 12.05.1998.

2. Пат. RU 2172178 C1, 20.08.2001.

3. Пат RU 2192879, 20.11.2002.

4. Изв. вузов Северо-Кавк. региона. Техн. науки. 1993, N 1-2, с.24-26.

5. Пат. US 20030153776, 14.08.2003.

6. Пат. РФ 2184120, 27.06.2002.

7. Пат. РФ 2138508, 27.09.1999.

8. ЖПХ, 1967, Т.40, с.920-921.

9. Пат. US 5804575, 08.10.1998.

10. Пат. US 6392070; 21.05.2002.

11. Пат. US 6586021, 01.06.2002.

12. Phitochemistry, 1980, N 19, 2707.

Изобретение относится к улучшенному способу выделения из бересты белоствольных берез пентациклических тритерпеноидов ряда лупана - бетулина и лупеола. Бетулин и лупеол разделяют кипячением с гексаном продукта, полученного экстракцией бересты метил-трет-бутиловым эфиром и обработанного раствором щелочи. Растворимый в гексане лупеол после удаления растворителя однократно перекристаллизовывают из этилацетата. Остаток, не растворимый в гексане, представляет собой практически чистый бетулин. Способ позволяет получать указанные соединения высокими выходами и с чистотой, превышающей 95%, без применения трудоемких и затратных хроматографических методов. Изобретение позволяет рационально использовать растительное сырье. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения бетулина и лупеола из бересты, включающий экстракцию органическим растворителем, кристаллизацию продукта, представляющего смесь бетулина и лупеола и последующее разделение смеси, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используется метил-трет-бутиловый эфир, а разделение бетулина и лупеола проводят кипячением смеси в гексане, отделением нерастворимого чистого бетулина и перекристаллизацией из этилацетата выделенного из фильтрата лупеола.2. Способ получения бетулина и лупеола по п.1, отличающийся тем, что экстракцию бересты предварительно проводят гексаном.