СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/531 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности способу получения латексного диагностикума инфекционных заболеваний рогатого скота и птиц.

Этиология многих инфекционных болезней рогатого скота и птиц включает широкий круг возбудителей. Среди них важное эпизоотологическое значение имеет аденовирусная инфекция, вирусная диарея, респираторно-синцитиальная, инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, оспа и болезнь Ньюкасла птиц. Часто эти вирусы действуют в ассоциациях. Немало важным является то, что вирусная инфекция очень часто осложняются секундарной микрофлорой. Все эти обстоятельства приводят к значительному экономическому ущербу, который складывается из потери продуктивности, рождении нежизнеспособного потомства, вынужденного убоя, гибели животных.

В настоящее время известен способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации, включающий использование карбоксилированных частиц, активированных карбодиимидом, к поверхности которых иммобилизируют IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorhagiae с ультразвуковой обработкой и инкубацией, отмывкой дистиллированной водой, центрифугированием и добавлением физиологического раствора до первоначального объема [1].

Известен также способ получения латексного диагностикума включающий сенсибилизацию антиглобулиновыми сыворотками к различным заболеваниям на частицы полиакрилового латекса с последующим выдерживанием в течение 4 час при комнатной температуре при рН 7,0-7,4 и 12 час при 4°С при постоянном равномерном перемешивании [2] - прототип.

В задачу наших исследований входило - получение высокочувствительного специфичного латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА), к таким заболеваниям, как аденовирусная инфекция, вирусная диарея, респираторно-синцитиальная инфекция, инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3 рогатого скота, оспа и Нъюкасла птиц.

Предлагаемый нами способ получения латексного диагностикума заключается в следующем:

- полимерную суспензию центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин и бидистиллятом доводят концентрацию полимерной суспензии до 0,5%-1,0% (по сухому остатку полимера).

Смешивали в равных объемах водные растворы вирусного антигена в инфекционном титре 6,5 lg-7,0 Ig ТЦД/₅₀ мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-1,0%-ную полимерную суспензию, помещали в термостат при +36+38°С на 4-6 час (процесс инкубации). Через 4-6 час к общему объему суспензии добавляли 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,07-015% и выдерживали в термостате при +4-8°С еще в течение 11-13 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (антиген, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2-7,4) до 0,1-0,3%. Приготовленный диагностикум может сохраняли при 4°С до одного года.

Диагностикум используют в постановке реакции латекс-агглютинации по стандартной методике.

Примеры.

Пример 1. Полимерную суспензию центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин и бидистиллятом доводили концентрацию полимерной суспензии до 0,5% (по сухому остатку полимера).

Смешивали равные объемы водные растворы аденовирусного антигена в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/₅₀ мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,07% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (аденовирусный антиген, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до 0,1%.

Диагностикум используют в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащие антитела к аденовирусной инфекции, и сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.

Таблица 1
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума на аденовирусную инфекцию рогатого скота№ п/пСыворотки, содержащие антитела к вирусу;Титр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем^# в РЛА и РНГАРЛА*РН**РНГА***1Адено- рогатого скота1:641:321:64-21:321:161:32-31:641:161:64-41:321:81:32-51:641:161:64-61:641:81:64-71:1281:321:128-81:321:81:32-91:641 161:64-101:321:81:32-11Инфекционного ринотрахеита----12Вирусной диареи----13Респираторной синцитиальной инфекции----14Парагриппа-3----15Оспы----16Нъюкасла----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латекс-агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

Как видно из табл.1, диагностикум на аденовирусную инфекцию оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения

Пример 2. Диагностикум готовили, как в примере 1, но брали в качестве биолиганда вирус инфекционного ринотрахеита рогатого скота, смешивали в равных объемах водные растворы инфекционного ринотрахеита в титре 7.0 lg ТЦД₅₀/мл и 0,6%-ую полимерную суспензию и помещали в термостат при +37°С на 5 часов в водной среде, периодически перемешивая (процесс инкубации). Через 5 часов к общему объему суспензии добавляли 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,08% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 12 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин, от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вирус инфекционного ринотрахеита, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,3) до 0,2%.

Диагностикум используют в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.

Таблица 2
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума на вирус инфекционного ринотрахеита рогатого скота№ п/пСыворотки, содержащие антитела к вирусу:Титр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем^# в РЛА и РНГАРЛА*РН**РНГА***1Инфекционного ринотрахеита1:2561:321:256-21:641:81:64-31:1281:161:128-41:1281:321:128-51:161:81:16-61:321:81:32-71:321:41:32-81:161:81:16-91:641:161:64-101:321:81:32-11Адено- рогатого скота----12Вирусной диареи----13Респираторной синцитиальной инфекции----14Парагриппа-3----15Оспы----16Нъюкасла----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латекс-агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

Как видно из табл.2, диагностикум на инфекционный ринотрахеит оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения.

Пример 3. Диагностикум готовили, как в примере 1, но в качестве биолиганда брали респираторно-синцитиальнный вирус.

Смешивают в равных объемах водные растворы респираторно-синцитиальный вирус в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД₅₀/мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную полимерную в суспензию, помещают в термостат при +38°С на 6 час в водной среде, периодически перемешивая (процесс инкубации). Через 4 час к общему объему суспензии добавляют 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,09% и выдерживают в термостате при +4°С еще в течение 13 часов. После инкубации бидистиллятом отмывают суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин, от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (аденовирусный антиген, альбумин) и концентрацию суспензии доводят фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до 0,1%.

Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА)

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу респираторно-синцитиальному инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам адено-, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.

Таблица 3
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума на респираторно-синцитиальный вирус рогатого скота№ п/пСыворотки, содержащие антителаТитр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем^# в РЛА и РНГАРЛА*РН**РНГА***1К PC вирусу1:161:41:16-21:161:81:16-31:161:41:16-41:321:41:32-51:321:41:32-61:321:41:32-71:321:41:32-81:161:21:16-91:641:41:64-101:321:41:32-11Адено- рогатого скота----12Инфекционного ринотрахеита----13К вирусу вирусной диареи----14Парагриппа-3----15Оспы----16Нъюкасла----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латекс-агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

Как видно из табл.3, диагностикум на респираторно-синцитиальную инфекцию оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствовало о перспективности патентуемого изобретения.

Пример 4. Диагностикум готовили, как в примере 1, но в качестве биолиганда брали вирус вирусной диареи. Смешивали в равных объемах водные растворы вируса вирусной диареи с инфекционном титре 6,5 lg ТЦД₅₀/мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную полимерную в суспензию, помещают в термостат при +37°С на 4 час в водной среде, периодически перемешивая (процесс инкубации). Через 4 час к общему объему суспензии добавляют 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,1% и выдерживают в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вирус вирусной диареи, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) до 0,1% концентрации.

Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА)

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу вирусной диареи, сывороток крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.

Таблица 4
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума на вирус вирусной диареи рогатого скота№ п/пСыворотки, содержащие антитела к вирусу:Титр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем^# в РЛА и РНГАРЛА*РН**РНГА***1Вирусной диареи1:2561:641256-21:1281:641:128-31:1281:321:128-41:1281:321:128-51:5261:641:526-61:641:81:64-71:321:321:32-81:1281:321:128-91:641:161:64-101:641:161:64-11Адено- рогатого скота----12Инфекционного ринотрахеита----13К PC вирусу----14Парагриппа-3----15Оспы----16Нъюкасла----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латексной агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Как видно из табл.4, диагностикум на вирусную диарею оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствовало о перспективности патентуемого изобретения.

Пример 5. Диагностикум готовили, как в примере 1, но в качестве биолиганда брали вирус парагриппа-3 рогатого скота. Смешивали равные объемы водные растворы вируса парагриппа в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/₅₀мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 1,0%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,15% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 13 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхности частиц биолигандов (вируса парагриппа-3, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до концентрации 0,2%. Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА).

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу парагриппа-3, сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.

Таблица 5
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума на вирус парагриппа-3 рогатого скота. Сыворотки, содержащие антитела к вирусу:Титр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем^# в РЛА и РНГАРЛА*РН**РНГА***1Парагриппа-31:1281:321:128-21:2561:321:256-31:41:41:4-41:161:41:16-51:2561:641:256-61:641:81:64-71:1281:321:128-81:1281:321:128-91:2561:161:256-101:41:41:4-11Адено- рогатого скота----12Инфекционного ринотрахеита----13Вирусной диареи----14Респираторной синцитиальной инфекции    15Оспы----16Нъюкасла----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латекс-агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Как видно из табл.5, диагностикум на парагрипп-3 оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения.

Пример 6. Диагностикум готовили, как в примере 1, но брали в качестве биолиганда вирус оспы птиц.

Смешивали в равных объемах водные растворы вируса оспы птиц в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/₅₀мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,07% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вируса оспы птиц, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до 0,2% концентрации.

Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевшей птицы, содержащих антитела к вирусу оспы птиц, инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено- и вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС), Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержавшую антител к данным инфекциям.

Таблица 6
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума к вирусу оспы птиц№ п/пСыворотки, содержащие антитела к вирусу:Титр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем^# в РЛА и РНГАРЛА*РН**РДП***1Оспы1:81:41:8-21:321:41:32-31:1281:41:128-41:1281:41:128-51:321:41:32-61:321:21:32-71:1281:161:128-81:81:21:8-91:2561:161:256-101:1281:41:128-11Адено- рогатого скота----12Инфекционного ринотрахеита----13Вирусной диареи----14Респираторной синцитиальной инфекции    15Парагриппа-3----16Нъюкасла----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латекс-агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РДП- реакция диффузной преципитации.

Как видно из табл.6, диагностикум на вирус оспы птиц оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РДП, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения.

Пример 7. Диагностикум готовили как в примере 1, но брали в качестве биолиганда вирус Нъюкасла птиц.

Смешивали в равных объемах водные растворы вируса Нъюкасла в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/₅₀мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,6%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,08% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вирус Нъюкасла птиц, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,3) до 0,3% концентрации.

Диагностикум использовали в постановке реакции латекс- агглютинации (РЛА) по стандартной методике.

Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших птиц, содержащих антитела к вирусу Нъюкасла птиц, инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС), и к вирусам оспы птиц, и сыворотку крови, не содержащим антител к данным инфекциям.

Таблица 7
Чувствительность и специфичность латексного диагностикума к вирусу Ньюкасла птиц№ п/пСыворотки, содержащие антитела к вирусу:Титр сыворотки в:Контроль диагностикума с разбавителем в РЛА и РНГАРЛА*РН**РТГА***1Нъюкасла1:5121:641:512-21:1281:641:128-31:5121:641:512-41:5121:321:512-51:321:81:32-61:1281:321:128-71:641:81:64-81:5121:321:512-91:1281:161:128-101:1281:161:128-11Адено- рогатого скота----12Инфекционного ринотрахеита----13Вирусной диареи----14Респираторной синцитиальной инфекции    15Парагриппа-3----16Оспы----17Сыворотка, не содержащая антитела к указанным вирусам (отрицательная)----#Фосфатно-солевой буфер (рН 7,2-7,4)+1% кроличья сыворотка + формалин;
*РЛА - реакция латекс-агглютинации;
**РН - реакция нейтрализации;
***РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Как видно из табл.7, диагностикум к вирусу Нъюкасла птиц оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования как РН, РНГА, что свидетельствовало о перспективности патентуемого изобретения.

Как видно из примеров, предложенный способ обеспечивает получение высокочувствительного и специфичного латексного диагностикума для дифференциации различных инфекционных заболеваний рогатого скота и птиц.

Диагностикум, полученный предложенным способом, апробирован положительным результатом в Федеральном Государственном Учреждении Центральной Научно-методической ветеринарной лаборатории РФ (ФГУЦНМВЛ), Московской Государственной Академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина (МГАВМиБ) в 2003-2004 гг.

Диагностикум полученный предложенным способом найдет применение в НИИ ветеринарного профиля, в диагностических ветеринарных лабораториях РФ и позволит своевременно распознавать конкретные инфекционные заболевания и принять соответствующие своевременные меры лечения и профилактики.

Источники информации

1. Патент РФ. 2177617, Кл. G 01 N 33/567 (2001).

2. Патент РФ. 2012888, Кл. G 01 N 33/531 (1994).

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения латексного диагностикума инфекционных заболеваний рогатого скота и птиц. Способ получения латексного диагностикума заключается в том, что полимерную суспензию центрифугируют, доводят дистиллированной водой концентрацию полимерной суспензии до 0,5% по сухому остатку полимера, смешивают в равных объемах водные растворы вирусного антигена в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/₅₀ мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-1,0%-ную полимерную суспензию, помещают в термостат при +36-38°С на 4-6 час. Затем к общему объему суспензии добавляют водный раствор человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,07-0,15%, инкубируют при +4-8°С в течение 11-13 часов, суспензию отмывают и доводят концентрацию диагностикума фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 до 0,1-0,3%. Приготовленный диагностикум хранится при 4°С до года. Диагностикум позволяет своевременно распознавать конкретные инфекционные заболевания и принять соответствующие своевременные меры лечения и профилактики. 7 табл.

Способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации путем иммобилизации полимерных микросфер вирусными антигенами и получения готового диагностикума, отличающийся тем, что в качестве полимерных микросфер берут окрашенные полимерные микросферы в концентрации 0,5-1,0% по сухому остатку полимера с диаметром частиц 1,5 мкм, представляющего собой сополимер стирола, акролеина, стиролсульфоната натрия, иммобилизацию проводят в водной среде в течение 4-6 ч при температуре +36÷38°С, периодически перемешивая, далее добавляют 0,07-0,15%-ный водный раствор человеческого альбумина, выдерживают в течение 11-13 ч при температуре +4÷8°С, отмывают трехкратным центрифугированием по 15 мин при 4000 об/мин несвязавшиеся биолиганды 0,15 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4, полученный диагностикум доводят до концентрации 0,1-0,3% по сухому остатку полимера.