СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕПТОСПИРОЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/567 G01N33/546 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунологии, и может использоваться для диагностики лептоспироза человека и животных.

Диагностика лептоспироза трудна как в связи с его клиническим полиморфизмом, так и с особенностями возбудителей, представленных лептоспирами 202 сероваров, объединенных в 23 серологических группы. Это заболевание имеет сходную клиническую картину с гепатитами, геморрагической лихорадкой с почечным синдромом, гриппом, брюшным и сыпным тифом и др. Поэтому при лептоспирозе нередки диагностические ошибки и только указания на характер профессиональной деятельности человека, соответствующие эпидемическая и эпизоотическая обстановка в определенной степени ориентируют клинициста. У животных лептоспирозная инфекция вообще может протекать бессимптомно и лишь появление выкидышей и мертворожденного потомства служат указанием на лептоспироз.

Основой диагностики лептоспироза у людей и животных являются микробиологические исследования. В соответствии с [1] большое значение уделяется бактериологическим и иммунологическим методам. Однако первый из них требует длительного времени (до трех месяцев) в связи с медленным размножением лептоспир (время генерации до 14 ч), определенных навыков работы, т.к. индикация возбудителей до серогруппы проводится в реакции микроагглютинации (РМА), результаты которой учитываются в темном поле зрения микроскопа.

Обнаружение антител в сыворотке крови инфицированных в РМА является поздним методом диагностики и требует поддержания набора из 15-23 живых эталонных патогенных культур лептоспир, что не всегда возможно. Кроме того, могут наблюдаться перекрестные реакции, в результате чего возникает необходимость в проведении трудоемкого иммуноабсорбционного теста.

В качестве экспресс-метода для обнаружения противолептоспирозных антител разработаны разные варианты тест-систем, однако все они относятся к поздним методам диагностики [2,3]. В качестве диагностикума в других тест-системах используют латексные частицы, нагруженные антигеном лептоспир одного из сероваров [4] . Реакция латекс-агглютинации (РЛА) выполняется в планшетах в микроварианте с разведением исследуемой сыворотки, что позволяет выявить титр противолептоспирозных антител и динамику их накопления.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс- агглютинации, включающий адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микросфер латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривающий в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции (для приготовления лептоспирозного антигена) с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам [5].

Однако как в указанной выше тест-истеме [4], так и в ближайшем аналоге [5] на поверхность микросфер латекса адсорбированы антигены лептоспир, обладающие родоспецифической активностью при обнаружении противолептоспирозных антител, что не позволяет диагностировать заболевание в первые дни болезни и установить серогрупповую принадлежность этиологического агента.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка диагностикума для тест-системы с целью раннего и быстрого обнаружения антигенов лептоспир и одновременного установления их серогрупповой принадлежности.

Поставленная цель достигается тем, что способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс- агглютинации включает адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микросфер латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривает в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам. В качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом, а в качестве компонента иммунного теста - IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae, которые адсорбируют на упомянутых частицах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3±0,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 4±1^oC и дальнейшей инкубацией смеси при той же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема.

Способ может характеризоваться тем, что упомянутые противолептоспирозные IgG-антитела выделены из гипериммунных сывороток кроликов путем их обработки полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000.

Способ может характеризоваться также тем, что встряхивание проводят в течение 1,5 - 2,0 ч, а также тем, что инкубацию смеси при температуре 4±1^oC проводят в течение 4 сут.

Способ может характеризоваться тем, что центрифугирование проводят при скорости 4000 об/мин в течение 10 - 15 мин трижды, а также тем, что в качестве консерванта используют раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05%.

Существо изобретения состоит в том, что впервые для диагностики лептоспироза предложено адсорбировать на поверхность частиц латекса не антигены лептоспир, а противолептоспирозные антитела класса G (антительный латексный диагностикум - АЛД). Это позволяет не только обнаружить лептоспирозные антигены в моче и крови животных в первые дни инфекции и у бактерионосителей, но одновременно в течение нескольких минут установить серогрупповую принадлежность возбудителя, не прибегая к использованию таких трудоемких методов, как РМА и иммуноабсорбционный тест. Упомянутое дает возможность рекомендовать использование патентуемого диагностикума в тест- системе как экспресс-метода при лептоспирозной инфекции.

Пример реализации
В качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом. Способ их приготовления известен из патента Польши (PL 165456 В1, C 08 F 112/08, оп. 30.12.1994). IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae выделены из гипериммунных сывороток кроликов путем их обработки полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000). Их адсорбируют на микросферах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3 мин с последующим встряхиванием в течение 2 ч при температуре 4^oС. Дальнейшая инкубация полученной смеси проводится в течение 4 сут при той же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием при скорости 4000 об/мин в течение 15 мин трижды. К полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема. В качестве консерванта используют раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05%.

Определение активности и специфичности тест-системы.

Для определения активности полученных АЛД анти-Canicola и анти-Icterohaemorrhagiae по 0,02 мл каждого АЛД смешивали на стекле с равным объемом культуры лептоспир Каширский (серогруппа Canicola) и М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae). Контролем служила 10%-ная водно-сывороточная среда для культивирования лептоспир. В положительном случае визуально регистрировалась агглютинация частиц латекса. Отмечали время появления агглютината.

Установлено, что агглютинация наступала через 2-3 мин при концентрации лептоспир (3 - 4,5)•10⁶ кл/мл только в гомологичных системах. АЛД анти-Canicola не агглютинировал культуру М-20 (lcterohaemorrhagiae) и наоборот.

Для определения специфичности данной тест-системы ставили РЛА с эталонными штаммами патогенных лептоспир 15 серогрупп, которые наиболее часто встречаются на территории нашей страны.

Установлено, что агглютинация АЛД анти-Canicola происходила только в присутствии лептоспир HondUtrecht IV (серогруппа Canicola), а АЛД анти-Icterohaemorrhagiae только при взаимодействии с культурой М-20 (Icterohaemorrhagiae). С лептоспирами других серогрупп реакция была отрицательной. Эти результаты свидетельствуют о том, что приготовленные АЛД обладают серогрупповой специфичностью.

Пример конкретного использования.

Пять белых мышей внутрибрюшинно инфицировали культурой лептоспир Каширский и пять - культурой лептоспир М-20 (Icterohaemorrhagiae). Кровь из сердца инфицированных мышей, взятую при вскрытии животных через 30, 90, 120, 150 мин, засевали в 10%-ную водно-сывороточную среду и исследовали в РЛА, которую ставили следующим образом.

На предметное стекло наносили две капли цитратной крови инфицированной мыши, к каждой из которых добавляли по капле дистиллированной воды. После того, как наступал гемолиз эритроцитов, в одну каплю вносили АЛД анти-Canicola, а в другую - АЛД анти-lcterohaemorrhagiae. Контролем служила капля цитратной крови неинфицированной мыши. Учитывали время появления агглютинации латексных частиц в положительных случаях.

Результаты представлены в таблице.

Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности предложенной тест-системы на основе АЛД анти-Canicola и анти-lcterohaemorrhagiae. Степень чувствительности ее сопоставима с такими методами исследования как микроскопический, встречный иммуноэлектрофорез [6], РСК [7] , РТНГА [8], что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения.

Источники информации
1. Эпидемиология, диагностика, клиника и профилактика лептоспироза. Методические рекомендации МЗ РФ. М., 1987.

2. Chang R. S. , McComb, Erythrocyte sensitizing substance from five strains of leptospirae.//Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1954.- vol.3.- P. 481-489.

3. Sulzer C.R., Jones W.L. Evaluation of a hemogglutination test for human leptospirosis.//Appl. Microbiol- 1973.- vol.26.- P. 655- 657.

4. Erokhin E.P., Sergeev A.A., Lukin Yu.V., et al. Immunodispersive Test-System for diagnosis of leptospirosis.// Leptospirosis. VII Europian and IX USSR leptospirosis research conference. М.- 1991.- P.55-56.

5. Arimitsu Y. , Kobayashi S. , Akama K., Matuhasi T. Development of simple serological method for diagnosing Leptospirosis: a microcapsule agglutination test.//J. of Clinical at Microbiology.- 1982. -vol.l5.-N.5.-P. 835- 841.

6. Adler B., Chappel R., Fain S. The sensitivities of different immunoassay for detecting Leptospiral Antigen.// Zbl.Bakt.Abt. I.A. -1982. -Bd.252. -S.405-413.

7. lankov N., Baltova E., Vassilevska M. Providing the presence of leptospiric antigen in the urina of diseased animals by means of complement fixation test.// Folia Med. -Plovdiv, 1977. - vol. 19. -P.47-49.

8. Бернасовская Е.П., Назарова О.Г., Могирева Л.А. Выявление антигенов лептоспир в биологических жидкостях и окружающей среде. // Лептоспирозы: Тезисы докл. VIII Всесоюзн. конф. по лептоспирозам - Тбилиси, 1983.- С. 270-271.

Изобретение относится к медицине, в частности к ветеринарии, а именно к иммунологии, и может использоваться для диагностики лептоспироза человека и животных. Способ обеспечивает раннее и быстрое обнаружение антигенов лептоспир и одновременное установление их серогрупповой принадлежности. Проводят адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микрокапсул латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривают в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам. В качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом, при этом IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae адсорбируют на упомянутых частицах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3±0,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 4±1^oС и дальнейшей инкубации смеси при этой же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема. 5 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации, включающий адсорбцию одного из компонентов иммунного теста на поверхности микросфер латекса, используемых в качестве носителя, и предусматривающий в процессе приготовления воздействие ультразвуковыми колебаниями на продукты адсорбции с последующими отмывкой центрифугированием, инкубацией в холодильнике, добавлением консерванта и разливкой по флаконам, отличающийся тем, что в качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы, активированные карбодиимидом, а в качестве компонента иммунного теста - IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Сanicola и Icterohaemorrhagiae, которые адсорбируют на упомянутых карбоксилированных частицах латекса путем обработки на ультразвуковой бане в течение 3±0,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 4±1^oС и дальнейшей инкубацией смеси при этой же температуре, затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутые противолептоспирозные IgG-антитела выделены из гипериммунных сывороток кроликов путем их обработки полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что встряхивание проводят в течение 1,5-2,0 ч. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что инкубацию смеси при температуре 4±1^oС проводят в течение 4 суток. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что центрифугирование проводят при скорости 4000 об/мин в течение 10-15 мин трижды. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что в качестве консерванта используют раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05%.