СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, микробиологии и биотехнологии, в частности к способу получения эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к парагриппу-3 крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации.

Парагрипп-3 крупного рогатого скота (ПГ-3 КРС) - остро протекающая, контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания. Болезнь регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное животноводство. Вирус ПГ-3 вызывает заболевание у крупного рогатого скота, поражая 90-100% животных и обусловливая в 20-85% случаев вспышки респираторных болезней.

Существует острая необходимость серодиагностики данного заболевания, т. к. только своевременный эпизоотологический мониторинг ПГ-3 КРС может обеспечить эффективность борьбы с ним, а также при своевременном применении соответствующих мер профилактики и лечения снизить экономический ущерб, причиняемый заболеванием животноводству.

Известен способ серодиагностики ПГ-3 КРС реакцией торможения гемагглютинации (1).

Известны также способы диагностики на ПГ-3 с помощью реакции нейтрализации (рН), реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) (2).

Прототипом для способа изготовления эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к вирусу ПГ-3 КРС послужил способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота (ИРТ КРС).

Сущность способа приготовления эритроцитарного диагностикума для выявления антител к ИРТ КРС состоит в следующем:
- получение вируссодержащей суспензии;
- концентрированно и очистка вирусных белков (получение антигена);
- стабилизация эритроцитов овцы;
- тонизация эритроцитов;
- сенсибилизация эритроцитов антигеном;
- отмывка сенсибилизированных эритроцитов;
- получение готового диагностикума (3).

В задачу наших исследований входило: разработка способа получения эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к вирусу ПГ-3 КРС методом РНГА, обладающего высокой чувствительностью и удобного в работе.

Предложенный способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к ПГ-3 КРС состоит в следующем.

Получают вируссодержащую суспензию на культуре клеток с титром не ниже 5,0 ТЦД₅₀;
В полученную вирусную суспензию добавляют для концентрации белков ПЭГ-6000 в количестве 6-9% от объема вирусной суспензии и оставляют на 24-96 ч при 2-8^oC. Затем центрифугируют при 3000-8000 об/мин от 1 до 2 ч и сливают надосадочную жидкость, а осадок ресуспендируют в фосфатный буферный физиологический раствор ФБФР рН 7,0 -7,7 в объеме, который удовлетворяет концентрированию (если в 10 раз, то в 1/10 первоначального объема вируссодержащей суспензии). Полученную суспензию или обрабатывают ультразвуком от 22 до 44 кГц - 1-5 мин или замораживают-отмораживают 2-5 раз, а затем центрифугируют для освобождения от клеточного дебриса при 3000-5000 об/мин 15-30 мин. Затем отбирают надосадочную жидкость и обрабатывают ее Твином-80 разведенным 1:18 -1: 22, из расчета на 10 мл суспензии - 0,04-0,06 мл Твина-80. Далее выдерживают после перемешивания Твина-80 и вируссодержащей жидкости 15-20 мин и переносят в сосуд с равным количеством эфира, хорошо перемешивают и после расслоения жидкости (но не менее 10 мин) отбирают нижнюю фазу. Для удаления остаточного эфира либо оставляют при 2-8^oС на 1-2 суток, но так, чтобы вирусный препарат был налит тонким слоем, либо пропускают химически неактивные газы (инертные, N₂, и т.д.) примерно 1 ч сквозь вирусный препарат. Затем для удаления гемагглютининов вируса ПГ-3 вирусный препарат замораживают - отмораживают 2-5 раз, проверяют на гемагглютинацию с эритроцитами овцы и, если последняя отсутствует, то антиген используют для сенсибилизации.

При наличии гемагглютинации либо замораживают-отмораживают до 5 раз, либо оставляют на 1-2 недели при +4^oС
Важно подобрать оптимальное разведение антигена для сенсибилизации. Чаще всего это разведение 1: 10-1: 20. Использование же других разведений для сенсибилизации приводит к самоагглютинапии эритроцитов или отсутствию агглютинации с положительной к ПГ-3 КРС сывороткой.

Сенсибилизацию эритроцитов проводят при 50-56^oС за 1 ч 10 мин при рН 6,0-6,6 в водяной бане или термостате при перемешивании через 20-30 мин. Далее сенсибилизированные эритроциты отмывают разбавителем 3-5 раз и в нем же ресуспендируют (разбавителем служит любой инертный белок 0,5-2% в фосфатном буферном физиологическом растворе (ФБФР) рН 7,00-7,65).

Ставят контроли на отсутствие агглютинации с разбавителем, с отрицательной сывороткой и контроль на агглютинацию с положительной сывороткой. Полученный диагностикум должен не давать гемагглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и иметь титр с положительной сывороткой от 1:128 до 1:65536 и более.

Пример 1
Получают вирусную суспензию, содержащую вирус ПГ-3 КРС на культуре клеток Таурус-1 (Т-1) с титром вируса 6,51 g, концентрируют и очищают вирусные белки, проводят разрушение гемагглютининов замораживанием - оттаиванием 2 раза и получают антиген, который дает гемагглютинацию стабилизированных эритроцитов овцы 1:4. Этот антиген оставляют на 2 недели при +4^oС, при этом оставшиеся гемагглютинины разрушаются. Эритроциты овцы стабилизируют и тонизируют.

Антиген разбавляют 1:6, 1:10, 1:20, 1:30 и в буфере 0,15 М ФБФР рН 6,40, проводят сенсибилизацию, объединяя равные объемы разбавленного антигена и 3%-ных эритроцитов в том же буфере при 56^oС 1 ч 20 мин, перемешивая каждые 25 мин. Центрифугируют при 1,5 тыс. об/мин 15 мин и далее отмывают эритроциты разбавителем 4 раза при тех же условиях центрифугирования и ресуспендируют в разбавителе до 3%-ной концентрации. С полученными диагностикумами ставят контроли с разбавителем, отрицательной и положительной сыворотками.

Диагностикум, приготовленный с антигеном, разбавленным 1:6, дает агглютинацию с разбавителем и отрицательной сывороткой и является непригодным для применения; диагностикум, приготовленный с антигеном, разбавленным 1:10, не дает агглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:4096; диагностикум, приготовленный с антигеном, разбавленным 1: 20, не дает агглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр 1:16384; а диагностикум, приготовленный с использованием антигена 1:30, не дает агглютинации с разбавителем, отрицательной сывороткой и положительной сывороткой и является непригодным.

В качестве наиболее оптимального разведения антигена для сенсибилизации эритроцитов для производства экспериментальной партии выбирают разведение антигена 1:20, сенсибилизацию проводят при тех же условиях, что и пробную, и получают диагностикум для выявления антител в сыворотке крови к ПГ-3 КРС, который не дает агглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:16384.

Пример 2
Способ получения диагностикума осуществляют аналогично примеру 1, но титр вируса составляет 7,0 lg, замораживание-отмораживание проводят 5 раз, после чего полученный антиген не дает гемагглютинации с эритроцитами овцы, сенсибилизацию эритроцитов антигеном производят при 54^oС 1 ч 30 мин и отмывают разбавителем 5 раз.

Полученный диагностикум не дает гемагглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:65536.

Пример 3
Способ получения осуществляют аналогично примеру 2, но сенсибилизацию проводят при температуре 50^oС 2 ч.

Полученный диагностикум не агглютинирует с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:1024.

Пример 4
Способ получения осуществляют аналогично примеру 2, но сенсибилизацию выполняют в буфере pH 6,23.

Полученный диагностикум не дает гемагглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:128.

Пример 5
Способ получения осуществляют аналогично примеру 2, но титр вирусной суспензии составлял 5,6 lg ТЦД₅₀, наиболее подходящим разведением антигена является разведение 1:10, что устанавливают после пробной сенсибилизации.

Полученный диагностикум не дает агглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:16384.

Пример 6
Способ получения осуществляют аналогично примеру 2, но сенсибилизацию проводят при температуре 58^oС.

Полученный диагностикум не дает агглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:32768.

Пример 7
Способ получения осуществляют аналогично примеру 1, но антиген замораживают-отмораживают 3 раза, после чего оставшиеся гемагглютинины разрушаются при хранении 1,5 недели, сенсибилизацию проводят в буфере рН 6,65, а отмывают диагностикум 5 раз разбавителем.

Полученный диагностикум не дает агглютинации с разбавителем и отрицательной сывороткой и имеет титр с положительной сывороткой 1:8192.

Получение диагностикума с титром менее 1:128 не целесообразно, поскольку при хранении титр может снизиться на одно-два разведения, что сделает диагностикум не пригодным для использования.

Диагностикум, полученный предложенным способом, апробирован нами с положительным результатом с 2000 по 2002 г.г. в лабораторных условиях.

Диагностикум является высокочувствительным, высокоспецифичным и удобен к использованию, поэтому найдет применение для диагностики ПГ-3 КРС.

Применение диагностикума, полученного предложенным способом, позволяет значительно сократить время реакции и получить более достоверные результаты при учете, а так как он является очень удобным в применении, то в отличие от известных способов диагностики ПГ-3 КРС значительно облегчает диагностику последнего.

Источники информации:
1. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник/ В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: Агропромиздат; 1991, стр.201.

2. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник/ В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Р.В. Соловьев, Н.В. Фомина. - М.: Агропромиздат, 1986, стр.266-269.

3. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора эритроцитарного диагностикума для серодиагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации. Утверждено ГУВ Госагропрома СССР 16 февраля 1987 года, 32 стр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к ветеринарной вирусологии, микробиологии и биотехнологии, и касается способа получения эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к вирусу парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации. Сущность способа состоит в том, что после концентрирования и очистки вирусных белков проводят разрушение гемагглютининов путем двух-, трехкратного замораживания-оттаивания до получения негемагглютинирующего эритроциты овцы раствора вирусных белков, сенсибилизацию проводят при 50-56^oС в течение от 1 ч 20 мин до 2 ч при рН = 6,0-6,6 при перемешивании смеси через каждый 20-30 мин, и полученный диагностикум соответствует титру с положительной сывороткой от 1:128 до 1: 65536. Техническим результатом является сокращение времени реакции при проведении серодиагностики парагриппа-3 и получение более достоверных результатов.

Способ получения эритроцитарного диагностикума для обнаружения антитела к вирусу парагриппа-3 крупного рогатого скота, включающий получение вируссодержащей суспензии, концентрирование и очистку вирусных белков, стабилизацию эритроцитов, танизацию эритроцитов, подбор оптимального разведения антигена для сенсибилизации, сенсибилизацию эритроцитов, отмывку эритроцитов и получение готового диагностикума, отличающийся тем, что после концентрирования и очистки вирусных белков проводят разрушение гемагглютининов путем двух-, трехкратного замораживания-оттаивания до получения негемегглютинирующего эритроцита овцы раствора вирусных белков, сенсибилизацию проводят при 50-56^oС в течение от 1 ч 20 мин до 2 ч при рН 6,0-6,6 при перемешивании смеси через каждые 20-30 мин, полученный диагностикум используют в реакции непрямой гемагглютинации, при этом титр с положительной сывороткой соответствует значениям от 1: 128 до 1: 65536.