БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КОСМЕТИЧЕСКИХ ДЕФЕКТОВ КОЖИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2006 года по МПК A61K35/36 C12N5/08 A61P17/02 

Изобретение касается получения культур генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), фибробластов и способа лечения косметических дефектов кожи.

Несмотря на большое внимание специалистов к решению проблем, связанных с регенерацией кожных покровов, появление все большего количества фармацевтических средств, вопрос о восстановлении нормальной кожи до сих пор остается открытым. К косметическим дефектам кожи относятся постакне, морщины, рубцы, раны, ожоги, язвы и инволютивные изменения кожи.

Постакне - собирательное понятие, объединяющее комплекс стойких изменений кожи, являющихся следствием длительно существующей угревой сыпи и себореи, а также манипуляций, проводимых для лечения этих заболеваний. К постакне относятся: расширение пор; неравномерная текстура кожи; рубцы; застойные пятна; поствоспалительная гипер- и депигментация; стойкая эритема и расширение капилляров. Рубцы относятся к наиболее тяжело поддающимся коррекции последствиям акне, тем более что причиной возникновения, наряду с воспалительным процессом в дерме, служат разнообразные косметические манипуляции, например, электрокоагуляция воспаленных элементов, вскрытие закрытых комедонов иглой и т.д. Косвенно усиливает процесс рубцевания бесконтрольное проведение грубых механических чисток, так как при этом происходит сдавливание всех слоев кожи, нарушается микроциркуляция и, следовательно, интенсивность репаративных процессов. Рубцы после акне чаще всего атрофические, реже - гипертрофические или келоидные.

Длительное заживление ран, возникших в результате травм, операций, ожогов, ятрогенных факторов, персистирующих язв, в том числе трофических, является большой проблемой для последующего лечения. В результате возможно возникновение травмирующих рубцов, зачастую нарушающих функцию тканей и являющихся косметическим дефектом, что заставляет пациентов прибегать к услугам пластической хирургии.

Коррекция такого косметического дефекта, как рубцы, представляет очень сложную задачу. Как правило, для этого используются химические пилинги различной глубины, лазерная или механическая дермабразия, средние пилинги [Лапутин Е., 1999].

В любом случае, учитывая высокий риск осложнений после этих агрессивных манипуляций, необходимо уделить большое внимание программе грамотной и своевременной реабилитации кожи. Для уменьшения синюшной или багрово-красной окраски рубцов применяются препараты, содержащие ихтиол, изопропиловый спирт, L-аскорбиновую кислоту в концентрации 10-15%. Для размягчения склерозированных капсул кист используются растворы, содержащие высококонцентрированные экстракты арники, ромашки, гамамелиса в сочетании с глубоким массажем.

Применение вышеописанных методик не позволяет говорить о стопроцентном восстановлении кожи. Очень важно знать, что выравнивание рубцов занимает от нескольких месяцев до нескольких лет.

Биологический процесс старения кожи начинается уже с 20 лет. Вначале появляются мимические морщины. Постепенно кожа теряет свои структурные компоненты. Глубокие и мимические морщины достигают уровня дермы, и их глубина превышает 0,5 микрона. Морщины типа "гусиные лапки", морщины вокруг губ, носа и между бровями начинают углубляться. Кожа теряет свою эластичность, и лицо постепенно теряет свои прежние очертания.

Кожа быстрее стареет вследствие действия значительного числа вредных раздражителей, влияющих на поверхность кожи (солнечный свет, механические раздражители, вредные вещества в воздухе, климатические колебания), или по причине гормональных изменений в организме.

В настоящее время исследователи различают "внутреннее" и "внешнее" старение. Как любой другой орган человеческого организма, кожа подвержена биологическому "внутреннему старению". Известно, что с возрастом в коже снижается скорость деления клеток базального слоя, приводя к замедлению обновления эпидермиса, снижается синтез гликозаминогликанов и коллагена фибробластами, уменьшается слой гиподермы, снижается микроциркуляция и капиллярогенез, ухудшая трофику тканей. Кожа теряет тургор, становится сухой, появляется чувство "стянутости", появляются морщины.

В отличие от биологического старения, "внешнее старение" (его называют "световым старением кожи") вызвано, прежде всего, чрезмерным УФ-облучением.

Борьба с возрастными изменениями, а также восстановление нормального кожного покрова в целом, включает целый комплекс мероприятий по уходу, начиная с массажей, применения питательных и увлажняющих кремов, масок, заканчивая пилингами, дермабразией, введением имплантатов, пластической хирургией. Основная проблема подобного лечения заключается в том, что все методы, в конечном счете, направлены на стимуляцию собственных клеток организма, а с возрастом количество активных клеток неизбежно уменьшается, что приводит к снижению эффективности процедур.

Показана возможность заживления ран с использованием заместительной клеточной терапии [Limat A., Hunziker Т., Cells Tissues Organs. 2002, Boss WK Jr, Usal H, Chernoff Г, Keller GS, Lask GP, Fodor PB. Clin Plast Serg. Oct 2000].

Некоторые авторы говорят о том, что раны после дермабразии лучше заживают при внесении замороженных аутологичных фибробластов [Arambula H, Sierra-Martinez E, Gonzalez-Aguirre NE, Rodrigues-Perez A, Juarez-Aguilar E, Marsch-Moreno M., Kuri-Harcuch W. 1999].

Показана эффективность применения аллогенных фетальных фибробластов и стромальных клеток костного мозга при терапии глубоких ожоговых ран [Шумаков В.И. и соавторы, 2002].

Задачей настоящего изобретения является получение гомогенных культур немодифицированных мезенхимальных клеток (МСК), фибробластов, в том числе эпителиальных клеток и способа лечения косметических дефектов кожи.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом.

Предложен биотрансплатат для лечения косметических дефектов кожи, содержащий суспензию культуры фибробластов, в том числе эпителиальных клеток, полученную из кожи эмбрионов на 5-8 неделе гестации или кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций, биопсий, липоаспиратов.

Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения косметических дефектов кожи, заключается в том, что кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают, далее кожу или липоаспират ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях СО₂ при температуре 37°С, полученную суспензию клеток разводят солевым раствором Хэнкса в соотношении 1:1, центрифугируют при 1000 об/мин, в течение 5 минут, и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки и 2 мМ глутамина, затем суспензию высевают при плотности посева 500-1000 тысяч клеток на 1 см² и культивируют до формирования конфлюентного монослоя.

Предложен также биотрансплантат для лечения косметических дефектов кожи, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют: костный мозг, тимус, печень или жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского, в том числе и аутологичного, материала используют: костный мозг, тимус, печень или жировую ткань.

Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру.

Биотрансплантат содержит клеточную культуру криоконсервированную, с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксид.

Предложен также способ лечения косметических дефектов кожи с использованием ранее указанных клеточных биотрансплантов, которые вводят местно, с помощью внутрикожных инъекций.

В случае морщин со сформировавшимся дном обкалывание производят внутрикожно, при этом вколы проводят по дну морщины с шагом 5 мм на глубину 1 мм, затем, отступив на 3 мм от этой линии вколов с двух сторон, производят вколы с шагом 5 мм, в шахматном порядке относительно вколов в дно морщины на глубину 1-2 мм.

В случае глубоких морщин введение биотрансплантата осуществляют тоннельным способом, при этом: вкол производят внутрикожно параллельно ходу морщины, на вколе вводят препарат для гидравлического распределения клеток в дерме.

В случае рубцовых депрессий (атрофических рубчиков, постакне), нарушения рельефа препарат вводят микропапульным способом, при этом вкол производят в область депрессии, при формировании папулы "минус" ткань приподнимается до уровня остальной кожи, выравнивая рельеф.

В случае сниженного тонуса кожи, пастозности, наличия зияющих пор препарат вводят по классической методике - строчная техника, при этом вколы производят на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 8-10 мм, расстояние между линиями 10 мм, процедуры проводят 1 раз в 2 недели, в среднем проводят около 3 процедур.

Кроме того, биотрансплантат вводят в физиологическом растворе в концентрации от 1 до 10 млн. клеток на 1 мл при общем количестве трансплантата от 1 до 10 мл, в зависимости от площади дефекта.

Эпителиальные клетки кожи (кератиноциты) получают из кожи эмбрионов на сроках I-II триместра беременности; кожи взрослого человека, полученных в результате пластических операций или биопсий. Кожу с содержащимися в ней волосяными фолликулами отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе диспазы в течение 40 минут в условиях CO₂ инкубатора при температуре 37°С. Из них выделяют эпителий и фолликулы, разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000 × об/мин, 5 минут, и ресуспендируют в ростовой среде 199 и помещают в пластмассовые, покрытые коллагеном или гидрофильные чашки на из расчета не менее 70000-100000 на 1 см². Сменяют среду каждые 3 дня до формирования конфлюентного монослоя.

Фибробласты получают из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов. Кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях CO₂ инкубатора при температуре 37°С. Липоаспират ферментативно дезагрегируют аналогично. Суспензию клеток разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000 × об/мин, 5 минут, и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки, 2 мМ глутамина. Суспензию высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 500-1000 тысяч клеток на 1 см².

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80%.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Расчет использования препарата: на морщину со сформировавшимся дном носогубной складки - 1,5 мл, на каждый вкол не больше 0,1 мл, в среднем на лицо и область декольте расходуется 5 мл препарата. В случае обширной заинтересованной области, ее необходимо делить на зоны, например, зона наружного угла глаза и носогубного треугольника и зона лба и щек. Тогда, на одной неделе производится введение препарата в зону наружного угла глаза и носогубного треугольника, а на следующей - в зону лба и щек (интервал между введением в одну и ту же зону сохраняется - 2 недели).

Биотрансплантаты, содержащие предложенные культуры клеток с последующей ферментативной дезагрегацией тканей и режима культивирования, обеспечивают большое количество гомогенных клеток для трансплантации и высокую воспроизводимость результатов лечения.

Изобретение относится к медицине и биофармакологии. Биотрансплантат для лечения косметических дефектов кожи содержит культуру генетически немодифицированных мезенхимальных клеток (МСК), фибробластов, в том числе эпителиальных клеток. Биотрансплантат предназначен для внутрикожного введения. Биотрансплантат вводится в физиологическом растворе в концентрации от 1 до 10 млн клеток на 1 мл местно, общее количество трансплантата от 1 до 10 мл, в зависимости от площади дефекта. Изобретение обеспечивает высокую воспроизводимость результатов лечения. 4 н. и 10 з.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения косметических дефектов кожи, характеризующийся тем, что он содержит суспензию культуры фибробластов, в том числе эпителиальных клеток, полученную из кожи эмбрионов на 5-8 недели гестации или кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций, биопсий, липоаспиратов.2. Биотрансплантат по п.1, содержит свежеприготовленную культуру.3. Способ получения биотрансплантата для лечения косметических дефектов кожи, характеризующийся тем, что кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают, далее кожу или липоаспират ферментативно дезагрегируют в 0,25%-ном растворе трипсина в течение 40 мин в условиях СО₂ при температуре 37°С, полученную суспензию клеток разводят солевым раствором Хэнкса в соотношении 1:1, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки и 2 мМ глутамина, затем суспензию высевают при плотности посева 500-1000 тысяч клеток на 1 см² и культивируют до формирования конфлюентного монослоя.4. Биотрансплантат для лечения косметических дефектов кожи, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферрин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.5. Биотрансплантат по п.4, в качестве фетального материала используют костный мозг, тимус, печень или жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.6. Биотрансплантат по п.4, в качестве донорского, в том числе и аутологичного, материала, используют костный мозг, тимус, печень или жировую ткань.7. Биотрансплантат по п.4 содержит свежеприготовленную культуру.8. Биотрансплантат по п.4 содержит клеточную культуру криоконсервированную с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида.9. Способ лечения косметических дефектов кожи, характеризующийся тем, что клеточный биотрансплантат по п.1 или 4 вводят местно с помощью внутрикожных инъекций.10. Способ лечения по п.9, характеризующийся тем, что в случае морщин со сформировавшимся дном обкалывание производят внутрикожно, при этом вколы проводят по дну морщины с шагом 5 мм на глубину 1 мм, затем, отступив на 3 мм от этой линии вколов с двух сторон, производят вколы с шагом 5 мм в шахматном порядке относительно вколов в дно морщины на глубину 1-2 мм.11. Способ лечения по п.9, характеризующийся тем, что в случае глубоких морщин введение биотрансплантата осуществляют тоннельным способом, при этом вкол производят внутрикожно параллельно ходу морщины, на вколе вводят препарат для гидравлического распределения клеток в дерме.12. Способ лечения по п.9, характеризующийся тем, что в случае рубцовых депрессий (атрофических рубчиков, постакне), нарушения рельефа препарат вводят микропапульным способом, при этом вкол производят в область депрессии, при формировании папулы "минус" ткань приподнимается до уровня остальной кожи, выравнивая рельеф.13. Способ лечения по п.9, характеризующийся тем, что в случае сниженного тонуса кожи, пластозности, наличия зияющих пор препарат вводят по классической методике - строчная техника, при этом вколы производят на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 8-10 мм, расстояние между линиями 10 мм, процедуры проводят 1 раз в 2 недели, в среднем проводят около 3 процедур.14. Способ лечения по п.10, характеризующийся тем, что биотрансплантат вводят в физиологическом растворе в концентрации от 1 до 10 млн. клеток на 1 мл при общем количестве трансплантата от 1 до 10 мл в зависимости от площади дефекта.