СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ БИОМАССЫ ЛАКТО- И БИФИДОБАКТЕРИЙ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 

Изобретение относится к области микробиологии и медицинской промышленности и, в частности, может быть использовано в производстве пробиотических препаратов: лактобактерина, бифидумбактерина, ацилакта и др.

Известен способ получения сухой биомассы бактерийных культур с помощью лиофильного высушивания, применяемый в производстве пробиотиков и обеспечивающий сохранение их биологической активности на протяжении срока годности [Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. - Киев: Наукова думка, 1985. - 206 с]. Для защиты клеток от неблагоприятного воздействия замораживания и обезвоживания, а также для получения необходимой структуры сухой биомассы применяют различные защитные среды. Эти среды должны обеспечивать био- и структуропротективный эффект, позволяющий получать препараты в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах), отвечающие регламентированным требованиям по биологическим и физическим свойствам [ФС 42-0054-00 "Лактобактерин сухой", ФС 42-3947-00 "Бифидумбактерин сухой"]. В производственной практике по выпуску пробиотиков для приготовления защитных сред используют обезжиренное молоко, желатин, крахмал, различные углеводы и ряд других компонентов [Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. - Киев: Наукова думка, 1985. - 206 с]. Наиболее распространенным вариантом защитной среды является сахарозо-желатозо-молочная среда, адаптированная к условиям массового производства пробиотиков и характеризующаяся универсальностью применения при изготовлении лакто- и бифидосодержащих препаратов [ФС 42-0054-00 "Лактобактерин сухой", ФС 42-3947-00 "Бифидумбактерин сухой"]. К недостаткам указанной среды следует отнести использование дорогостоящих компонентов: желатина, сахарозы.

Сущность изобретения заключатся в комплексном использовании дрожжевого аутолизата в составе питательных и защитных сред. При использовании казеиново-дрожжевых сред для накопления биомассы производственных штаммов бактерий основным компонентом питательной основы является дрожжевой аутолизат. Этот компонент получают путем автолиза дрожжей хлебопекарских (ТУ9182-007-00353595-2002 или ТУ 9182-005-00353595-2001) при температуре 60°С в течение 2-3 суток [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.И.Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.]. Нативный дрожжевой аутолизат представляет собой вязкую жидкость коричневого цвета, которую разбавляют водой и сепарируют для отделения клеточной стромы (отход производства), а полученный продукт используют для приготовления питательных сред. Однако состав и физические свойства нативного дрожжевого аутолизата определяют возможность его применения в качестве протектора при лиофилизации бактерийных культур. Использование дрожжевого аутолизата в составе защитных сред позволяет исключить или снизить расход дорогостоящих компонентов (желатин, сахароза) при высушивании лакто- и бифидосодержащих препаратов. Варианты защитных сред на основе дрожжевого аутолизата не уступают по эффективности регламентированным сахарозо-желатозо-молочным средам (см. табл.).

Достигаемый технический результат заключается в унификации сырья и процесса приготовления питательных и защитных сред, в удешевлении способа получения пробиотиков, что позволяет повысить эффективность их производства.

При осуществлении способа производства могут быть использованы обычные условия получения нативного дрожжевого аутолизата. Количество аутолизата, добавляемого в бактериальную взвесь, составляет (15±10)% от объема получаемой бактериальной суспензии и определяется наличием и количеством других применяемых компонентов комплексной защитной среды, а также видом бактерий и режимом лиофилизации. Добавление менее 5% аутолизата предполагает значительное увеличение количества других компонентов защитной среды. Добавление более 25% аутолизата аутолизата нерационально, т.к. не вызывает увеличения биопротективного и структурообразующего эффекта. Регламентированное количество защитной среды в бактериальных суспензиях составляет (25±15)%, что позволяет на фоне получаемого протективного эффекта избежать значительного снижения исходной концентрации жизнеспособных клеток до лиофилизации. В качестве универсального производственного варианта защитной среды на основе дрожжевого аутолизата может быть использован состав, содержащий обезжиренное молоко и дрожжевой аутолизат в соотношении 1:(1-0,5) и добавляемый в количестве (30±10)% от объема бактериальной суспензии.

Пример 1. Бактериальную взвесь штамма Lactobacillus plantarum 8Р-А3 получают путем культивирования в реакторе на казеиново-дрожжевой среде при температуре 37°С в течение (7±1) ч. К 10 л бактериальной взвеси, содержащей 1,2×10¹⁰ КОЕ/мл, добавляют 2,5 л нативного дрожжевого аутолизата и 2,5 л обезжиренного молока. Полученную бактериальную суспензию разливают по 3 мл во флаконы и замораживают при температуре -50°С в течение 24 ч. Сублимационное высушивание проводят по регламентированному режиму сушки лактобактерина. Общая продолжительность высушивания составляет 50 ч. Содержание живых клеток в регидратированной до исходного объема сухой биомассе составляет 5×10⁹ КОЕ/мл. Количество образцов, имеющих дефект структуры сухой биомассы и не отвечающих требованиям к лактобактерину по физическим свойствам, составляет не более 8% от общего количества флаконов.

Пример 2. Бактериальную взвесь штамма Bifidobacterium bifidum №1 получают путем культивирования в реакторе с применением казеиново-дрожжевой среды при температуре 38°С в течение (18±2) ч. К 7 л бактериальной взвеси, содержащей 5×10⁸ КОЕ/мл, добавляют 2 л обезжиренного молока и 1 л нативного дрожжевого аутолизата. Полученную бактериальную суспензию разливают по 2 мл во флаконы и замораживают при температуре -40°С в течение 16 ч. Сублимационное высушивание проводят по регламентированному режиму сушки бифидумбактерина. Общая продолжительность высушивания составляет 44 ч. Содержание живых клеток в регидратированной до исходного объема сухой биомассе составляет 2×10⁸ КОЕ/мл. Количество образцов сухой биомассы во флаконах, имеющих дефекты структуры и не соответствующие требованиям к бифидумбактерину по физическим свойствам, составляет не более 4% от общего количества флаконов.

Предлагаемый способ получения сухой лиофилизированной биомассы лакто- и бифидобактерий обладает выраженными техническими и экономическими преимуществами, позволяющими снизить стоимость защитных сред, применяемых в производстве пробиотических препаратов, в 2-5 раз.

Таблица
Эффективность защитных сред для лиофилизации лакто- и бифидобактерийНаименование препаратаВиды защитных средСохранение жизнеспособных клеток, %Количество образцов, имеющих дефект структуры сухой биомассы, %ЛактобактеринРегламентированная (сахарозо-желатозо-молочная)50±205±3 Предлагаемая (молочно-дрожжевая)50±205±3БифидумбактеринРегламентированная (сахарозо-желатозо-молочная)60±104±2 Предлагаемая (молочно-дрожжевая)60±104±2

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов: лактобактерина, бифидумбактерина, ацилакта и др. Изобретение предусматривает комплексное использование нативного дрожжевого аутолизата в составе питательных и защитных сред для лиофилизации в количестве 5-25% от объема бактериальной суспензии. Защитная среда содержит обезжиренное молоко и нативный дрожжевой аутолизат, взятые в соотношении 1:(0,5-1). Изобретение обеспечивает унификацию сырья и процесса приготовления питательных и защитных сред, удешевление способа получения пробиотиков, повышает эффективность их производства. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения сухой лиофилизированной биомассы лакто- или бифидобактерий, включающий глубинное культивирование производственных штаммов с использованием казеинодрожжевых сред, последующее смешивание бактериальной взвеси с защитной средой и лиофильное высушивание бактериальной суспензии, отличающийся тем, что в качестве компонента защитной среды используют нативный дрожжевой аутолизат в количестве (15±10)% от объема бактериальной суспензии.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве защитной среды используют обезжиренное молоко и нативный дрожжевой аутолизат, взятые в соотношении 1:(0,5-1), в количестве 20-40% от объема бактериальной суспензии.