ОПУХОЛЬ-АДРЕСОВАННЫЙ ПЕПТИД Российский патент 2006 года по МПК C07K7/08 

Описание патента на изобретение RU2273644C2

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно - к получению с помощью фагового дисплея пептидов, специфически взаимодействующих с аденокарциномой легких.

В последние годы с помощью селекции фаговых библиотек против очищенных клеточных маркеров, культур клеток и даже in vivo на животных удалось идентифицировать целый ряд пептидов, специфичных в отношении тех или иных клеток [1]. Ранние работы в этой области касаются выделения пептидных лигандов для интегринов, представляющих класс гетеродимерных белков клеточной адгезии, выполняющих многие важные биологические функции, такие как рецепция матриксных белков и факторов роста, иммунологический контроль и др. [2]. Было показано, что пептиды, селектированные на очищенных интегринах, могут использоваться для избирательного связывания с клетками-мишенями. Селекция фаговых библиотек по связыванию с интактными клетками имеет ряд преимуществ, так как не требуется информация о предполагаемых рецепторах. Впервые этот подход был использован для выделения 20-мерного пептида, связывающегося с фибробластами [1]. Группа Ruoslahti из La Jolla Cancer Research Center разработала систему селекции in vivo, позволяющую выделять из пептидной фаговой библиотеки фаги, избирательно связывающиеся с различными органами и тканями [3]. Было показано, что органоспецифические фаги связываются с соответствующим органом в 4-9 раз лучше, чем в контроле. Органоспецифические фаги идентифицированы для легких, кожи, поджелудочной железы, тонкого кишечника, матки, надпочечников и сетчатки. При этом установлено, что фаг, связывающийся с легочной тканью, обладал наибольшей селективностью - в 35 раз больше, чем неселективный фаг [4].

Исследуя первичные структуры этих пептидов и получая в дальнейшем химическим синтезом такие пептиды, можно создавать конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, используемыми в настоящее время при терапии рака. Это позволит повысить эффективность доставки препаратов в опухолевую ткань и уменьшить их токсическое воздействия на здоровые ткани, а также использовать для диагностики опухолей и их метастазов с большей точностью и эффективностью.

Адресная доставка лекарственных препаратов к опухолям возможна пока лишь в некоторых случаях и ограничивается использованием моноклональных антител, причем с переменным успехом [5, прототип]. Одним из главных ограничений применения антител для диагностики опухолей в клинике является плохое поглощение и распределение антител в опухолях. Это обусловлено главным образом физиологическими факторами (неравномерным кровотоком и интерстициальной гипертензией), а также большими размерами молекул антител [6].

Один из путей преодоления этой проблемы состоит в использовании опухоль-специфичных лигандов небольшого размера. Малые молекулы часто имеют более высокие коэффициенты проницаемости и интерстициальной диффузии и способны проникать в опухоли более глубоко. Принципиально новый подход к решению проблемы адресованной химиотерапии опухолей состоит в использовании фаговых пептидных библиотек, включающих в себя набор статистических пептидов, экспонированных в составе одного из поверхностных белков нитчатых бактериофагов.

Технической задачей изобретения является поиск опухоль-специфических пептидов, взаимодействующих с аденокарциномой легкого с помощью фаговых пептидных библиотек.

Поставленная цель достигается путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а.о, тех пептидов, которые способны специфично накапливаться в аденокарциноме легких. Пептиды в библиотеке экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида [7].

Метод аффинной селекции in vivo заключается в следующем. Фаговую библиотеку в количестве 1013 фаговых частиц (TU - трансдуцирующих единиц) вводят в хвостовую вену мыши с привитой аденокарциномой легкого. Через несколько минут мышь усыпляют и выделяют ткань, на которую ведут селекцию. Ткань гомогенизируют, отмывают от несвязавшихся фагов, а связавшиеся фаги после амплификации в E.coli повторно вводят мышам. После нескольких таких раундов из библиотеки отбираются фаги, экспонирующие на своей поверхности ткане-специфичные пептиды [3]. Обогащение фаговой популяции определяют по увеличению выхода фагов после каждого раунда селекции. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после 1, 2, 3-го раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют их специфичность. Для подтверждения ткане-специфичности отдельных фаговых популяций, полученных после аффинной селекции, фаги вводились мышам на 24 часа. После чего в органах и тканях определялось количество накопившихся фагов (Tu/мг ткани)[8].

По результатам скрининга отбирают фаги, наиболее активно накапливающиеся в опухоли. Аминокислотный состав специфичных к опухоли пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [9] в кодирующей пептид области.

Для практического использования селектированные таким образом пептиды-миметики можно получать химическим синтезом и создавать на их основе конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, которые разрешены для терапии онкологических заболеваний, включать в состав липосомальных препаратов. А также создавать конъюгаты с радиоактивными изотопами для использования как в терапии, так и диагностике опухолей и их метастазов.

Сущность изобретения заключается в том, что селектированные из фаговой пептидной библиотеки пептиды, аминокислотные последовательности которых приведены на фиг.2, обладают свойством избирательно накапливаться в аденокарциноме легких.

Таким образом, впервые получены пептиды, избирательно накапливающиеся в аденокарциноме легких. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Скрининг индивидуальных фаговых клонов на мышах с привитой аденокарциномой легких. В качестве отрицательного контроля взят фаг fuse2, который не экспонирует рандомизованный пептид.

Фиг.2. Аминокислотные последовательности пептидов, экспонированные на поверхности фагов.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, накапливающихся в аденокарциноме легких.

Первый раунд аффинной селекции фаговой библиотеки проводят по следующей схеме [3]. Мышам линии A/Sn с привитой подкожно аденокарциномой легких, которая достигла размера ˜1 см, вводят в хвостовую вену пептидную фаговую библиотеку 1014 трансдуцирующих единиц в 200 мл DMEM. Через 5 минут мышь усыпляют эфиром. Опухоль удаляют, взвешивают и гомогенизируют в 1 мл DMEM-PI (DMEM, содержащая ингибиторы протеаз: PMSF 1 mM, aprotinin 20 мкг/мл, leupeptin 1 мкг/мл). Опухоль трижды промывают DMEM-PI (4°С), содержащей 1% BSA и инкубируют с 1 мл компетентной культурой E.coli 1 час. Добавляют 10 мл питательной среды YT×2, содержащей 0,2 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют, перемешивая, при 37°С 1 час. 200 мкл смеси переносят на чашку Петри с агаром, содержащим 40 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют ночь при 37°С. Колонии смывают 1 мл YT×2, содержащей 20 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в 5 мл, перемешивая 16 часов при 37°С. Выделяют фаг и проводят второй и третий раунды аффинной селекции, как описано выше. Фаги титруют с использованием клеток К91Каn, выращенных на ТВ-среде, с последующим высевом на чашки с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл), титр фагов определют по числу колоний (трансдуцирующих единиц (TU)) по G.P.Smith [5]. Количество фаговых частиц рассчитывают по формуле 1 TU=20 вирионов.

После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для имммуноферментного анализа (ИФА). Определение последовательности ДНК проводят по модифицированному методу Сэнгера [9]. В качестве праймера используют олигонуклеотид 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [7].

Пример 2. Скрининг индивидуальных фаговых клонов на мышах линии СВА с привитой аденокарциномой легких.

Мышам линии СВА с привитой подкожно аденокарциномой легких, которая достигла размера ˜1 см, вводят в хвостовую вену фаг в количестве 109 трансдуцирующих единиц в 500 мл DMEM. Через 24 часа мышь усыпляют эфиром. Опухоль и контрольные органы (мышца, легкое и др.) удаляют, взвешивают и гомогенизируют в 1 мл DMEM-PI (DMEM, содержащая ингибиторы протеаз: PMSF 1 mM, aprotinin 20 мкг/мл, leupeptin 1 мкг/мл). Опухоль и контрольные органы трижды промывают DMEM-PI (4°С), содержащей 1% BSA, и инкубируют с 1 мл компетентной культурой E.coli 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 3 мл питательной среды YT×2, содержащей 0,2 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют, медленно перемешивая, при 37°С 20 мин. Образцы охлаждают до 4°С, отбирают аликвоты по 5 мкл и 50 мкл и высевают на чашки Петри с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл). Через 16 часов подсчитывают выросшие колонии и вычисляют количество фаговых частиц, содержащихся в 1 мг исследуемой ткани.

Таким образом, получены специфичные пептиды, избирательно накапливающиеся в аденокарциноме легких, которые могут быть успешно использованы в терапии и диагностике злокачественных новообразований у онкологических больных.

Похожие патенты RU2273644C2

название год авторы номер документа
ОПУХОЛЬ-АДРЕСОВАННЫЙ ПЕПТИД 2003
  • Некрасов Б.Г.
  • Кувшинов В.Н.
  • Ушакова Т.А.
  • Каледин В.И.
  • Николин В.П.
  • Туманова О.Ю.
  • Ильичев А.А.
  • Сандахчиев Л.С.
RU2265027C2
ОПУХОЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ПЕПТИД ДЛЯ АДРЕСНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА 2015
  • Васькова Анна Андреевна
  • Кулигина Елена Владимировна
  • Макарцова Анна Александровна
  • Коваль Ольга Александровна
  • Рихтер Владимир Александрович
RU2595404C1
ПЕПТИД-ИМИТАТОР ЭПИТОПА БЕЛКА gp120 ВИЧ-1 2000
  • Туманова О.Ю.
  • Кувшинов В.Н.
  • Некрасов Б.Г.
  • Михайлова В.К.
  • Ильичев А.А.
  • Сандахчиев Л.С.
RU2184780C2
ПЕПТИД-ИМИТАТОР КОНСЕРВАТИВНОГО ЭПИТОПА БЕЛКА GP41 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ТИПА 1, УЗНАВАЕМОГО ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ 2F5 (ВАРИАНТЫ) 2000
  • Туманова О.Ю.
  • Кувшинов В.Н.
  • Меламед Н.В.
  • Ушакова Т.А.
  • Машарский А.Э.
  • Ильичев А.А.
  • Климов Н.А.
  • Козлов А.П.
  • Сандахчиев Л.С.
RU2179980C2
ПЕПТИД-ИММУНОМИМЕТИК ХИМИЧЕСКИХ КАНЦЕРОГЕНОВ, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВОВАТЬ С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ БЕНЗО[α]ПИРЕНА И БЕНЗ[α]АНТРАЦЕНА 2007
  • Глушков Андрей Николаевич
  • Апалько Светлана Вячеславовна
  • Филипенко Максим Леонидович
  • Матвеева Вера Александровна
  • Храпов Евгений Александрович
  • Костянко Михаил Владимирович
RU2357975C1
НОВОЕ АНТИТЕЛО СО СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ ТОЛСТОЙ КИШКИ 2001
  • Бродин Томас Н.
  • Карльстрем Пиа Й.
  • Нильсон Бо Х. К.
  • Ольссон Леннарт Г.
  • Тордссон М. Еспер
RU2268068C2
СРЕДСТВО ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ 2013
  • Хлусевич Яна Александровна
  • Тикунова Нина Викторовна
  • Морозова Вера Витальевна
  • Булычев Леонид Егорович
  • Бормотов Николай Иванович
  • Власов Валентин Викторович
  • Сергеев Александр Николаевич
RU2515905C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ФАГМИДНАЯ ДНК pHEN-TAB, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНОГО СВЯЗЫВАТЬ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА; РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА; РЕКОМБИНАНТНОЕ РАСТВОРИМОЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА 2005
  • Батанова Татьяна Александровна
  • Тикунова Нина Викторовна
  • Юн Татьяна Эверестовна
RU2307163C2
АНТИТЕЛА К АНТИГЕНУ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЧЕЛОВЕКА, РОДСТВЕННОМУ АЛЬФА 6 БЕТА 4 ИНТЕГРИНУ 2000
  • Бродин Томас Н.
  • Карлстрем Пиа Й.
  • Ольссон Леннарт Г.
  • Тордссон М. Йеспер
  • Керни Филлип П.
  • Нильсон Бо Х.К.
RU2266298C2
ОДНОДОМЕННОЕ МИНИ-АНТИТЕЛО aHER2/aSKBR3-1, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕЕ РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА HER2/ERBB2/neu И СПОСОБНОЕ ЧЕРЕЗ ЭТО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОНИКАТЬ ВНУТРЬ КЛЕТКИ-МИШЕНИ (ИНТЕРНАЛИЗОВАТЬСЯ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДАННОГО АНТИТЕЛА И СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ БЕЛКА HER2/ERBB2/neu И КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ЭТОТ БЕЛОК В ПОВЫШЕННОМ КОЛИЧЕСТВЕ, С ПОМОЩЬЮ МИНИ-АНТИТЕЛА aHER2/aSKBR3-1 2012
  • Тиллиб Сергей Владимирович
  • Иванова Татьяна Ильинична
  • Васильев Лев Анатольевич
  • Деев Сергей Михайлович
  • Здобнова Татьяна Александровна
  • Загайнова Елена Вадимовна
RU2522929C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 273 644 C2

Реферат патента 2006 года ОПУХОЛЬ-АДРЕСОВАННЫЙ ПЕПТИД

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине для лечения и диагностики аденокарциномы легкого и ее метастазов. В результате селекции фаговой пептидной библиотеки по признаку избирательного связывания с клетками - мишенями выявлены пептиды, обладающие способностью накапливаться в клетках аденокарциномы легких, со следующими аминокислотными последовательностями: RNVPPIFNDVYWIAF, SVAILPRSFSPFXVG, PFARAPVEHHDVVGL. Новые опухоль-адресованные пептиды позволяют осуществлять целенаправленную доставку препаратов различного назначения в клетки аденокарциномы легких. 2 ил.

Формула изобретения RU 2 273 644 C2

Опухоль-адресованный пептид, обладающий способностью накапливаться в аденокарциноме легких, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей:

RNVPPIFNDVYWIAF,

SVAILPRSFSPFXVG,

PFARAPVEHHDVVGL.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2273644C2

PASQUALINI R., RUOSLAHTI E
Nature
Предохранительное устройство для паровых котлов, работающих на нефти 1922
  • Купцов Г.А.
SU1996A1
RAJOTTE D
et al
J
Clin
Invest
Способ и аппарат для получения гидразобензола или его гомологов 1922
  • В. Малер
SU1998A1
GEVORKIAN G
et al
J
Autoimmun
ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР 1922
  • Гебель В.Г.
SU2000A1
URBANELLI L
et al
J
Mol
Biol
Перекатываемый затвор для водоемов 1922
  • Гебель В.Г.
SU2001A1

RU 2 273 644 C2

Авторы

Некрасов Борис Геннадьевич

Кувшинов Виктор Николаевич

Ушакова Татьяна Александровна

Каледин Василий Иванович

Николин Валерий Петрович

Туманова Ольга Юрьевна

Ильичев Александр Алексеевич

Сандахчиев Лев Степанович

Даты

2006-04-10Публикация

2004-04-19Подача