ОПУХОЛЬ-АДРЕСОВАННЫЙ ПЕПТИД Российский патент 2005 года по МПК C07K7/04 C12P21/02 A61K38/04 

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Конкретно - к получению с помощью фагового дисплея пептидов, специфически взаимодействующих с опухолью молочной железы Эрлиха.

В последние годы с помощью селекции фаговых библиотек против очищенных клеточных маркеров, культур клеток и даже in vivo на животных удалось идентифицировать целый ряд пептидов, специфичных в отношении тех или иных клеток [1]. Ранние работы в этой области касаются выделения пептидных лигандов для интегринов, представляющих класс гетеродимерных белков клеточной адгезии, выполняющих многие важные биологические функции, такие как рецепция матриксных белков и факторов роста, иммунологический контроль и др. [2]. Было показано, что пептиды, селектированные на очищенных интегринах, могут использоваться для избирательного связывания с клетками-мишенями. Селекция фаговых библиотек по связыванию с интактными клетками имеет ряд преимуществ, так как не требуется информация о предполагаемых рецепторах. Впервые этот подход был использован для выделения 20-мерного пептида, связывающегося с фибробластами [1]. Группа Ruoslahti из La Jolla Cancer Research Center разработала систему селекции in vivo, позволяющую выделять из пептидной фаговой библиотеки фаги, избирательно связывающиеся с различными органами и тканями [3]. Было показано, что органоспецифические фаги связываются с соответствующим органом в 4-9 раз лучше, чем в контроле. Органоспецифические фаги идентифицированы для легких, кожи, поджелудочной железы, тонкого кишечника, матки, надпочечников и сетчатки. При этом установлено, что фаг, связывающийся с легочной тканью, обладал наибольшей селективностью - в 35 раз больше, чем неселективный фаг [4].

Исследуя первичные структуры этих пептидов и получая в дальнейшем химическим синтезом такие пептиды, можно создавать конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, используемыми в настоящее время при терапии рака, тем самым повышая доставку препаратов в опухолевую ткань и уменьшая токсическое воздействие их на здоровые ткани, а также использовать для диагностики опухолей и их метастазов с большой точностью и эффективностью.

Адресная доставка лекарственных препаратов к опухолям возможна пока лишь в некоторых случаях и ограничивается использованием моноклональных антител, причем с переменным успехом [5, прототип]. Одним из главных ограничений применения антител для диагностики опухолей в клинике является плохое поглощение и распределение антител в опухолях. Это обусловлено главным образом физиологическими факторами (неравномерным кровотоком и интерстициальной гипертензией), а также большими размерами молекул антител [6].

Один из путей преодоления этой проблемы состоит в использовании опухоль-специфичных лигандов небольшого размера. Малые молекулы часто имеют более высокие коэффициенты проницаемости и интерстициальной диффузии и способны проникать в опухоли более глубоко. Принципиально новый подход к решению проблемы адресованной химиотерапии опухолей состоит в использовании фаговых пептидных библиотек, включающих в себя набор статистических пептидов, экспонированных в составе одного из поверхностных белков нитчатых бактериофагов.

Технической задачей изобретения является поиск опухоль-специфических пептидов, взаимодействующих с опухолью молочной железы Эрлиха, с помощью фаговых пептидных библиотек.

Поставленная цель достигается путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а.о, тех пептидов, которые способны специфично накапливаться в опухоли Эрлиха. Пептиды в библиотеке экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида [7].

Метод аффинной селекции in vivo заключается в следующем. Фаговую библиотеку в количестве 10¹³ фаговых частиц (TU - трансдуцирущих единиц) вводят в хвостовую вену мыши. Через несколько минут мышь забивают и выделяют ткань, на которую ведут селекцию. Ткань гомогенизируют, отмывают от не связавшихся фагов, а связавшиеся фаги после амплификации в E.coli повторно вводят мышам. После нескольких таких раундов из библиотеки отбираются фаги, экспонирующие на своей поверхности тканеспецифичные пептиды [3]. Обогащение фаговой популяции определяют по увеличению выхода фагов после каждого раунда селекции. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после 1, 1, 3-го раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют их специфичность. Для подтверждения тканеспецифичности отдельных фаговых популяций, полученных после аффинной селекции, фаги вводятся мышам на 24 часа. После чего в органах и тканях определяется количество накопившихся фагов (Tu/мг ткани) [8].

По результатам скрининга отбирают фаги, наиболее активно накапливающиеся в опухоли. Аминокислотный состав специфичных к опухоли пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [9] в кодирующей пептид области.

Для локализации бактериофага проводят иммуногистохимическое исследование образцов на парафиновых срезах. Эндогенную пероксидазу блокируют 3% перекисью водорода в забуференном физиологическом растворе в течение 10 минут. Неспецифического окрашивания избегают путем инкубирования срезов в бычьем сывороточном альбумине. В качестве первых антител используют антитела к В-белку нитчатого бактериофага fuse 2, первые антитела выявляют конъюгатом антител свиньи против иммуноглобулинов кролика с пероксидазой хрена. Пероксидазную активность выявляют 3,3'-аминобензидином. Положительным контролем служат высушенные осадки фаговой библиотеки. В качестве отрицательного контроля пропускается использование первых антител.

Для практического использования селектированные таким образом пептиды-миметики можно получать химическим синтезом и создавать на их основе конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, которые разрешены для терапии онкологических заболеваний, а также создавать конъюгаты с радиоактивными изотопами для использования как в терапии, так и диагностике опухолей и их метастазов, включать в состав липосомальных препаратов для визуализации опухолевых новообразований.

Сущность изобретения заключается в том, что селектированные из фаговой пептидной библиотеки пептиды, аминокислотные последовательности которых приведены на фиг.2, обладают свойством избирательно накапливаться в опухоли Эрлиха.

Таким образом, впервые получены пептиды, избирательно накапливающиеся в опухоли Эрлиха. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Скрининг индивидуальных фаговых клонов на мышах с привитой опухолью Эрлиха. В качестве отрицательного контроля взят фаг fuse2, который не экспонирует рандомизованный пептид.

Фиг.2. Аминокислотные последовательности пептидов, экспонированные на поверхности фагов.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, накапливающихся в опухоли Эрлиха.

Первый раунд аффинной селекции фаговой библиотеки проводят по следующей схеме [3]. Мышам линии СВА с привитой подкожно опухолью Эрлиха, которая достигла размера ˜1 см, вводили в хвостовую вену пептидную фаговую библиотеку 10¹⁴ трансдуцирующих единиц в 200 мл DMEM. Через 5 минут мышь усыпляют эфиром. Опухоль удаляют, взвешивают и гомогенизируют в 1 мл DMEM-PI (DMEM, содержащая ингибиторы протеаз: PMSF 1 mM, aprotinin 20 мкг/мл, leupeptin 1 мкг/мл). Опухоль трижды промывают DMEM-PI (4°С), содержащей 1% BSA, и инкубируют с 1 мл компетентной культурой Е.coli 1 час. Добавляют 10 мл питательной среды YTx2, содержащей 0,2 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют, перемешивая, при 37°С 1 час. 200 мкл переносят на чашку Петри с агаром, содержащим 40 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют ночь при 37°С. Колонии смывают 1 мл YTx2, содержащей 20 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в 5 мл, перемешивая 16 часов при 37°С. Выделяют фаг и проводят второй и третий раунды аффинной селекции как описано выше. Фаги титруют с использованием клеток К91Каn, выращенных на ТВ-среде, с последующим высевом на чашки с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл), титр фагов определяют по числу колоний (трансдуцирующих единиц (TU)) по G.P.Smith [7]. Количество фаговых частиц рассчитывают по формуле 1 TU=20 вирионов.

После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для имммуноферментного анализа (ИФА). Определение последовательности ДНК проводят по модифицированному методу Сэнгера [9]. В качестве праймера используют олигонуклеотид 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [7].

Пример 2. Скрининг индивидуальных фаговых клонов на мышах линии СВА с привитой опухолью Эрлиха.

Мышам линии СВА с привитой подкожно опухолью Эрлиха, которая достигла размера ˜1 см, вводят в хвостовую вену фаг в количестве 10⁹ трансдуцирующих единиц в 500 мл DMEM. Через 24 часа мышь усыпляют эфиром. Опухоль и контрольные органы (мышца, легкое и др.) удаляют, взвешивают и гомогенизируют в 1 мл DMEM-PI (DMEM, содержащая ингибиторы протеаз: PMSF 1 mM, aprotmin 20 мкг/мл, leupeptin 1 мкг/мл). Опухоль и контрольные органы трижды промывают DMEM-PI (4°С), содержащей 1% BSA, и инкубируют с 1 мл компетентной культурой E.coli 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 3 мл питательной среды YTx2, содержащей 0,2 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют, медленно перемешивая, при 37°С 20 минут. Образцы охлаждают до 4°С, отбирают аликвоты 5 мкл, 50 мкл и высевают на чашки Петри с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл). Через 16 часов подсчитывают выросшие колонии и вычисляют количество фаговых частиц, содержащихся в 1 мг исследуемой ткани.

Таким образом, получены специфичные пептиды, избирательно накапливающиеся в опухоли Эрлиха, которые могут быть успешно использованы в терапии и диагностике злокачественных новообразовавний у онкологических больных.

Литература

1. Brown КС. New approaches for cell-specific targeting: identification of cell-selective peptides from combinatorial libraries. Curr Opin ChemBiol. 2000, 4(1): 16-21.

2. Kouivunen Е, Агар W, Rajotte D, Lahdenranta J, Pasqualini R. Identification of receptor ligands with phage display peptide library. J Nucl Med. 1999, 40(5): 883-8.

3. Pasqualini R, Ruoslahti E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 1996. 380(6572): 364-366.

4. Rajotte D, Агар W, Hagerdom M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J Clin Invest. 1998, 102(2): 430-437.

5. Pastan I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta. 1997, 1333(2): 1-6.

6. Gui J, Moyana Т, Xiang J. Selection of a peptide with affionity for the tumor-associated TAG72 antigen from a phage-display library. Biochem Biophys Res Commun. 1996, 218(1): 414-419.

7. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. V.249, p.386-390.

8. Pasqualini R., Koivunen E., Ruoslahti E. av Integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nature biotechnology. 1997. V.15. P.542-546.

9. Kretz К., Callen W., Hedden V. Cycle sequencing // Methods of Enzimology. V.154. P.527-536.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению с помощью фагового дисплея пептидов, специфически взаимодействующих с опухолью молочной железы Эрлиха, и может быть использовано в терапии и диагностике злокачественных новообразований. Пептиды получают путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а.о., группы из девяти пептидов, каждый из которых способен специфично накапливаться в опухоли Эрлиха. Для практического использования селектированные таким образом пептиды-миметики можно получать химическим синтезом и создавать на их основе конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, с радиоактивными изотопами, а также можно включать их в состав липосомальных препаратов для визуализации опухолевых новообразований, 2 ил.

Пептид, специфически взаимодействующий с опухолью молочной железы Эрлиха, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, приведенных на фиг.2:

последовательность 1GGSACTGSSFGSVCWпоследовательность 2LFSHHDTWSLGARWVпоследовательность 3QFIDRPWLпоследовательность 4RNVPPIFNDVYWIAFпоследовательность 5RYRVGFTPGTIAAVLпоследовательность 6RDSFLFSFSRAHTPVпоследовательность 7VGAHLFHVPPGTTGпоследовательность 8GRTGPGGPGCPAVRAпоследовательность 9EVPRLSLLAASLVAN.