СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕТОДА ПЦР ДИАГНОСТИКИ МИКОПЛАЗМЕННОЙ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ С ВЫРАЖЕННЫМ ЭКССУДАТИВНЫМ ВОСПАЛЕНИЕМ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/536 A61K31/47 A61K31/196 A61P31/04 A61P29/00 G01N33/48 

Разработка относится к области медицины, в частности к урологии, нефрологии, венерологии, гинекологии, пульмонологии, акушерству, неонатологии, офтальмологии, может применяться в медицинской биологии, возможно применение в ветеринарии.

Известны методы механического удаления воспалительного экссудата - ватные палочки, ватные тампоны [1], обработка уретры и цервикального канала стерильным физиологическим раствором.

Этого может оказаться недостаточно чувствительным при выраженном экссудативном воспалении. Соскоб будет затруднен и, кроме того, этот метод неприемлим при диагностике микоплазм из образцов мочи (при пиелонефрите и простатите (образец мочи после массажа предстательной железы).

Для лучшего забора материала на внутриклеточные микроорганизмы для ПЦР-диагностики используют специальные цитощетки [1, 2, 5].

Клинические методы уменьшения экссудативного воспаления, предшествующие забору материала, предполагают механическое вымывание продуктов воспаления (например мочеиспускание), но обычно этого недостаточно для удаления актированных сопутствующих бактерий [4].

Кроме того, известен метод фармокологической провокации - преднизолоновый тест для повышения чувствительности диагностики урогенитальных инфекций [4].

Известен способ уменьшения негативного воздействия сопутствующей микрофлоры на образец микробиологической пробы путем добавления антибиотиков в среду с забранным материалом при траспортировке проб в лабораторию полимеразной цепной реакции для уменьшения бактериального загрязнения [2]. Данный способ применяется в рассчете на уменьшение влияния дополнительной контоминации микроорганизмов после забора материала.

Ранее использованные методы пробоподготовки не уменьшали влияние микст - инфекции, участвующей в воспалении наряду с микоплазменной инфекцией, а именно загрязнение пробы посторонней ДНК или РНК и ошибочной амплификации при этом [11].

Кроме того, выраженная экссудативная воспалительная реакция, представленная лейкоцитами и их лизатами, большое количество слизи в значительной степени затрудняют выделение специфической ДНК микоплазм хоминис и гениталиум, вследствие чего результаты проб у больных с выраженным бактериальным экссудативным воспалением могут давать большое количество ложно-отрицательных результатов на специфического внутриклеточного возбудителя [1, 12, 13].

Именно эти факты явились мотивацией применить метод устранения сопутствующей загрязняющей микрофлоры до взятия материала для ПЦР-диагностики путем использования антибактериальных средств в сочетании с противовоспалительными препаратами, устраняющими экксудативное воспаление.

Сущность изобретения - повышение чувствительности диагностики Mycoplasma hominis и Mycoplasma genitalium методом полимеразной цепной реакции у больных с выраженным экссудативным (острым) воспалением путем устранения сопутствующей ДНК бактериальных микроорганизмов и устранение дополнительного загрязняющего фактора - лизатов бактерий при экссудативном воспалении с помощью сочетанного применения антибактериальных препаратов, воздействующих на сопутствующую микрофлору, и противовоспалительных средств, уменьшающих экссудативное воспаление.

Сущность предлагаемой разработки заключается в том, что лечение осуществляют до взятия проб с помощью антибиотиков и нестероидных противовоспалительных средств при следующем соотношении веществ:

- антибиотики фторхинолонового ряда в дозе 100-250 мг 2 раза в день, 3-5 дней,

- нестероидные противовоспалительные препараты в средней-высокой терапевтической дозе (диклофенак 75-150 мг/сутки) в течение 3-7 дней.

Способ предложен для пациентов с выраженным экссудативным (острым) воспалением, верифицированным по клиническим проявлениям: гнойные, обильные слизистые выделения, количество лейкоцитов при микроскопии при малом увеличении - более 30 в поле зрения в образцах соскоба уретры, мочи, сока предстательной железы, мокроты, бронхоальвеолярной жидкости. Кроме того, возможно значительное содержание бактериальной микрофлоры при посеве отделяемого - более 10000 микроорганизмов у мужчин и 100000 у женщин в 1 мл.

С целью устранения неспецифической бактериальной флоры предложен офлоксацин. Выбор данного антибактериального препарата сделан на основании того, что он воздействует на наиболее частые сопутствующие микроорганизмы при данном типе воспаления: Е.coli., энтеробактерии, Enterococcus spp., Staphyloccus saprophiticus, в то же время данный препарат в предложенной схеме не влияет на выделение ДНК микоплазм, то есть не затруднит их выявление.

Обоснование доз компонентов лечения.

Предложено использовать дозы фторхинолонов от 100 до 250 мг 2 раза в сутки 3-5 дней.

Дозы менее 100 мг недостаточны для эрадикации бактериальных патогенов, а дозы более 250 мг потенциально могут приводить к эрадикации микоплазменного антигена, удалению микоплазменной ДНК или уменьшению его количества

Длительность применения ципрофлоксацина либо офлоксацина - 3-5 дней, применение менее 48 час недостаточно для эрарадикации грамотрицательных микроорганизмов [13], в то же время, использование препарата 5 дней и более до взятия материала для диагностики микоплазменного антигена может в значительной степени уменьшить его количество, а следовательно, негативно влиять на выявление ДНК микоплазм.

Для уменьшения выраженности экссудативного воспаления, которое затрудняет выделение ДНК микоплазм, предлагается использовать нестероидный противовоспалительный препарат. В качестве последнего выбор пал на диклофенак, препарат с максимальным противоспалительным эффектом из средств этой группы, лучшей переносимостью при использовании сопоставимых доз, обладающих противовоспалительным эффектом [14, 15, 16]. Для решения поставленной задачи применение в течение 5 дней может обеспечить выраженный противовоспалительный эффект. Предложено использовать средне-высокие терапевтические дозы - дозы менее 1 мг/кг не могут обеспечить выполнение задачи за 2-3 дня (примерно менее или равно 75 мг/сут), дозы более 1,5 мг/кг могут повлечь за собой побочные эффекты (задержка жидкости) и, что немаловажно, неблагоприятное взаимодействие со фторхинолоновыми препаратами [12]. Поэтому клиническая апробация проводилась на дозах диклофенака 75-100 мг.

Результаты эксперимента.

Ниже в таблице 1 представлены результаты диагностики микоплазмоза по данным полимеразной цепной реакции у больных с выраженным экссудативным воспалением до и после проведенной предлагаемой комбинированной противовоспалительной терапии у больных урогенитальным микоплазмозом (верифицированному по результатам культуральной диагностики на специфические среды для выделения с аргинин-ферментирующих микоплазм)

Таблица 1Номер пациентаЛейкоциты при микроскопии мазка ДО применения предлагаемого способа улучшения пробоподготовкиРезультаты ДНК-диагностики Микоплазмоза до применения предлагаемого способа улучшения пробоподготовки.*Лейкоциты при микроскопии мазка после применения предлагаемого способа улучшения пробоподготовкиРезультаты ДНК диагностики микоплазмоза при взятии проб на 5 сутки комбинированной противовоспалительно и терапии1.35-40+15-20+2.55-60-20-30+3.Покрывают поле зрения-25-30-4.35-45+20-25+5..35-40+20-30+6.40-50+25-30+7.35-50+20-30+8.Покрывают поле зрения-25-30+9.50-60-25-30+10.35-40+20-30+11.45-50-30-35-12.50-60-25-30+* + положительный результата анализа на микоплазмы
- отрицательный результат анализа на микоплазмы

Таким образом, исходно на фоне экссудативного воспаления в уретре микоплазмоз методом ПЦР-диагностики был выявлен у 6 из 12 больных. После предлагаемого способа улучшения пробоподготовки микоплазмоз был выявлен у 10 из 12 больных. То есть предлагаемый способ улучшения пробоподготовки позволил повысить чувствительность метода ПЦР-диагностики с 50 до 83%.

Сравнение с ранее известными

В Таблице 2 представлены результаты диагностики микоплазмоза по данным полимеразной цепной реакции у больных с выраженным экссудативным воспалением до и после проведения метода механического удаления мочеиспусканием и обработка ватным тампоном с физиологическим раствором 0,9% NaCl у больных урогенитальным микоплазмозом (верифицированному по результатам культуральной диагностики на специфические среды для выделения с аргинин-ферментирующих микоплазм)

Таблица 2Номер пациентаИсходное количество лейкоцитов при микроскопии мазка из уретрыРезультаты ПЦ-диагностики микоплазмозаКоличество лейкоцитов при микроскопии мазка из уретры после механической обработкиРезультаты ПЦР-диагностики микоплазмоза после механической обработки1.35-40+25-30+2.50-60-25-30+3.Покрывают поле зрения-40-50-4.35-45+20-30+5.30-40+20-25+6.45-50-35-40-7.30-40+15-20+8.Покрывают поле зрения-40-50-9.50-60-30-35+10.30-40+20-25+11.40-50-35-40-12.50-60-30-35-

Эффект: механическая обработка увеличивает выявление возбудителя дополнительно у 2 больных микоплазмозом из 12 (с 41 до 58%, т.е. на 17%).

В результате эксперимента при использовании комбинированной противовоспалительной терапии больных с выраженным экссудативным воспалением мочеполового отдела удалось найти возбудителя заболевания еще у 4 человек (с 50 до 83%). Предлагаемый метод улучшения пробоподготовки позволяет дополнительно увеличить чувствительность ДНК-диагностики микоплазмоза у больных с экссудативным воспалением на 33%, а по сравнению с ранее применяемыми методами механической обработки - на 16%.

Эксперимент проводили на базе поликлиники и ПЦР-лаборатории НИИ Микробиологии МО РФ г.Кирова и Кировской государственной медицинской академии, кафедры дерматовенерологии и кафедры терапии ФУВ.

По данной программе повышение чувствительности ПЦР-метода с целью уточнения этиологического диагноза с помощью предлагаемого способа пробоподготовки проведено 60 больным с негонорейными уретритами.

Предлагаемый способ улучшения пробоподготовки позволил повысить чувствительность методов ПЦР-диагностики при выраженном экссудативном воспалении в среднем на 33%.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица, гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997.

2. Rasin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity ofmycoplasmas. Microbiol Mol Biol Rev, 1998; 1094-1156.

3. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица, гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997.

4. Новые генетические технологии. Сборник 1. Межрегиональная ассоциация развития новых генетических технологий. С.32.

5. Нефрология. Руководство для врачей в 2 т. под ред. И.Е.Тареевой, Москва, "Медицина", 1995, Т.2. C.119.

6. Taylor-Robinson, D Infections due to species of mycoplasma and ureaplasma: An update. Clin Infect Dis, 1996; 23: 671.

7. Balows. A., Hausler. W.J., Hermann. K.L., et al. (Eds.): Manual of Clinical Microbiology, 5 th ed. Washington, DC, American Society for Microbiology, 1991.

8. Clyde, W.A., Kenny, G.E., and Schachter, J.: Cumitech 19: Laboratory Diagnosis of Chlamydial and Mycoplasmal Infections. Washington. DC, American Society for Microbiology, 1984.

9. Thomsen, AC, Undscov, HO. Diagnosis of mycoplasma hominis pyelonephritis by demonstration of antibodies in urine. J.Clin. Microbiol, 1979; 9:681.

10. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица, гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997. С.786 (биоматериал и специальные требования).

11. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица, гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997. С.661.

12. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица, гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997. С.74.

13. Davia N. Gilbert, MD, Robert C. Moellering, Jr, MD, Merle A. Sande, MD. The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy, Thirty - first Edition, 2001, p 23.

Изобретение относится к области медицины, в частности к урологии, нефрологии, венерологии, гинекологии, неонатологии, офтальмологии и может быть использовано в ветеринарии. При этом при диагностике микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением на этапе подготовки к диагностике больному вводят антибиотик фторхинолонового ряда - ципрофлоксацин или офлоксацин в дозе 100-250 мг 2 раза в день, 3-5 дней и нестероидный противовоспалительный препарат диклофенак в дозе 75-150 мг/сутки в течение 3-7 дней. Способ позволяет повысить чувствительность метода ПЦР до 83%. 2 табл.

Способ повышения чувствительности метода ПЦР диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением, отличающийся тем, что больному при подготовке к диагностике вводят антибиотик фторхинолонового ряда - ципрофлоксацин или офлоксацин в дозе 100-250 мг 2 раза в день, 3-5 дней, и нестероидный противовоспалительный препарат диклофенак в дозе 75-150 мг/сутки, в течение 3-7 дней.