СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕТОДА ПЦР-ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНОЙ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ С ВЫРАЖЕННЫМ ЭКССУДАТИВНЫМ ВОСПАЛЕНИЕМ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/196 A61P31/00 

Разработка относится к области медицины, в частности к урологии, нефрологии, венерологии, гинекологии, пульмонологии, акушерству, неонатологии, офтальмологии, может применяться в медицинской биологии, возможно применение в ветеринарии.

Известны методы механического удаления воспалительного экссудата - ватные палочки, ватные тампоны (1), обработка уретры и цервикального канала стерильным физиологическим раствором.

К сожалению этого может оказаться недостаточно, при выраженном экссудативном воспалении соскоб будет затруднен и, кроме того, этот метод неприемлем при диагностике хламидий из образцов мочи (при пиелонефрите и простатите (образец мочи после массажа предстательной железы)

Для лучшего забора материала на внутриклеточные микроорганизмы используют специальные цитощетки (2, 5).

Клинические методы уменьшения экссудативного воспаления, предшествующие забору материала, предполагают механическое вымывание продуктов воспаления (например, мочеиспускание), но обычно этого недостаточно для удаления адгезированных сопутствующих бактерий (4).

Кроме того, известен метод фармокологической провокации - преднизолоновый тест для повышения чувствительности диагностики урогенитальных инфекций (4).

Известен способ уменьшения негативного воздействия сопутствующей микрофлоры на образец микробиологической пробы путем добавления антибиотиков в среду с забранным материалом при траспортировке проб в лабораторию ПЦР-диагностики для уменьшения бактериального загрязнения (2), данный способ применяется в рассчете на уменьшение влияния дополнительной контаминации микроорганизмов после забора материала.

Ранее использованные методы пробоподготовки не уменьшали влияние микст-инфекции, участвующей в воспалении наряду с хламидийной инфекцией, а именно загрязнение пробы посторонней ДНК или РНК и ошибочной амплификации при этом (11).

Кроме того, выраженная экссудативная воспалительная реакция, представленная лейкоцитами и их лизатами, большое количество слизи в значительной степени затрудняют выделение специфической ДНК хламидий.

Сущность предлагаемой разработки заключается в том, что лечение осуществляют до взятия проб с помощью антибиотиков и нестероидных противовоспалительных средств при следующем соотношении веществ:

- антибиотики фторхинолонового ряда в дозе 100-250 мг 2 раза в день;

- нестероидные противовоспалительные препараты в средней-высокой терапевтической дозе (диклофенак 75-150 мг/сутки).

Результаты проб у больных с выраженным бактериальным экссудативным воспалением могут давать большое количество ложно-отрицательных результатов на специфического внутриклеточного возбудителя (12).

Сущность изобретения - повышение чувствительности диагностики хламидиоза методом полимеразной цепной реакции у больных с выраженным экссудативным (острым) воспалением путем устранения сопутствующей ДНК - бактериальных микроорганизмов и устранение дополнительного загрязняющего фактора - лизатов бактерий при экссудативном воспалении.

Способ предложен для пациентов с выраженным экссудативным (острым) воспалением, верифицированным по клиническим проявлениям: гнойные, обильные слизистые выделения, количество лейкоцитов при микроскопии при малом увеличении - более 30 в поле зрения в образцах соскоба уретры, мочи, сока предстательной железы, конъюнктивы, мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, а с другой стороны, значительное содержание бактериальной микрофлоры при посеве отделяемого - более 10000 микроорганизмов у мужчин и 100 000 у женщин.

С целью устранения неспецифической бактериальной флоры предложен ципрофлоксацин. Выбор данного антибактериального препарата сделан на основании того, что он воздействует на наиболее частые микроорганизмы при данном типе воспаления: Е. coli., энтеробактерии, Enterococcus spp., Staphylococcus saprophiticus, в то же время данный препарат в предложенной схеме не влияет на выделение ДНК хламидий, то есть не затруднит их выявление.

Используются дозы фторхинолонов от 100 до 250 мг 2 раза в сутки 2 суток.

Дозы менее 100 мг недостаточны для эрадикации бактериальных патогенов, а дозы более 250 мг потенциально могут приводить к эрадикации хламидийного антигена. Длительность применения ципрофлоксацина 2 дня - применение менее 48 ч недостаточно для эрарадикации грамотрицательных микроорганизмов (13), в то же время использование препарата 3 дня и более до взятия материала для диагностики хламидийного антигена может в значительной степени уменьшить его количество, а следовательно, негативно влиять на выявление ДНК хламидий.

Для уменьшения выраженности экссудативного воспаления, которое затрудняет выделение ДНК хламидий, предлагается использовать нестероидный противовоспалительный препарат. В качестве последнего выбор пал на диклофенак, препарат с максимальным противоспалительным эффектом из средств этой группы, лучшей переносимостью при использовании сопоставимых доз, обладающих противовоспалительным эффектом. Для поставленной задачи - в течение 2-3 дней обеспечить выраженный противовоспалительный эффект предложено использовать средне-высокие терапевтические дозы - дозы менее 1 мг/кг вряд ли могут обеспечить выполнение задачи за 2-3 дня (примерно менее или равно 75 мг/сут), дозы более 1,5 мг/кг могут повлечь за собой побочные эффекты (задержка жидкости) и, что немаловажно, неблагоприятное взаимодействие с фторхинолоновыми препаратами (12). Поэтому клиническая апробация проводилась на дозах диклофенака 75-100 мг.

Результаты эксперимента

Ниже в таблице 1 представлены результаты диагностики хламидиоза по данным полимеразной цепной реакции у больных с выраженным экссудативным воспалением до и после проведенной предлагаемой комбинированной противовоспалительной терапии у больных урогенитальным хламидиозом (верифицированному по катамнезу серологического подтверждения - нарастания титра специфических противохламидийных антител класса Ig1 М.)

Таблица 1Номер пациентаЛейкоциты при микроскопии мазка до применения предлагаемого способа улучшения пробоподготовкиРезультаты ДНК-диагностики До применения предлагаемого способа улучшения пробоподготовки.*Лейкоциты при микроскопии мазка после применения предлагаемого способа улучшения пробоподготовкиРезультаты ДНК диагностики при взятии проб на 3 сутки комбинированной противовоспалительной терапии1.30-40+10-15+     2.50-60-15-20+3.Покрывают поле зрения-20-25+4.30-45+10-15+5.30-40+10-20+6.40-50-20-25-7.30-50+15-20+8.Покрывают поле зрения-25-30+9.50-60-20-30+10.30-40+10-20+11.40-50-30-35-12.50-60-20-25+* + положительный результат анализа
- отрицательный результат анализа

Сравнение с ранее известными

Ниже в таблице 2 представлены результаты диагностики хламидиоза по данным полимеразной цепной реакции у больных с выраженным экссудативным воспалением до и после проведения методов механического удаления мочеиспусканием и обработки ватным тампоном с физиологическим раствором 0,9% NaCl у больных урогенитальным хламидиозом (верифицированному по катамнезу серологического подтверждения - нарастания титра специфических противохламидийных антител класса Ig1 М.)

Таблица 2Номер пациентаИсходное количество лейкоцитов. ИсходноРезультаты ПЦРКоличество лейкоцитов после механической обработкиРезультаты ПЦР после механической обработки1.30-40+20-30+2.50-60-30-40+3.Покрывают поле зрения-40-50-4.30-45+15-20+5.30-40+20-25+6.40-50-30-40-7.30-50+15-20+8.Покрывают поле зрения-40-50-9.30-40-30-40+10.30-40+15-20+11.40-50-30-40-12.50-60-25-30-

Эффект: механическая обработка увеличивает выявление возбудителя дополнительно у 2 человек (с 41 до 58%, т.е. на 17%).

В результате эксперимента при использовании комбинированной противовоспалительной терапии больных с выраженным экссудативным воспалением мочеполового отдела удалось найти возбудителя заболевания еще у 5 человек (с 41% до 83%), то есть дополнительно увеличить чувствительность ДНК-диагностики хламидиоза у больных с экссудативным воспалением на 42%, а по сравнению с ранее применяемыми методами механической обработки - на 25%.

Эксперимент проводили на базе поликлиники и ПЦР-лаборатории НИИ микробиологии МО РФ г. Кирова и Кировской государственной медицинской академии, кафедры дерматовенерологии и кафедры терапии ФУВ.

По данной программе повышения чувствительности ПЦР метода и ПИФ с целью уточнения этиологического диагноза с помощью предлагаемого способа пробоподготовки проведено 60 больным с негонорейными уретритами.

Предлагаемый способ улучшения пробоподготовки позволил повысить чувствительность методов ПЦР-диагностики и прямой иммунофлуоресценции при выраженном экссудативном воспалении в среднем на 42%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Хламидиоз. Дж.Д.Ориэл, Дж.Л.Риджуей. Перевод с англ. Под ред. В.В.Делекторского. Москва. "Медицина", 1984. С.39-41.

2. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица., гл. ред. Русского издания В.В. Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997.

3. Новые генетические технологии. Сборник 1. Межрегиональная ассоциация развития новых генетических технологий. С.32.

4. Нефрология. Руководство для врачей в 2 т. Под ред. И.Е.Тареевой, Москва, "Медицина". 1995. Т.2. C.119.

5. Урогенитальные хламидийные инфекции, диагностика и лечение. Руководство для врачей. Москва 1996 г. В.Р.Мартынова, А.Л.Машкиллейсон, М.А.Гомберг, С.Н.Еременко, с.16.

6. Balows A., Hausler W.J., Hermann К.L. et al. (Eds.): Manual of Clinical Microbiology, 5 th ed. Washington, DC, American Society for Microbiology, 1991.

7. Clyde, W.A., Kenny, G.E. and Schachter, J.: Cumitech 19: Laboratory Diagnosis of Chlamydial and Mycoplasmal Infections. Washington. DC, American Society for Microbiology, 1984.

8. Schachter, J.: Chlamydial infections. N. Engl. J. Med., 298: 428-435; 490-495; 540-549, 1978.

9. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица, гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997. С.786. (биоматериал и специальные требования).

10. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица., гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997. С.661.

11. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред Н.У.Тица., гл. ред. Русского издания В.В.Меньшиков. "Лабинформ", Москва - 1997. С.74

12. Davia N. Gilbert, MD, Robert C. Moellering, Jr, MD, Merle A. Sande, MD. The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy, Thirty - first Edition, 2001, p.23.

Изобретение относится к медицине - к урологии, нефрологии, венерологии, гинекологии, пульмонологии, акушерству, неонатологии, офтальмологии и может быть использовано для повышения чувствительности метода ПЦР-диагностики хламидийной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением. До взятия микробиологической пробы пациентам вводят антибиотики фторхинолонового ряда в дозе 100-250 мг 2 раза в день в течение 2 дней и нестероидные противовоспалительные препараты в дозе 75-150 мг в день в течение 2-3 дней. Данное изобретение способствует повышению чувствительности методов ПЦР-диагностики и прямой иммунофлуоресценции что, в свою очередь, способствует своевременной постановке диагноза и проведению соответствующей терапии в наиболее оптимальные сроки. 2 табл.

Способ повышения чувствительности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики хламидийной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением, включающий взятие микробиологической пробы, отличающийся тем, что до взятия микробиологической пробы пациентам вводят антибиотики фторхинолонового ряда в дозе 100-250 мг 2 раза в день в течение 2 дней и нестероидные противовоспалительные препараты в дозе 75-150 мг в день в течение 2-3 дней.