СПОСОБ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСПОРТНЫХ СВОЙСТВ АЛЬБУМИНА В АЛЬБУМИНСОДЕРЖАЩЕЙ ПРОБЕ, ЭПР-СПЕКТРОМЕТР ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И КОНТРОЛЯ АЛЬБУМИНСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2006 года по МПК G01R33/60 

Изобретение представляет применимый в медицинской, биологической. биотехнологической и ветеринарной практике способ электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) для ЭПР-спектросконического определения изменений транспортных свойств альбумина в альбуминсодержащей пробе, который может применяться для диагностики и/или контроля физиологических или патологических изменений в человеческом или животном организме или для контроля качества альбуминсодержащих препаратов, в частности препаратов крови. Предметом изобретения является также ЭПР-спектрометр для реализации способа, соответствующего изобретению.

Известно, что гематологические параметры и параметры, соответствующие антигенам, гормонам, ферментам и другим биологически активным субстанциям, применяются для диагностики заболеваний, что находит широкое применение в рутинной клиническо-химической диагностике.

Также ЯМР- и ЭПР-спектроскопия могут применяться в диагностике заболеваний для оценки структурных и функциональных свойств протеинов и липидных компонент в сыворотке крови. Хотя применение ЭПР-спектроскопии с использованием спиновых меток представляет известную методику исследования процессов движения в макромолекулах, широкое внедрение этого способа тестирования в рутинную клиническую диагностику до сих пор было безуспешным из-за высокой стоимости оборудования и сложности и низкой надежности анализа сигналов.

Авторское свидетельство СССР 1319705 A1 описывает способ диагностики злокачественных заболеваний, в котором посредством ЭПР измеряется способность плазмы крови или сыворотки крови связывать внесенный спиновый зонд. Определяется коэффициент связывания α, который представляет отношение амплитуды пика А к амплитуде пика В. Если α>1, то определяется канцерогенное заболевание. При α<1 пациент здоров.

Недостатком описанного способа является недостаточная чувствительность, вследствие чего он не обеспечивает надежной диагностики. Исследования этого способа показали, что ложно-положительные и ложно-отрицательные результаты диагностики в ранней стадии заболевания составляют 30%.

ЕР 0973043А1 описывает ЭПР-спектроскопический способ диагностики злокачественных неоплазм в сыворотке крови путем определения физико-химических параметров подвижности спинового зонда, представляющего спинмеченую жирную кислоту, в трех центрах связывания альбумина.

Альбумин - это основной компонент транспортной системы крови, который обеспечивает транспорт жирных кислот, триптофана, билирубина, кальция, стероидных гормонов и других функционально важных активных веществ к клеткам-мишеням, и при этом участвует в связывании и выведении множества токсинов (в том числе эндогенного происхождения). Альбумин - это полипентид (молекулярный вес 68000) с высокой эффективностью связывания экзогенных (лекарств) и эндогенных субстанций. Состоит из 585 аминокислот, которые дисульфидными мостиками сложены в форме нетель. В литературе различают различные центры связывания в сывороточном альбумине. Для жирных кислот в молекуле альбумина существуют так называемые центры связывания 1, 2 и 3.

При способе диагностики согласно ЕР 0973043А1 заболевание раком определяется по отклонению параметров связывания спинового зонда от значений, наблюдаемых у здоровых лиц.

По способу ЭПР согласно ЕР 0973043А1 определяется конкретное состояние нативной конформации альбумина в крови, которая при наличии канцерогенного состояния изменена по сравнению со здоровыми лицами. Однако этот способ выдает ложно-положительные или ложно-отрицательные заключения, если в крови присутствуют дополнительные влияния на альбумин, например в крови повышены значения липидов или содержание медикаментов или имеется влияние растворителя спинового зонда и хранения проб крови на воздухе.

Целью данного изобретения является малозатратный и быстро выполнимый способ ЭПР-спектроскопического исследования альбуминсодержащих проб, в частности анализов крови, обеспечивающих правильные и воспроизводимые результаты определения конформации альбумина с учетом указанных влияний, применимых в практике клиническо-химической лаборатории. Способ должен быть предназначен для ранней диагностики и/или контроля физиологических или патологических изменений в человеческом или животном организме, для контроля качества альбуминсодержащих материалов, в частности материалов из консервированной крови, и для оценки детоксификационной емкости молекул альбумина. Целью изобретения является также устройство для эффективной реализации способа.

Цель изобретения достигается тем, что при определении в исследуемой пробе изменения транспортных характеристик альбумина посредством ЭПР-спектроскопии, в исследуемой пробе индуцируются целенаправленные конформационные изменения молекул альбумина с помощью подходящего полярного реагента, дополнительного к спиновому зонду. Показано, что параметры связывания спинового зонда с известными специфическими центрами связывания альбумина, определяемые посредством ЭПР, соотносятся с биофизическими параметрами конформации альбумина, и последние позволяют сделать надежные заключения о физиологических или патологических изменениях в организме человека или животного или в медицинских препаратах для переливания или трансплантации.

В соответствии с изобретением, к аликвотам пробы, минимум трем, предпочтительно до восьми, прибавляют различные концентрации связывающегося с альбумином спинового зонда и, дополнительно, минимум три, предпочтительно до восьми, различные концентрации полярного реагента, по спектрам ЭПР аликвот со спиновым зондом и полярным реагентом определяют степень изменения параметров связывания спинового зонда со специфическими центрами связывания альбумина в зависимости от концентрации спинового зонда и концентрации полярного реагента, посредством компьютерного моделирования спектров ЭПР, а транспортные свойства альбумина рассчитывают из изменений значений параметров связывания спинового зонда для различных концентраций спинового зонда и полярного реагента, индуцирующих различные конформационные состояния альбумина, причем добавляемые концентрации спинового зонда выбирают таким образом, что среднее значение отношения концентрации спинового зонда к концентрации альбумина составляет 2,5±0,5, и исходя из этого среднего значения выбирают минимум две дополнительных концентрации, отклонение которых от этого среднего значения не меньше чем 1,0. Прибавляемые концентрации полярного реагента выбирают таким образом, что среднее значение конечной концентрации полярного реагента в аликвотах составляет (0,6±0,25)·Ср, причем Ср представляет критическую концентрацию полярного реагента, превышение которой приводит к денатурации альбумина, и исходя из этого среднего значения выбирают минимум две дополнительные концентрации полярного реагента, отклонение которых от этого среднего значения составляет минимум 15%.

При этом концентрации спинового зонда и полярного реагента, которые добавляют к аликвотам пробы, должны быть выбраны в пределах указанных областей концентрации таким образом, что имеются в наличии по меньшей мере в одной аликвоте низкая концентрация зонда и низкая концентрация полярного реагента, в минимум одной аликвоте высокая концентрация зонда и высокая концентрация полярного реагента, и в минимум одной аликвоте средняя концентрация полярного реагента и средняя концентрация зонда (скрининг-анализ трех спектров). Предпочтительно, могут быть выбраны еще дополнительно другие концентрации, таким образом, что имеется в наличии как минимум в одной аликвоте низкая концентрация зонда и низкая концентрация полярного реагента, и наиболее предпочтительно, дополнительно имеется в наличии минимум в одной аликвоте низкая концентрация зонда и высокая концентрация полярного реагента (анализ восьми спектров). Этой комбинацией концентраций обеспечивается, чтобы транспортные свойства альбумина регистрировались в различных состояниях, а именно физиологическом состоянии при связывании гидрофобных субстратов, как, например, жирные кислоты (низкая концентрация зонда и низкая концентрация полярного реагента), физиологическом состоянии во время транспорта гидрофобных субстратов по кровеносной системе (высокая концентрация зонда и низкая концентрация полярного реагента) и физиологическом состоянии при отдаче гидрофобных субстратов клеткам-мишеням (высокая концентрация зонда и высокая концентрация полярного реагента).

В то время как согласно Авторскому свидетельству СССР 1319705 возможно лишь определение коэффициента связывания плазмы крови или сыворотки крови в нативном состоянии, и согласно ЕР 0973043 А1, определяется конкретное нативное состояние альбумина в исследуемой пробе крови, соответствующий изобретению способ регистрирует изменение конформации альбумина (конформационную подвижность) в динамике под влиянием полярного реагента и одновременно функциональность альбумина и изменение параметров связывания субстратов альбумином. Так как такие изменения вызываются на очень ранних этапах, например, патологическими процессам, как, например, развитие рака, медицинскими процедурами, злоупотреблением наркотиков, или также на этапах фракционирования составных частей плазмы крови и при неправильном хранении препаратов плазмы, в соответствии с изобретением возможно получать информативные диагностические заключения уже на ранней стадии изменений функциональности альбумина. В зависимости от физико-химических характеристик среды, конформация альбумина в пробах крови при анализе ЭПР изменяется и вследствие этого также изменяются характеристики связывания альбумином ряда субстратов.

Соответствующий изобретению способ отличается тем, что посредством ЭПР-спектроскопии изменения транспортных свойств альбумина (функциональность альбумина) определяются, например, в крови, при целенаправленных конформационных модификациях молекулы альбумина, вызываемых различными концентрациями полярного реагента в присутствии различных концентраций спинового зонда. Записанные спектры ЭПР аликвот электронным образом аппроксимируют посредством математической модели, которая базируется предпочтительно на функции Гамильтона с аксиальной анизотропией, электронным образом симулируют, предпочтительно минимизацией квадратов разниц значений спектров модельных и экспериментально измеренных спектров ЭПР до эквивалентности экспериментальных и симулируемых спектров, и определяют параметры связывания спинового зонда в специфических центрах связывания альбумина. Соответствующие этим центрам связывания, причем определенные параметры связывания спинового зонда соотносят с биофизическими параметрами конформации альбумина и сортируют в зависимости от диагностируемого физиологического или патологического изменения, а из этих параметров электронным образом рассчитывают специфические параметры и их граничные значения (cut-off) как критерий принятия диагностических решений с помощью дискриминационных функций для специфических модификаций конформации альбумина при особых патологических или физиологических изменениях.

В соответствии с изобретением в качестве спинового зонда используются соединения, которые могут специфически связываться с альбумином, в частности жирные кислоты, стероидные гормоны или гетероциклические углеводороды, которые должны быть спинмечены. Также гидрофобные соединения, которые мечены нитроксильными радикалами как известные спиновые зонды, могут применяться в соответствующем изобретению способе. Для реализации изобретения наиболее предпочтительными спиновыми зондами являются спинмеченые жирные кислоты, предпочтительно доксил-стеариновая кислота. Наиболее предпочтительно применение 16-, 5-, 7- или 12-доксил-стеариновой кислоты. Если в качестве спинового зонда используют спинмеченые жирные кислоты, то возможно определение параметров связывания спинового зонда в первом, втором и третьем центрах связывания альбумина.

Как полярный реагент в расчет принимается спирт или DMSO, причем предпочтительными являются С₁-С₆-спирты, наиболее предпочтителен этиловый спирт.

Как содержащую альбумин пробу согласно данному изобретению нужно понимать например, анализ крови или содержащий альбумин медицинский препарат, или пробу содержащего альбумин продукта.

Согласно изобретению спектры ЭПР регистрируют для минимум трех, преимущественно также до восьми, концентраций спинового зонда. К примеру, три аликвоты одной пробы сыворотки объемом но 50 мкл смешивают с 16-доксил-стеариновой кислотой в трех различных концентрациях и с полярным реагентом в трех различных объемах, так, что конечная концентрация спинового зонда составляет в исследуемых аликвотах 8,33·10^-4; 1,55·10^-3 и 2,41·10^-3 моль/л, а концентрация полярного реагента 2,90; 3,37 3,80 моль/л (см. таблицу 1).

Продолжительность инкубирования составляет от 7 до 15 минут, предпочтительно 10 минут. При инкубированин пробы следует встряхивать. Спектры ЭПР регистрируют, как правило, при 37°С и физиологическом значении рН крови. Для повышения точности спектры можно регистрировать при двух или более различных значениях температуры проб между 15 и 45°С и/или при двух или более различных значениях рН в пробах сыворотки от 7,5 до 3,5.

Анализ зарегистрированных спектров ЭПР выполняют электронным образом с помощью специально разработанного компьютерного программного обеспечения для анализа подвижности структуры молекул (MMS). Спектры ЭПР, зарегистрированные для минимум трех, предпочтительно восьми аликвот альбуминсодержащей пробы, предпочтительно пробы сыворотки или плазмы, передают компьютерному программному обеспечению для расчета параметров связывания спинового зонда в различных типах центров связывания. Параметры связывания спинового зонда анализируют на основе симуляции (моделирования) спектров ЭПР. Для симуляции экспериментально измеренных спектров ЭПР используют модель спектров ЭПР, предпочтительно основанную на функции Гамильтона с аксиальной анизотропией. Параметры связывания спинового зонда в альбумине определяют при минимизации квадратов разниц модельного и экспериментально измеренного спектров ЭПР, как это описано, к примеру, в ЕР 0973043 А1.

Расчет параметров выполняют раздельно для различных типов центров связывания. Параметры, которые характеризуют связывание спинового зонда в центрах связывания молекулы альбумина, рассчитывают путем симуляции спектров ЭПР. Для расчета каждой компоненты спектр, используют спиновую модель, которая предпочтительно базируется на функции Гамильтона с аксиальной анизотропией. Расчет выполняют как описано в ЕР 0973043 А1, со страницы 4 вниз до страницы 7 вверху.

Для математической обработки спектра ЭПР спинового зонда применяют вышеуказанную компьютерную программу, которая выполняет описанный алгоритм расчета. Время для обработки одного спектра ЭПР составляет менее 15 секунд.

Как результат расчета при симуляции каждого спектра ЭПР получают набор из 48 параметров спинового зонда для трех центров связывания альбумина. Каждый из этих параметров имеет специфические вариации, соответствующие состояниям молекул спинового зонда, связанных в молекулах альбумина, которые отражают конформационное состояние молекул альбумина. В целом, в случае, если в качестве спинового зонда используется 16-доксил-стеариновая кислота, из общего набора выбирают 17 параметров из Таблицы 2, которые специфически характеризуют конформационный статус альбумина.

Комплект из 17 параметров согласно Таблице 2 в виде биофизических параметров связывания описывает состояние молекул спинового зонда в центрах связывания альбумина, которое, из-за влияния свойств центров связывания, отражает реальное конформационное состояние молекулы альбумина.

Из полученного комплекта 17 параметров рассчитывают согласно Таблице 3 распределение и параметры подвижности спинового зонда для отдельных аликвот, причем из параметров С₁ до С₃ относительной концентрации пулов спинового зонда рассчитывают распределение относительного количества N₁ до N₃ молекул спинового зонда, связанных в центрах связывания, путем умножения С₁ до С₃ на отношение концентраций жирной кислоты (FS) и сывороточного альбумина (SA).

Характеристики подвижности молекул спинового зонда, иммобилизованных в центрах связывания альбумина, рассчитывают согласно формулам из Таблицы 3, причем факторы полярности микроокружения центров связывания 1 и 2 рассчитывают из изотропных констант сверхтонкой структуры А₁ и соответственно А₂. Факторы упорядоченности S₁ и S₂ рассчитывают из изотропных констант сверхтонкой структуры А₁ и А₂ соответственно и параметров анизотропии сверхтонкой структуры δА₁ и δА₂ соответственно. Времена корреляции Т'₂ и Т''₂ рассчитывают из ширин спектральных линий W_L, W_M и W_H.

При этом параметры связывания альбумина определяют предпочтительно посредством математического метода регрессии из зависимости параметров связывания спинового зонда в аликвотах от изменения концентрации спинового зонда и концентрации полярного реагента. Как характеристики связывания альбумина для аликвот определяют общий комплект параметров связывания, включающий

К_в - константа связывания,

N₁ ⁰ - емкость первого центра связывания жирных кислот и

С_р - критическая концентрация полярного реагента

которые рассчитывают посредством регрессии зависимости между относительными количествами молекул спинового зонда (N₁, N₂, N₃), связанных в центрах связывания жирной кислоты, и концентрацией полярного реашента (С) согласно формуле I:

Как дополнительные параметры связывания альбумина для аликвот, параметры

R₂ - отношение емкостей второго и первого центров связывания жирных кислот для нативного состояния альбумина,

К₂ - фактор подвижности второго центра связывания жирных кислот,

L₂ - предел конформационной стабильности альбумина,

рассчитывают посредством регрессии зависимости между относительными количествами (n₁, N₂, N₃) молекул спинового зонда, связанных в центрах связывания жирных кислот, и концентрации полярного реагента (С) согласно формуле II:

Формулы (I) и (II) описывают модель конформационной подвижности системы центров связывания жирных кислот молекулы альбумина, которая разработана согласно изобретению на основе обширных экспериментальных исследований.

Изменение транспортных свойств альбумина рассчитывают согласно Таблице 4 из комплекта рассчитанных параметров связывания альбумина в аликвотах в зависимости от конкретных тестовых условий приготовления аликвот. Предпочтительно применяемые тестовые условия позволяют рассчитать характеристики: загрузки альбумина жирными кислотами (К_L, N_L ⁰ - тестовые условия: С=0, соотношение жирная кислота / альбумин = 0,5); транспорта жирных кислот (N_L ⁰, К_L - тестовые условия: С=0, соотношение жирная кислота / альбумин = 1.5): и разгрузки (отдачи) жирных кислот (D_U, N_U ⁰ - тестовые условия: С=3,37 М, соотношение жирная кислота / альбумин = 1,5). Расчет этих характеристик производят по следующим формулам:

Интегральная константа связывания К_L=К_B·(N₁ ⁰+N₂ ⁰),

Эффективная емкость связывания N_L ⁰=(N₁ ⁰+N₂ ⁰),

Эффективная транспортная емкость N_Т ⁰=(N₁ ⁰+N₂ ⁰),

Интегральная константа связывания при транспорте К_т=K_в·(N₁ ⁰+N₂ ⁰),

Константа диссоциации = D_U=1/К_В,

Эффективная емкость при разгрузке N_U ⁰=(N₁ ⁰+N₂ ⁰).

Согласно изобретению описанный способ ЭПР может применяться для диагностики и/или контроля физиологических или патологических изменений в организме человека или животного, например для ранней диагностики онкологических заболеваний. Для диагностики заболеваний и соответствующих физиологических изменений параметры связывания из Таблицы 2, определенные на основе оценки минимум трех аликвот с различными концентрациями спинового зонда и полярного реагента, подставляют в дискриминационную функцию для скриниг-анализа ЭПР, чтобы определить значение cut-off для диагностики имеющейся патологии и соответственного патологического изменения, и сравнивают со значением cut-off контрольных (референсных) проб.

Таким образом параметры D_i из Таблицы 5 применяются, например, для диагностики заболевания раком. При этом уже одного из параметров D₁-D₆ достаточно, чтобы получить надежный диагноз. Для дополнительного повышения надежности заключений полезно определять следующие дополнительные параметры, в частности D₂, D₃, D₅, или D₆, или все 6 параметров D_i. Если один из параметров D_i>1, то конформация альбумина нарушена и речь идет, например, об онкологическом заболевании. Если D_i<1, то испытуемый не имеет никакого онкологического заболевания.

Диагностическая точность соответствующего изобретению способа диагностики проверялась для 212 пациентов с заболеваниями раком и 87 пациентов без онкологических заболеваний (см. таблицу 6).

Таблица 6 подтверждает высокую диагностическую точность соответствующего изобретению ЭПР-способа, более чем 90%. Заболевания раком также могут диагностироваться в очень ранней стадии. Таким образом, даже более высокая диагностическая точность, соответствующая примерно 95%, достигается при расчете D₂, D₃, D₅ или D₆ соответственно.

Таким образом, ЭПР-анализ проб крови обеспечивает диагностику рака и других заболеваний или физиологических изменений в очень ранних стадиях заболевания. Модификация транспортной функции альбумина является следствием блокировки специфических центров связывания жирных кислот альбумина, которая наблюдается уже в начале заболевания. Вследствие этой блокировки нарушена общая функция связывания альбумина и свойства связывания альбумина для стадий нормального транспорта, но, однако, не для снабжения неоплазм, что представляет одну из предпосылок для их роста. Блокировка центров связывания жирных кислот приводит к значительному недостатку снабжения нормальных клеток и также к нарушениям в иммунной системе. Параметры, определяемые современными методами рутинной клиническо-химической диагностики, такие изменения не регистрируют: как было доказано, первые реакции организма на развитие опухоли выявляются только посредством соответствующего изобретению способа ЭПР.

Соответствующий изобретению способ может применяться как способ технологического контроля при производстве альбуминсодержащих лекарств, так же как и для определения и контроля качества альбуминсодержащих препаратов, преимущественно - препаратов крови или препаратов плазмы, в соответствии с изобретением, путем сравнения определенных изменений транспортных свойств альбумина с транспортными свойствами исходного материала и/или нативного сывороточного альбумина здоровых испытуемых. Применение соответствующего изобретению способа включает также его использование для определения эффективности различных методов очистки альбумина от связанных с молекулами лигандов, путем сравнения исходного материала и очищенного альбуминсодержащего материала, как, например, методов удаления эндотоксинов путем гемосорбции и гемодиализа, которые непосредственно влияют на характеристики связывания и на транспортные свойства альбумина.

Соответствующий изобретению способ эффективен с точки зрения затрат и производительности. Он позволяет автоматизировать обработку различных спектров ЭПР. Результат каждого скрининг-теста для трех аликвот получается менее чем за 10 минут, для комплексного ЭПР-анализа восьми аликвот требуется примерно 24 минуты.

Предметом изобретения является также тестовый набор для реализации соответствующего изобретению способа, который содержит многоячеечный планшет с фиксированными, стабилизированными и точно дозированными необходимыми различными концентрациями спинового зонда и полярного реагента. Тестовый набор может содержать также лишь точно дозированные количества спинового зонда и полярного реагента в дополнительных контейнерах, например, в запечатанных пробных трубочках, так что в лаборатории предварительно дозированные вещества должны лишь только добавляться к аликвотам исследуемой пробы.

Предметом изобретения является также ЭПР-спектрометр для реализации соответствующего изобретению способа и способ достижения высокой точности, стабильности и высокой чувствительности регистрации спектров ЭПР. Соответствующий изобретению ЭПР-спектрометр как автоматизированный анализатор ЭПР удовлетворяет требованиям простого и надежного использования в практике современной клинической лаборатории, поскольку имеет встроенную автоматику для управления устройством, регистрации сигнала и оценки сигнала и взаимодействия с компьютерной программой для диагностического анализа измеряемых данных.

ЭПР-спектрометр 1 для реализации способа согласно изобретению состоит соответственно схеме на Фиг.1 из компактного броневого электромагнита 2 с Холл-системой стабилизации, измерительного резонатора 3, который соединен с гомодинным блоком 5 СВЧ, устройства 9 управления и регистрации сигналов и системы 7 терморегулирования исследуемых проб.

Устройство 9 управления и регистрации сигналов содержит два однокристальных микрокомпьютера (не представлены), из которых один служит как системный контроллер 10 для автоматизированной настройки и стабилизации, в то время как второй процессор 11 сигнала ЭПР выполняет алгоритм сканирования спектров, накапливает данные сигнала, выполняет их цифровую фильтрацию и запись.

Для записи спектров ЭПР исследуемую пробу помещают в измерительную ячейку резонатора 3, в котором волна СВЧ возбуждается основным генератором блока 5 СВЧ. Сигнал ЭПР измеряется посредством гомодинного волноводного блока как СВЧ-излучение, которое отражается измерительным резонатором 3.

Магнитное поле, необходимое для возбуждения сигнала ЭПР, создается электромагнитом 2. Источник 6 питания электромагнита 2 управляется процессором 11 сигнала ЭПР.

Блок 5 СВЧ управляется блоком 10 устройства управления, который обеспечивает точное согласование частоты измерительного резонатора 3 с основным генератором блока 5 СВЧ, и который контролирует терморегулятор 7 исследуемой пробы и связывает ЭПР-спектрометр 1 с персональным компьютером 8 оператора, который служит для управления спектрометром и анализа данных.

В отличие от известных ЭПР-спектрометров, которые содержат только элемент регулирования или частоты генератора или согласования частоты резонатора, причем согласование в большой полосе частот обеспечивается только посредством подстройки генератора, в то время как при согласовании резонатора регулируется только маленькая полоса частот, изобретенный спектрометр для стабилизации частоты при измерении различных проб оснащен двумя соединенными устройствами управления, одним для управления частотой генератора, вторым для частоты резонатора. Это необходимо, чтобы обеспечить, с одной стороны, большую ширину диапазона для применения к исследованию разнообразных различающихся проб, и, одновременно, чтобы обеспечить необходимое точное совпадение и воспроизводимость характерных особенностей спектров ЭПР при исследовании по соответствующему изобретению способу аликвот одной пробы.

Одно из устройств управления установлено на основном генераторе блока 5 СВЧ для согласования частоты в области 200-400 МГц, предпочтительно 300 МГц, с центральной частотой 9,45±0,5 ГГц. Второе устройство управления установлено на измерительном резонаторе 3 для согласования частоты резонанса в области 10-50 МГц, предпочтительно 30 МГц, посредством изменения объема полости резонатора с помощью плунжера, перемещаемого двигателем с редуктором.

Подстройка основного генератора блока 5 СВЧ после смены исследуемых проб происходит только тогда, когда область согласования частоты резонатора недостаточна. Это происходит в случае изменения типа исследуемых проб или в случае существенного изменения процедуры подготовки проб.

Если исследуется набор проб одного типа, их спектры регистрируются практически при одной частоте СВЧ. В этом случае фоновая линия спектра является идентичной для всех зарегистрированных спектров, что важно для точности последующего расчета характеристик исследуемых объектов.

Система 7 терморегулирования служит для стабилизации с высокой точностью температуры проб в области от 30 до 45°С.

В отличие от известных ЭПР-спектрометров, система 7 содержит дополнительную подсистему в виде дополнительного, не представленного, контура регулирования. Основной контур регулирования системы 7 терморегулирования состоит из регулируемого по температуре воздушного потока, продувающего ячейку резонатора, в зависимости от необходимости регулирования температуры ампулы с пробой, предварительно нагретым или предварительно охлажденным воздухом.

Дополнительный контур регулирования терморегулятора 7 служит для повышения точности стабилизации температуры пробы за счет уменьшения градиентов в пределах ячейки резонатора. С этой целью корпус резонатора 3 подогревается до заданной температуры пробы посредством саморазогрева магнита его тепловым излучением. При этом температура корпуса резонатора 3 измеряется с помощью датчика 4 температуры. Во время перерывов регистрации спектров источник 6 питания электромагнита 2 переключается на повышенные или пониженные значения.

Конструкция и большая масса компактного броневого электромагнита 2 обеспечивают дополнительную термоизоляцию резонатора 3 от влияний среды.

В отличие от известных спектрометров, для обеспечения анализа спектров ЭПР согласно изобретенному способу, посредством симуляции спектров ЭПР, потребовалось разработать специальный способ цифровой фильтрации, обеспечевающий регистрацию точной формы спектров для последующего расчета параметров спектров способом симуляции, так как, в отличие от известных способов, корреляции, вносимые в регистрируемый сигнал при фильтрации шумов и импульсных помех, должны быть минимизированы, чтобы при использовании изобретенного спектрометра обеспечивалась необходимая для реализации изобретенного способа высокая точность регистрации спектров ЭПР, стабильность и высокая чувствительность спектрометра.

Для этого процессор сигнала ЭПР реализует алгоритм сканирования спектра посредством регулирования источника питания.

Отсчеты сигнала ЭПР из блока 5 СВЧ преобразуются с помощью аналого-цифрового преобразователя с частотой 10 кГц и накапливаются в памяти сигнального процессора 11.

Так как типовое время сканирования спектра составляет более чем одну минуту и число отсчетов спектра составляет менее чем 10000, каждый отсчет спектра формируется из 60 или большего количества отсчетов спектра сигнала.

Определенная часть накопленных отсчетов спектра обычно ошибочна, так как ЭПР-спектрометр - это ультрачувствительный прибор, который может реагировать на электромагнитные помехи или механические вибрации.

В отличие от известных ЭПР-спектрометров, высокую чувствительность и стабильность изобретенного ЭПР-спектрометра достигают за счет применения специального алгоритма расчета каждого отсчета спектра, в котором N значений S_i сигнала ЭПР, накопленных для каждого отсчета спектра, суммируются со специальными весовыми коэффициентами k_i. Эти весовые коэффициенты обратно пропорционы к квадратам ошибок измерения регистрируемых значений сигнала.

Ошибка Δ i-го значения сигнала рассчитывается как разница между этим значением S_i и арифметическим средним других (N - 1) значений:

Формула для расчета отсчета спектра сигнала имеет вид

Если значение S_i содержит импульсный шум, значение ошибки Δ_i повышается (например, в десять раз) и соответствующий весовой коэффициент k_i многократно уменьшается (в сто раз для указанного примера). Вследствие этого в изобретенном ЭПР-спектрометре, в отличие от известных ЭПР-спектрометров, из регистрируемых данных спектра исключаются значения с импульсными шумами. Указанный алгоритм применяется для накопления каждого из регистрируемых отсчетов спектра.

В результате обеспечивается высокая чувствительность и стабильность регистрации спектров ЭПР. Одновременно предотвращается возникновение дополнительных корреляций между соседними отсчетами спектра, которые (при использовании известных способов фильтрации сигналов ЭПР) в методе симуляции спектров представляют одну из главных причин снижения точности определения параметров спектров.

Зарегистрированные спектры ЭПР анализируют с помощью специального программного обеспечения ЭПР (MMS), причем при скрининг-анализе ЭПР программа выполняет алгоритм регистрации для измерения трех аликвот и оценивает результаты согласно правил оценки с помощью дискриминантных функций согласно Таблице 5.

Для проведения комплексного анализа ЭПР программа выполняет измерительный алгоритм для пяти, предпочтительно до восьми аликвот, результаты которого определяют путем реализации алгоритма расчета транспортных свойств альбумина с помощью математического метода регрессии.

Программа обеспечивает простоту выполнения автоматизированных измерений пробы и ее оценки, не требуется специальной подготовки или квалификации персонала, выполняющего измерения.

На фиг.2 представлена индуцированная модификация параметров связывания спинового зонда в сывороточном альбумине пациентов с заболеваниями раком и без таковых как результат влияния алкоголя на конформацию молекулы альбумина.

а)проба сыворотки содержит 50 мкл сыворотки, 10 мкл расвора спинового зонда в спирте с концентрацией 0,5·10^-2 моль/л, конечная концентрация спинового зонда 8,33·10^-4 моль/л

b)проба сыворотки содержит 50 мкл сыворотки, 12 мкл раствора спинового зонда в спирте с концентрацией 0,8·10^-2 моль/л, конечная концентрация спинового зонда 1,55·10^-3 моль/л

c)проба сыворотки содержит 50 мкл сыворотки, 14 мкл раствора спинового зонда в спирте с концентрацией 1,1·10^-2 моль/л, конечная концентрация спинового зонда 2,41·10^-3 моль/л

[110]...[529]:коды исследования для пациентов.

На фиг.3 показаны предпочтительные концентрации спинового зонда (16-доксил-стеариновая кислота) и полярного реагента (этиловый спирт).

Изобретение поясняется на нижеследующих конкретных примерах:

Пример 1

Исследование пациентов с онкологическими заболеваниями и здоровых лиц посредством скрининг-анализа ЭПР (анализ трех спектров)

Сыворотку крови получали центрифугированием цельной крови, пробы сыворотки делили на 3 аликвоты. Пробы одной сыворотки по 50 мкл соответственно смешивали с 10; 12; и 14 мкл раствора спинового зонда в этаноле (Конечная концентрация спинового зонда 8,33·10^-4; 1,55·10^-3 и 2,41·10^-3 моль/л). Подготовленные смеси инкубировали 10 мин при 37°С при непрерывном встряхивании.

После инкубирования подготовленные пробы поместили в три капилляра. Спектры ЭПР регистрировали для каждого капилляра в резонаторе ЭПР-спектрометра при одинаковой постоянной температуре (37±0,2)°С.

Каждый записанный спектр ЭПР - это суперпозиция специфичных спектров молекул спинового -зонда, иммобилизованных на различных центрах связывания, что характерно для длинноцепочечных жирных кислот. Эти центры связывания локализованы в сывороточном альбумине исследуемой сыворотки крови.

Три зарегистрированных спектра ЭПР вводили в компьютер для расчета параметров связывания спинового зонда. Этот анализ выполняли раздельно для каждого центра связывания с помощью описанного выше способа симуляции спектров ЭПР.

Таблица 7 и Фиг.2 содержат примеры определения параметров спинового зонда (16-DS) в сывороточном альбумине нескольких пациентов с заболеваниями раком и без таких заболеваний:

1. Пациенты с заболеваниями раком

1. Пациент, код исследования 506. Клинический диатез: карцинома пищевода.

2. Пациент, код исследования 507. Клинический диагноз: карцинома желудка.

3. Пациент, код исследования 528. Клинический диагноз: рак молочной железы.

4. Пациент, код исследования 529. Клинический диагноз: легочная карцинома.

2. Пациенты без онкологических заболеваний

1. Пациент, код исследования 110, 42 года. Клинический диагноз: диффузная мастопатия. Никаких гистологических свидетельств для рака.

2. Пациент, код исследования 111. 23 года. Клинический диагноз: здоровое общее самочувствие.

3. Пациент, код исследования 112. 22 года. Клинический диагноз: здоровое общее самочувствие.

4. Пациент, код исследования 113, 40 лет. Клинический диагноз: ревматическое заболевание сердца.

Таблица 7 и Фиг.2 подтверждают, что измеренные параметры связывания спинового зонда, для пациентов с заболеваниями раком и пациентов без признаков рака, отличаются только при повышенных концентрациях полярного реагента спирта (пробы сыворотки В и С). Эти различия показывают специфическую модификацию конформационной подвижности молекул сыворотки в пробах крови пациентов с раковыми заболеваниями.

Пример 2

Комплексный ЭПР-спектроскопический анализ (анализ 3-х и 8 спектров) транспортной функции альбумина в нативных сыворогках здоровой популяции (женщины и мужчины)

Пробы одной сыворотки объемом по 50 мкл смешивали с 3 - 8 различными концентрациями спинового зонда 16-доксил-стеариновая кислота (разведенного в этиловом спирте), так, что конечная концентрация спинового зонда составляла от 0,83·10^-3 до 2,34·10^-3 моль/л, и конечная концентрация этилового спирта составляла от 1,86 до 3,8 моль/л. Значение рН проб сыворотки после смешивания со спиновым зондом составляло 7,4±0,05. Подготовленные смеси инкубировали 10 мин при 37°С при непрерывном встряхивании и после инкубирования переносили в стеклянные капилляры для регистрации спектров ЭПР и ЭПР-анализа. Регистрацию спектров проводили в соответствующем изобретению спектрометре ЭПР, ЭПР-спектры регистрировали для каждого капилляра в резонаторе ЭПР-спектрометра при постоянно стабилизируемой температуре (37±0,2)°С. Для всех зарегистрированных ЭПР-спектров (3 и 8 спектров) каждой пробы параметры связывания спинового зонда рассчитывали с помощью соответствующего изобретению компьютерного программного обеспечения, встроенного в ЭПР-анализатор. Для симуляции регистрируемых экспериментальных ЭПР-спектров от различных спиновых зондов использовали модель спектра ЭПР (функция Гамильтона с аксиальной анизотропией). Параметры связывания спинового зонда в сывороточном альбумине определяли при симуляции путем минимизации квадратов отклонений модельных и экспериментально зарегистрированных спектров ЭПР. Анализ проводили отдельно для каждого центра связывания с помощью компьютерной программы расчета ЭПР-параметров, характеризующих конформацию и функциональность альбумина.

Параметры транспортной функции альбумина в нативной сыворотке здоровых доноров крови и плазмы представлены в Таблице 8 как пример нормальной транспортной функции альбумина. С помощью комплексного анализа ЭПР-спектров в пробах сыворотки этих здоровых доноров не было выявлено никаких ненормальностей.

Пример 3

Расширенный ЭПР-спектроскопический анализ (анализ 3-х спектров и трехмерный анализ) транспортной функции альбумина в нативной сыворотке пациентов с заболеваниями гематологической системы (гемабластоз, хронический лимфолекоз (CML), Plasmocytom)

Сыворотку крови получали центрифугированием цельной крови, пробы сыворотки делили на 3 аликвоты. Пробы одной сыворотки по 50 мкл соответственно смешивали с 10; 12 14 мкл раствора спинового зонда в этаноле (Конечная концентрация спинового зонда 0,83·10^-3; 1,61·10^-3 и 2,34·10^-3 моль/л). Подготовленные смеси инкубировали 10 мин при 37°С при непрерывном встряхивании.

После инкубирования подготовленные пробы перенесли в 3 капилляра. Спектры ЭПР записывали для каждого капилляра в резонаторе соответствующего изобретению ЭПР-спектрометра при постоянной температуре 37±0,2°С. Три записанных спектра ЭПР передали в компьютер для расчета параметров связывания спинового зонда. Анализ проводили раздельно для каждого центра связывания описанным выше способом симуляции спектров ЭПР, с помощью соответствующего изобретению компьютерного программного обеспечения.

Злокачественные гематологические системные заболевания могут выявляться при ЭПР-скрининге. В таблице 9 представлены дискриминационные параметры проб сыворотки пяти пациентов с CML и трех пациентов с Plasmocytom. Дискриминационные функции D₁-D₅ дают в итоге типичную картину наличия заболевания раком, которая также проявляется при трехмерном анализе центров связывания жирных кислот.

Пример 4

Расширенный анализ ЭПР-спектров (анализ 3-х спектров и трехмерный анализ) транспортной функции альбумина проб альбуминсодержащих лекарств для контроля качества

Пробы альбуминсодержащих лекарств (растворы альбумина, замороженная свежая плазма) объемом по 50 мкл смешивали с 3 - 8 различными концентрациями спинового зонда 16-доксил стеариновая кислота (растворенным в этиловом спирте), так, что конечная концентрация спинового зонда составляла от 0,83·10^-3 до 2,34·10^-3 моль/л, и конечная концентрация -этилового спирта оставляла от 1,86 до 3,8 моль/л. Значение pH проб сыворотки после смешивания со спиновым зондом составляло 7,4±0,05. Подготовленные смеси инкубировали 10 мин при 37°С при непрерывном встряхивании и после инкубирования поместили в стеклянные капилляры для регистрации спектров ЭПР и ЭПР-анализа. Регистрацию спектров проводили на соответствующем изобретению ЭПР-спектрометре. Спектры ЭПР регистрировали для каждого капилляра в резонаторе ЭПР-спектрометра при непрерывно стабилизируемой температуре (37±0,2)°С. Для всех, зарегистрированных от каждой аликвоты спектров ЭПР (3 и 8 спектров), параметры связывания спинового зонда рассчитывали с помощью соответствующего изобретению компьютерного программного обеспечения, встроенного в ЭПР-апализатор. Для симуляции экспериментально зарегистрированных различных спектров ЭПР спинового зонда использовали одну модель спектра ЭПР (функция Гамильтона с аксиальной анизотропией). Параметры связывания спинового зонда в сывороточном альбумине получали при симуляции путем минимизации квадратов отклонений модельного и экспериментально зарегистрированного спектров ЭПР. Анализ проводили отдельно для каждого центра связывания. ЭПР-параметры, характеризующие функциональность и конформацию альбумина определяли соответствующей изобретению компьютерной программой.

Расширенный анализ спектров ЭПР (анализ 3-х спектров и трехмерный анализ) предназначен для контроля качества транспортной функции альбумина и для технологического контроля при изготовлении альбуминсодержащих лекарств. Таблицы 10 и 11 показывают процесс-сопровождающее применение ЭПР-технологии анализа 3-х и 8-ми спектров для по-разному полученных (плазма цельной крови в сравнении с от аферезплазмой (Aphereseplasma)) и подвергнутой обработке (отфильтрованной = leukozytendepletierte - удаление лейкоцитов) продуктов плазмы (таблица 10), а также для нормального и денатурированного альбумина (таблица 11). Хорошо видно, что возможно анализировать как эффективность транспортной функции альбумина конечных продуктов (например, растворы альбумина, замороженная свежая плазма могут оцениваться для переливания), так и отдельные этапы процесса изготовления определяя их влияние на качество транспортных свойств альбумина.

Таблица 1
Предпочтительные концентрации спинового зонда (16 доксил стеариновая кислота) и полярного реагента (этиловый спирт)
1. Скрининг-анализ ЭПРОбозначение аликвотыКонечная концентрация спиновый зонд/ альбумин (FS/SA)Конечная концентрация спинового зонда, 10^-3 М для сывороточного альбумина*,Конечная концентрация полярного реагента, М** (Ethanol konzentration)А1,65000,832,90В3,28701,613,37С4,94302,343,802. Комплексный анализ ЭПР-спектровОбозначение аликвотыКонечная концентрация спиновый зонд /альбумин (FS/SA)Конечная концентрация спинового зонда, 10^-3М для сывороточного альбумина*,Конечная концентрация полярного реагента, М** (Ethanol konzentration)А1,65000,832,90В3,28701,613,37С4,94302,343,80D2,31001,093,80Е3,83461,823,80F3,28680,891,86G4,94341,312,14Н5,04401,782,90Точка (Р0), изображена на графиках для конечных концентрацийРО1,65000,451,58и вычислена программой.Р0 = предельное экспериментальное значение нативной конформации альбумина
* = физиологическая концентрация альбумина в сыворотке или плазме 35-45 g/l
** = значения для полярного реагента этилового спирта

Матрица распределения концентраций в аликвотах (Пример - относительное количество молекул спинового зонда в BS-2-втором центре связывания) приведена на фиг.3.

Таблица 2
Параметры спинового зонда 16DS, определяемые по спектрам ЭПР и их корреляция с характеристиками конформации и функциональности альбумина.Параметры связывания спинового зондаЕдиницыОбозначениеX_lВиофизическая характеристикаПервая компонента спектра   Первый центр связывания1. Относительная концентрация спинового зондаотн.ед.С_l0,6Специфичная емкость центра связывания2. Изотропный g-факторотн.ед.g₀₁2,0Интегральная характеристика конформации центра связывания3. Степень анизотропии g-фактораотн.ед.δg_l-6, 10Е^-04Характеристика микроокружения спинового зонда в центре связывания4. Изотропная константа СТСmTА_l1,62Характеристика размера центра (в обратной пропорции)5. Степень анизотропии СТСотн.ед.δА_l1,27Степень упорядоченности и спинового зонда6. Ширина низкополевой спектральной линииmTW_Ll0,28Характеристика подвижности спинового зонда7. Ширина центральной спектральной линииmTW_Ml0,27Характеристика подвижности спинового зонда8. ширина высокополевой спектральной линииmTW_Hl0,31Х арактеристика подвижности спинового зондаВторая компонента спектра   Второй центр связывания9. Относительная концентрация спинового зондаотн. ед.С₂0,39Специфичная емкость центра связывания10. Изотропный g-факторотн.ед.g₀₂2,0Интегральная характеристика конформации центра связывания11. Степень анизотропии g-фактораотн. ед.δg₂8,30E^0,5Характеристика микроокружения спинового зонда в центре связывания12. Изотропная константа СТСmTА₂1,47Характеристика размера центра (в обратной пропорции)13. Степень анизотропии СТСотн.ед.δА₂-0,12Степень упорядоченности спинового зонда14. Ширина низкополевой спектральной линииmTw_l20,44Характеристика подвижности спинового зонда15. Ширина центральной спектральной линииmTw_m20,32Характеристика подвижности спинового зонда16. Ширина высокополевой спектральной линииmTW_Н20,74Характеристика подвижности спинового зондаТретья компонента спектра*   Третий центр связывания17. Относительная концентрация спинового зондаОтн.ед.С₃9,71Е^-0,3Специфичная емкость центра связывания* Примечание: Так как третья компонента спектра соответствует спиновому зонду в центрах связывания с низким сродством, ее другие характеристики являются неинформативными.

Таблица 5
Примеры дискриминантных функцийОпределение* d_iОписание параметровD_l=К₁×(|у₂-у₁|+|у₃-у₂|), где у₁=С1(А), у₂=С1(В), у₃=С1(С)Три параметра относительной концентрации спинового зонда в первом центре связывания сывороточного альбумина для трех проб сыворотки А, В и СD₂=K₂×(y₃-y₁-0,5), где у₁=С2(А), у₃=С2(С)Два параметра относительной концентрации спинового зонда во втором центре связывания сывороточного альбумина для проб сыворотки А и СD₃=К₃×(|у₂-у₁|+|у₃-у₂|), где у₁=С2(А), у₂=С2(В), y₃=С2(С)Три параметра относительной концентрации спинового зонда во втором центре связывания сывороточного альбумина для трех проб сыворотки А, В и СD₄=K₄×(C3(C)-C3(A)+0,5)Два параметра относительной концентрации спинового зонда в третьем центре связывания сывороточного альбумина для проб сыворотки А и СD₅=К₅×(|С1(С)-С1(А)|+|С2(С)-С2(А)|+|С3(С)-С3(А)|)Шесть параметров относительной концентрации спинового зонда в различных центрах связывания сывороточного альбумина для проб сыворотки А и СD₆=2-Р₂(С)·K₆Фактор полярности микроокружения спинового зонда во втором центре связывания жирных кислот пробы сыворотки С* Параметры С1, С2 и С3 - значения относительной концентрации спинового зонда соответственно в центрах связывания 1, 2 и 3. Фактор Р₂ полярности рассчитывается как Р₂=1,47333 / А₂ (mT), причем А₂ представляет изотропную константу СТС второго центра связывания жирных кислот. Символы А, В и С обозначают номера проб соответственно серии измеренных проб сыворотки исследуемой пробы крови как указано ниже:
А - проба сыворотки с конечной концентрацией спинового зонда 8,3*10^-4mol/l
В - проба сыворотки с конечной концентрацией спинового зонда 1,61*10^-3mol/l
С - проба сыворотки с конечной концентрацией спинового зонда 2,34*10^-3mol/l.

Коэффициенты К1 до К6 определяются в зависимости от конкретных концентраций используемых реактивов и от результата расширения и уточнения данных о параметрах сывороточного альбумина по возможно большему числу пациентов с раком и здоровых лиц. Коэффициенты К1 до К6 могут принимать, например, значения

К₁=7,843; К₂=-1,517; К₃=6,3; K₄=1,881; K₅=3,009; K₆=1,002.

Таблица 6
Диагностическая точность тестов на основе дискриминационных функций в результате клинического исследования 212 пациентов с заболеваниями раком (желудок, пищевод, прямая кишка, печень, легкие, молочная железа, карцинома простаты) и 87 пациентов без заболевания раком.Дискриминационная функцияДиагностическая чувствительность, %Диагностическая специфичность, %Диагностическая точность, %D₁92,3±7,492,3±7,492,3±7,4D₂96,0±4,092,3±7,495,0±5,0D₃96,0±4,096,0±4,096,0±4,0D₄96,0±4,084,6±10,090,3±7,1D₅96,0±4,092,3±7,494,2±5,2

Таблица 7
Параметры связывания спинового зонда в специфических центрах связывания альбумина в выполненных примерах для пациентов с и без заболевания раком, указанным в Таблице 3Код исследованияПараметры* связывания спинового зонда в трех центрах связывания альбуминаПроба сыворотки АПроба сыворотки ВПроба сыворотки СС1С2C3С1С2C3С1С2C3Пациенты с раком5060,5040,4760,01710,4950,4680,03280,5640,3730,05615070,5060,4740,02020,5160,4440,03590,6650,2120,10925280,4530,5240,02180,4750,4850,03570,5390,4010,05455290,4570,5210,02030,5280,4380,02950,6090,3240,0596Пациенты без злокачественных опухолей1100,5170,4690,01350,5120,4610,02510,5490,4090,03691110,5390,4510,00830,5550,4250,01680,5790,3980,01931120,5140,4690,01610,5410,4350,02220,5560,4120,02871130,5100,4710,01750,5190,4560,02150,5510,4010,0421*Для каждого из исследованных пациентов представленные параметры были определены одним ЭПР-анализом трех проб сыворотки, обозначенных как А, В, С. Пробы А, В и С смешивались с 10 мкл, 12 мкл и 14 мкл соответственно алкогольного раствора спинового зонда (конечная концентрация спинового зонда 8,33·10^-4 mol/l, 1,55·10^-3 mol/l и 2,41·10^-3 mol/l соответственно).

Представленные параметры обозначают:

С1 - относительная концентрация спинового зонда в первом центре связывания;

С2 - относительная концентрация спинового зонда во втором центре связывания;

С3 - относительная концентрация спинового зонда в третьем центре связывания

Таблица 8
ЭПР-параметры здоровых лиц (16 мужчин, 18 женщин). Скрининг-параметры функциональности альбуминаПараметрЕд.изм.ЧислоСреднееSDD1отн.ед.320,6170,076D2отн.ед.320,8920,023D3отн.ед.320,6630,089D4отн.ед.320,9560,002D5отн.ед.320,4870.073Физико-химическая характеристика центров связывания жирных кислотПараметрЕд. изм.ЧислоСреднееSDК_в10⁷М328,440,46N₁ ⁰отн.ед.3210,320,11R₂отн.ед.320,870,02С_ротн.ед.320,300,00К₂отн.ед.321,490,11L₂отн.ед.322,430,12Характеристики альбумина для транспорта, загрузки и разгрузкиПараметрЕд.изм.ЧислоСреднееSDN₁ ⁰отн.ед.3210,320,11N_t ⁰отн.ед.3219,320,36N_L ⁰отн.ед.3219.320.36N_U ⁰отн.ед.3222,240,27K_T10⁷M32150,446,95K_L10⁷М32150,446,95D_U10^-7М^-1320,060,00

Таблица 9
Скрининг-параметры функциональности альбумина CLLPlasmocytomПараметрЕд. изм.ЧислоСреднееSDЧислоСреднееSDD1отн.ед.51,1340,21831,4240,414D2отн.ед.51,0300,03331,0960,085D3отн.ед.51,1270,13831,4020,352D4отн.ед.50,9800,02531,0060,007D5отн.ед.51,2190,16531,3200,337

Таблица 10
ЭПР-параметры по-разному полученных и обработанных продуктов плазмы (замороженной свежей плазмы). Плазма цельной кровиАферез-плазмаФильтрованная плазмаПараметрЕд.изм.ЧислоСреднееSDЧисло СреднееSDЧислоСреднееSDСкрининг-параметры функциональности альбуминаD1отн.ед211,400,24102,580,65211,720,25D2отн.ед211,100.05101,220,09211,100,05D3отн.ед211,510,20101,910,36211,760,30D4отн.ед.210,960,01100,960,01210,970,01D5отн.ед211,210,19101,730,30211,220,17Физико-химическая характеристика центров связывания жирных кислотК_в10⁷ М^-1217,621,021016,732,80219,181,63N₁ ⁰отн.ед.218,090,47106,990,59718,930,52R₂отн.ед.210,900,05101,120,10210,800,07С_ротн.ед.210,340,01100,320,02210,350,02К₂отн. ед.211,720,12101,380,17212,110,17L₂отн.ед.211,970,16100,720,47212,290,18Характеристики альбумина для транспорта, загрузки и разгрузкиN₁ ⁰отн.ед.219,090,47106,990,59218,930,52N_т ⁰отн.ед.2117,31,041015,01,562116,11,19N_L ⁰отн.ед.2117,31,041015,01,582116,11,19N_U ⁰отн.ед.2118,81,051013,61,112118,41,23К_Tотн.ед.21117,93,710216,320,921125,615,0K_Lотн.ед.21117,99,710216,320,921125,615,0D_Uотн.ед.210,0590,006100,0410,005210,0520,005

Таблица 11
ЭПР-параметры нормального и денатурированного растворов альбуминаСкрининг-параметры Функциональности альбуминаНормальный альбумин Денатурир. альбуминПараметред.изм.ЧислоСреднееSD ЧислоСреднееD1отн.ед.50,2390,193 10,574D2отн.ед.50,7840,058 10,919D3отн.ед.50,1050,224 10,668D4отн.ед.50,9890,006 10,997D5отн.ед.50,1700,185 10,630Физико-химические характеристики центров связывания жирных кислотК_B10⁷ М^-1К_B26,56,3 13,2N₁ ⁰отн.ед.N₁ ⁰6,300,86 111,00R₂отн.ед.R₂0,740,05 10,53С_ротн.ед.С_р0,290,02 10,37К₂отн.ед.K₂0,460,26 11,32L₂отн.ед.L₂-3,192,73 13,06Характеристики альбумина для транспорта, загрузки и разгрузкиN₁ ⁰отн.ед.N₁ ⁰6,300,86 111,00N_T ⁰отн.ед.N_T ⁰10,91,57 116,8N_L ⁰отн.ед.N_L ⁰10,91,57 116,8N_U ⁰отн.ед.N_U ⁰10,91,59 119,4К_T10⁷ МК_T28169 153K_L10⁷ MK_L28169 153D_U10^-7 M^-1D_U0,040,01 10,07

Изобретение относится к области измерительной техники, в частности к технике измерения свойств альбумина в альбуминсодержащей пробе. Технический результат - расширение функциональных возможностей. Для достижения данного результата в исследуемой пробе индуцируют целенаправленные конформационные изменения молекулы альбумина. При этом к аликвотам пробы добавляют как минимум три различных концентрации связывающегося с альбумином спинового зонда и дополнительно минимум три различных концентрации полярного реагента. Из спектров ЭПР аликвот со спиновым зондом и полярным реагентом на основе компьютерной имитации спектров ЭПР определяют степень изменения параметров связывания спинового зонда в центрах связывания альбумина в зависимости от концентрации спинового зонда и концентрации полярного реагента. Изменения транспортных свойств альбумина рассчитывают на основе изменений значений параметров связывания спинового зонда при различных концентрациях спинового зонда и полярного реагента. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ ЭПР-спектроскопического определения изменений транспортных свойств альбумина в альбуминсодержащей пробе, согласно которому в исследуемой пробе индуцируют целенаправленные конформационные изменения молекулы альбумина, в котором к аликвотам пробы добавляют как минимум три различных концентрации связывающегося с альбумином спинового зонда и дополнительно минимум три различных концентрации полярного реагента, из спектров ЭПР аликвот со спиновым зондом и полярным реагентом на основе компьютерной имитации спектров ЭПР определяют степень изменения параметров связывания спинового зонда в центрах связывания альбумина в зависимости от концентрации спинового зонда и концентрации полярного реагента, а изменения транспортных свойств альбумина рассчитывают на основе изменений значений параметров связывания спинового зонда при различных концентрациях спинового зонда и полярного реагента, индуцирующих конформационные изменения альбумина, причем концентрации добавляемого спинового зонда выбирают таким образом, чтобы среднее значение отношения концентрации спинового зонда к концентрации альбумина составляло 2,5±0,5, и, исходя из этого среднего значения, выбирают минимум две дополнительных концентрации, которые отличаются от среднего значения не менее чем на 1,0, а концентрации добавляемого полярного реагента выбирают таким образом, чтобы среднее значение конечной концентрации полярного реагента составляло (0,6±0,25)-Ср, где Ср - критическая концентрация полярного реагента, превышение которой приводит к денатурации альбумина, и, исходя из этого среднего значения, выбирают по меньшей мере две дополнительные концентрации полярного реагента, отклонение которых от этого среднего значения составляет минимум 15%, причем концентрации спинового зонда и полярного реагента, которые добавляются к аликвотам пробы, выбирают в пределах вышеопределенных областей концентраций таким образом, чтобы обеспечить минимально в одной аликвоте низкую концентрацию зонда и низкую концентрацию полярного реагента, минимально в одной аликвоте среднюю концентрацию полярного реагента и среднюю концентрацию спинового зонда и минимально в одной аликвоте высокую концентрацию зонда и высокую концентрацию полярного реагента.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительные концентрации спинового зонда и полярного реагента выбирают таким образом, чтобы обеспечить минимально в одной аликвоте высокую концентрацию зонда и низкую концентрацию полярного реагента.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительные концентрации спинового зонда и полярного реагента выбирают таким образом, чтобы иметь минимально в одной аликвоте низкую концентрацию зонда и высокую концентрацию полярного реагента.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве альбуминсодержащей пробы используют анализ крови или пробу лекарства.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве спинового зонда используют соединение, которое связывают с альбумином, предпочтительно используя спинмеченую жирную кислоту, наиболее предпочтительно доксил-стеариновую кислоту.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полярного реагента используют спирт или DMSO, предпочтительно этиловый спирт.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что параметры связывания спинового зонда в аликвотах пробы крови определяют при различных температурах от 15 до 45°С и/или при различных значениях рН от 7,5 до 3,5.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что параметры связывания альбумина определяют на основе метода математической регрессии зависимости параметров связывания спинового зонда в аликвотах от изменения концентрации спинового зонда и концентрации полярного реагента, при этом на основе этих параметров связывания рассчитывают изменение транспортных свойств альбумина.9. Способ по п.1, отличающийся тем, что его применяют для диагностики и/или контроля физиологических или патологических изменений в организме человека или животного, осуществляют на основе полученных параметров связывания альбумина, в зависимости от диагностируемого физиологического или патологического изменения, при этом определяют параметры связывания альбумина, предпочтительно относительно концентрации C1, C2, С3 спинового зонда в центрах связывания жирной кислоты в аликвотах, которые сравнивают на основе использования дискриминантной функции с предварительно определенными отсекающими значениями (cut-off), установленными для референсных проб.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что его применяют для диагностики и/или контроля онкологических заболеваний.11. Способ по п.10, отличающийся тем, что определяют один или некоторые из параметров D_i дискриминантных функций, согласно таблице 5, причем онкологическое заболевание обнаруживают, если один из параметров D_i>1.12. Способ по п.1, отличающийся тем, что его применяют для определения и контроля качества альбуминсодержащих препаратов, преимущественно препаратов крови или препаратов плазмы, в котором изменение транспортных свойств альбумина ставят в соответствие к транспортным свойствам исходного материала и/или нативного сывороточного альбумина здоровых лиц.13. Тестовый набор для реализации способа по любому из пп.1-12, состоящий из пластмассовой пластины с множеством ячеек, предпочтительно многоячеечного планшета, ячейки которого содержат фиксированные, стабилизированные и точно дозированные различные концентрации спинового зонда и полярного реагента.14. ЭПР-спектрометр для реализации способа по любому из пп.1-12, состоящий из компактного броневого электромагнита (2) с Холл-системой стабилизации, измерительного резонатора (3), который соединен с блоком (5) СВЧ с регулируемым основным генератором для согласования частоты в первой области от 200 до 400 МГц центральной частоты 9,45±0,5 ГГц, устройства (9) управления и регистрации сигнала и системы (7) регулируемого термостатирования исследуемых проб, причем для компенсации различий частоты при регистрации спектров аликвот одной исследуемой пробы путем регулирования измерительного резонатора (3), измерительный резонатор (3) снабжен дополнительным регулятором для согласования частоты резонанса во второй области от 10 до 50 МГц посредством изменения объема полости резонатора, при этом система (7) регулируемого термостатирования содержит дополнительный контур регулирования для повышения точности стабилизации температуры проб путем минимизации градиентов в пределах шахты резонатора за счет саморазогрева электромагнита, который во время приостановления регистрации спектров управляет его саморазогревом, регулируя электрический ток в электромагните, теплое излучение которого подогревает резонатор, а корпус резонатора (3) снабжен датчиком (4) температуры для регулирования электромагнитного саморазогрева электромагнита, что обеспечивает разогрев резонатора до конкретной температуры пробы.15. Способ регистрации спектров ЭПР в ЭПР-спектрометре, согласно которому в процессе компьютерной симуляции спектров ЭПР обрабатывают зарегистрированные данные сигнала ЭПР, причем корреляцию данных сигнала, которая возникает в процессе фильтрации шума сигнала и импульсных помех, снижают на основе цифровой фильтрации регистрируемого сигнала ЭПР, при которой для расчета каждого отсчета S спектра накапливают N значений сигнала ЭПР S_i, которые суммируют с весовыми коэффициентами k_i, причем весовые коэффициенты k_i, обратно пропорциональные квадратам ошибок измерения регистрируемых значений, определяют на основе использования следующего выражения:

а отсчет спектра определяют на основе выражения вида