Способ определения катехоламинов в биологической жидкости Советский патент 1980 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к anajfasy биологических объектов, преимущественно в диагностических и прогности ческих целях. Известен способ определения катехоламинов в биологической жидкости, заключающийся в том, что к пробе биологической жидкости одновременно добавляют антисыворотку к определен ному катехоламину и меченый катёхоламин/инкубируют полученную смесь при в течение 18 ч, отделяют несвязавшийся меченый катех.оламнн с последующим определением радиоактив ности связавшегося с антисывороткой меченого катехоламина р-1 Недостатком известного способа является его длительность. Цель изобретения - сокращение вре мени проведения анализа. Указанная цапь достигается тем, антисыворотку к определяемому катехоламину и меченый катехоламин предварительно смешивают, полученную смесь инкубируют и после добавления к ней пробы биологической жидкости смесь повторно инкубируют и снимаю спектр электронного парамагнитного .резонанса, причем н качестве мечено го катехоламина используют катехоламин общей формулы R - Н, где R - катехоламин, соответствующий oпpeдeляe юмy, 1. НС. - N / -о; 1) -( /V Чс, о CHj пз При предварительном смешивании антисыворотки и катехоламина с ковалентно присоединенным к нему свободно-радикальным соединением происходит полное связывание антисыворотки с меченым катехоламином. Полученную смесь инкубируют в течение 1 ч для полного взаимодействия компонентов и затем добавляют к ней пробу вещества. Полученный состав повторно инкубируют в течение 30 мин при этом происходит конкурентное вытеснение определяемым катехоламином биологической жидкости эквивален кого количества меченого катехоламина, связанного с антисывороткой. Вытесненный с поверхности молекул определенного класса белков (антисыворотки) меченый катехоламин, количество которого эквивалентно опре деляемому в биологической жидкости, подвергают, не отделяя от состава, спектральному анализу и по спектру ЭПР определяют количество катехоламина в пробе, вещества. Приготовление специфических к катехоламину антител. Получают конъюгат бычьего сывороточного альбумина (БСА) с норадреналином (НА) с помощью конъюгирующего реагента водорастворимого карбодиимида (ВКД). 1 г БСА растворяют в 10 мл дистиллированной воды. В раствор добавляют 1 г НА. К получен ному раствору приливают 0,5 г метапара-толу олсульфонат- 1-циклогексил3(2-МОРФОЛИНИЛ-4-ЭТИЛ)карбодиимида, растворенного в 5 мл воды. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре сутки. Затем проводят диализ в течение 3 сут против дистиллированной воды. О,75 полученного конъюгата растворяют в 30 мл .дистиллированной воды и добавляют 0,125 г фенола, 0,225 г NaCl и 7,5 мл геля А1 (OH).j . 2,5 мл этой смеси вводят внутримышечно животным в два места раз в неделю в течение шести недель. Через неделю после последней инъекции у кролика берут кровь. Наличие антител к гаптену в антисыворотке определяют им мунодиффузией в агаре по методу Сух терлони. Получение спин-меченого норадренсшина. 3,6 мг НА растворяют в 1 мл 0,05 боратного буфера рН 9,0. В раствор вносят 17 мг иминоксильного радикал Смесь перемешивают 6 ч при комнатно температуре, затем добавляют 1 мг натрииборгидрида и смесь перемешива ют еще 2 ч. Раствор нейтрализуют 0,1н. раствором НС1 и освобождают от .непрореагированного радикала гел фиф,трацией через колонку с сефадек сом С-10, используя в качестве элюирующего раствора бидистиллированну воду. Степень очистки контролируют спектрофотометрически, методом ЭПР и с помощью тонкослойной хроматогра фии. Получение спин-меченого комплек са гаптен-антитело. Б тонкостенную стеклянную ампулу вносят 10 мкл Ь-глобулиновой фракции сыворотки иммунизированного кролика и 10 мкл раствора спин-мечено го .норадреналина, содержащего 10 моль/л иминоксильного радикала, смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Контроль за полнотой взаимодействия гаптенантитело проводят на ЭПР-спектрометре. Построение калибровочной кривой Градуировку производят по спинмеченому комплексу гаптен-антитело, содержащему известную концентрацию норадреналина. В 4 ампулы, содержащие по 20 мл раствора спин-меченого комплекса, добавляют по 30 мкл стандартного раствора нррадреналина следующих концентраций: 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 2,0 мкг/мл. Растворы перемешивают и инкубируют Втечение 30 мин. При последующем измерении на ЭПР-спектрометре снимают характеристики полученных спектров . Строят калибровочную кривую зависимости амплитуды полученного сигнала от концентрации норадреналина в стандартных растворах. Пример 1. Количественное определение норадреналина в моче. Пробу суточной мочи здорового человека концентрируют до объема 1 мл. В тонкостенную стеклянную ампулу вносят 10 мкл антисыворотки к норадреналину и 10 мкл меченого норадреналина (10 Г1) с общей структурнЪй формулой но CH-CH-NH Полученную смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 1 ч. Контроль за полнотой взаимодействия компонентов проводят на ЭПР-спектрометре. После инкубации к смеси добавляют 30 мкл пробы концентрированной мочи и полученный состав повторно инкубируют в термостате при 25°С в течение 30 мин. Затем ампулу, содержащую вышеуказанный состав, помещают в резонатор ЭПР-спектрометра и снимают спектр. Измеряют характеристики спектра и определяют количественное содержание нерадрёналина, исполь зуя при этом калибровочный график зависимости количественных характеристик спектру (отношение амплитуды второй компоненты спектра меченого норадреналина к амплитуде эталона Мп ) от количественного содержания норадреналина в стандартных растворах. Содержание норадреналина в 1 мл концентрированной мочи испытуемого Здорового человека, определенное предлагаемым способом, составляет 24,4 мкг.

Результаты количественного определения других катехоламинов в моче здорового человека, полученные предлагаемым способом,приведены в таблице.

Определение нужного катехоламина в в биологической жидкости предлагаемым

способом занимает всего 1,5 ч, что значительно меньше времени определения известнь способом (18 ч и дополнительная операция гтЬ отделению из«5ытка меченого катехоламина из состава).

Формула изобретения

Способ определения катехоламинов в биологической жидкости, путем добавления к пробе биологической жид.кости антисыворотки к определяемому катехоламину и меченого катехоламина, инкубирования полученной смеси, отличающийся тем что, с целью сокращения времени анализа, антисыворотку к определяемому катехоламину и меченый катехоламин предварительно смешивают, полученную смесь инкубируют и после добавления к ней пробы биологической жидкости смесь повторно инкубирют и снимают спектр электронного парамагнитного резонанса, причем в качестве меченого катехоламина используют катехоламин общей формулы

R - М,

где R - катехоламин, соответствующий определяемому.

о /I

м HjC

CW-,

о

10

НС-С

,1

-с- сн с«з

5

f

о

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Grota и., Rfown G. Antibodiesto Catecholamines.- Endocrinology 1976, 98,3,с,615,622 (прототип).