СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА ИЗ ПРОДУКТОВ ПЧЕЛИНОГО ПРОИЗВОДСТВА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СПИРОХЕТ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12S3/24 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства (обрезки, подмор, личинки трутней) и использованию их при изготовлении питательных сред для культивирования спирохет, и может быть использовано при промышленном приготовлении бактериальных вакцин.

Известен способ получения гидролизата белков крови ферментативного сухого (ГБК-С) для питательных сред тканевых культур клеток из отходов сывороточного производства, включающий измельчение 300 кг сгустков крови, соединение полученной массы с 480 л сыворотки при температуре 90°С и выдержку в течение 30 мин, охлаждение до 50°С, установление рН 7,5±0,1 путем добавления 20%-ного раствора гидроокиси натрия, 1,5% хлороформа, добавление 200 л ферментного препарата и осуществление гидролиза в течение 48-60 ч при 40-42°С, постоянно осуществляя коррекцию рН среды в пределах указанного значения. Гидролиз завершен, если через 48-60 ч в нем отсутствует нерасщепленный белок, а накопление аминного азота достигает не менее 600 мг% (см. Временное наставление по применению гидролизата, белков крови ферментативного сухого (ГБК-С) для питательных сред тканевых культур клеток, утвержденного зам. начальника Главного управления ветеринарии МСХ СССР 30.08.91 г.).

Недостатком данного способа и питательной среды (ПС) является то, что в качестве сырья использовались отходы только сывороточного производства в виде цельной крови и ее сгустков от крупного рогатого скота. Гидролиз сырья осуществлялся без предварительной химической обработки аммиаков, в результате чего не достигалось полного гидролиза, причем применялась только поджелудочная железа свиньи.

Известен способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда для культивирования клеток эукариотов, включающая обработку белоксодержащего сырья, разведенного водой, медицинским панкреатином или нативной поджелудочной железой свиньи в щелочной зоне рН 7,6-7,8 в присутствии хлороформа при 37-38°С в течение 6-7 суток, прогревание при 90°С в течение 5-10 мин, последующее осаждение высокомолекулярных соединений, фильтрование целевого продукта, при этом фермент растворяют в воде в соотношении 1:25 и перед осаждением высокомолекулярных соединений проводят обработку гидролизата 20-22%-ным раствором хлористого кальция. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов включает аминокислотную основу, комплекс витаминов, раствор Хенкса и сыворотку крови крупного рогатого скота, при этом в качестве аминокислотной основы используют ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов, %:

Ферментативный гидролизат обезжиренной мозговой ткани крупного рогатого скота0,15-0,20Комплекс витаминов0,0001-0,00012Сыворотка крови крупного рогатого скота5-10Раствор Хенксаостальное

(см. патент РФ № 2020153, кл. с 12 N 5/00, с 12 Р 21/06).

Недостатком данного способа и питательной среды является высокая стоимость получения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ получения гидролизата, предусматривающий обработку белковосодержащего сырья ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железой в щелочной зоне в присутствии хлороформа с добавлением 20%-ного раствора гидроокиси натрия, отделение от нерастворимых примесей, инактивирование фермента, нейтрализация до рН 7,0-7,2, сушку целевого продукта, при этом в качестве белоксодержащего сырья используют отходы вакцинно-сывороточного и инкубаторного производства в виде глобулинов, или куриных эмбрионов, или сгустков крови, или фибрина, перед ферментативным гидролизом сырье измельчают, смешивают с деминерализованной водой и проводят аммиачный гидролиз 26%-ным водным раствором аммиака в течение 2 ч при 120°С, а ферментативный гидролиз ведут нативной поджелудочной железой крупного рогатого скота до содержания аминного азота 500-700 мг% при следующем соотношении химических соединений, мас.%:

Пептон1-2Хлорид натрия1,0-1,2Аммонийные соли, а также, мг%: общий азот1100-1400аминный азот200-220триптофан80-200

В способе деминерализованную воду смешивают в соотношении 1,5:1,0 для глобулинов, 5:1 для куриных эмбрионов и фибрина, 1,0:1,6 для сгустков крови.

В способе аммиачный гидролизат охлаждают до 45°С, рН доводят до 7 раствором соляной кислоты, а ферментативный гидролиз проводят нативной поджелудочной железой крупного рогатого скота из расчета 200-256 г/л и для глобулинов, и для сгустков крови, 83,3-166,6 г/л для куриных эмбрионов и фибрина при 42-43°С в течение 6-7 суток для глобулинов, 6 суток для куриных эмбрионов и фибрина, 4-5 суток для сгустков крови, при этом конечное накопление в целевом продукте аминного азота составляет не менее 500-700 мг% (см. пат. РФ № 2103345, кл. С 12 N 1/00, опубл. 27.01.98 г.)

Недостатком данного способа является высокая стоимость и сложность получения гидролизата. Задачей предлагаемого способа получения гидролизата является достижение полного гидролиза и снижение себестоимости продукта. Поставленная задача достигается с помощью способа. Способ получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет, предусматривающий обработку белоксодержащего сырья ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железой, измельчение, отделение от растворимых примесей, нейтрализацию до рН 7,0-7,2, автоклавирование при 120°С в течение 1 ч, при этом в качестве белоксодержащего сырья используют продукты пчелиного производства (обрезки, подмор, личинки трутней), при этом сырье измельчают на гомогенизаторе при 3 тыс. об/мин, затем его разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком мощностью 400 Вт, причем экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А и частоте 35 кГц, по окончании ультразвукового облучения суспензию нейтрализуют раствором соляной кислоты или двууглекислым натрием с последующим гидролизом, центрифугирование при 3 тыс. оборотов в течение 5 мин.

Сущность способа получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет

Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор, личинки трутней) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Воздействие ультразвуком производят в стеклянных химических стаканах, которые опускают в водяную баню с плавающим льдом; аппарат включают и опускают экспоненциальный излучатель так, чтобы он касался поверхности жидкости. Экспозиция ультразвукового облучения 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц.

По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступают к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды.

Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. Надосадочную жидкость разливают по флаконам, закупоривают и автоклавируют в течении 1 ч при температуре 120°С.

После приготовления среды проверяют на стерильность в чашках Петри в термостате при 37°С - 1 сутки.

Примеры конкретного выполнения способа получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет

Пример 1. Культивирование спирохет проводят на мясопеченочном бульоне с добавлением ферментов поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды, для ферментативного гидролиза. Затем пробы закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120 С°.

В опыт для культивирования спирохет берутся три курицы. Две заражают штаммом СТС по 0,5 мл внутримышечно, третья служит контролем. Когда у опытных кур развиваются яркие клинические признаки заболевания (апатия, лихорадка, параличи ног и парезы крыльев), а в мазках крови обнаружены спирохеты, тогда в стерильных условиях берется кровь из-под крыльцовой вены. В боксе делают посевы в пробирки с мясопеченочным бульоном, в среду добавляют 0,1 мл инвазированной крови от больных спирохетозом кур. Культивирование проводят в термостате при температуре 37°С в аэробных условиях.

При наблюдении за средой с внесенной кровью больных спирохетозом кур устанавливают. В мясопеченочной среде в стационарных аэробных условиях на 9 день выделяют культуры спирохет в незначительных количествах (до 7 в одном поле зрения), с характерной морфологией и ограниченным ростом.

Пример 2. Приготовление среды осуществляют по вышеописанному примеру 1. В качестве стимулятора роста для спирохет добавляют продукты пчелиного производства: подмор, обрезки, личинки трутней. Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор, личинки трутней) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем полученное сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию подвергают обработке на УЗДН-1. Воздействие ультразвуком производят в стеклянных химических стаканах, которые опускают в водяную баню с плавающим льдом; аппарат включают и опускают экспоненциальный излучатель так, чтобы он касался поверхности жидкости. Экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц. По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты или с помощью гидрооксида натрия, это необходимо для успешного роста спирохет в данной среде. Затем добавляют поджелудочную железу КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Пробы закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120°С. Для подавления микрофлоры добавляют рифампицин (антибиотик) из расчета 30 мг/л среды.

В результате культивирования спирохет на мясопеченочной среде с добавлением стимулирующих веществ получают интенсивный рост и развитие спирохет в стационарных аэробных условиях на 7 день с характерной морфологией и без роста патогенной микрофлоры.

Пример 3. Приготовление среды осуществляют по вышеописанному примеру 2. После добавления в мясопеченочный бульон измельченных продуктов пчелиного производства и фермента поджелудочной железы они находятся во взвешенном состоянии, что затрудняет дальнейшую работу при изготовлении питательной среды, и успешный рост спирохет, т.к. все активные вещества переходят в бульон и плохо используются микроорганизмами. Поэтому для работы мы используем центрифугирование.

Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость разливают по флаконам и закупоривают, затем автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120°С.

Применение центрифугирования и осаждение взвесей в дальнейшем помогает работать быстро и без осложнений.

Пример 4. Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор, личинки трутней) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем полученное сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Воздействие ультразвуком производят в стеклянных химических стаканах, которые опускают в водяную баню с плавающим льдом; аппарат включают и опускают экспоненциальный излучатель так, чтобы он касался поверхности жидкости. Экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц. По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступают к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. Надосадочную жидкость разливают по флаконам, закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120 С°.

После приготовления среды проверяют на стерильность в чашках Петри в термостате при 37°С 1 сутки.

Пример 5. Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 4 тыс. оборотах. Затем полученное сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:10. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Экспозицию ультразвукового облучения увеличиваем до 10 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц.

По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуем рН-метром до рН 7,2-7,5 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступаем к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Нейтрализованный гидролизат центрифугируем на центрифуге WE 6 при 4 тыс. оборотах 5 мин. Пробы закупориваем и автоклавируем в течение 1 ч при температуре 120°С.

Культивирование спирохет проводят по примеру 2. При этом отмечают, что разведение продуктов пчелиного производства мясопеченочным бульоном в соотношении (1:10) и повышение рН до 7,2-7,5, не оказывает никакого влияния на развитие спирохет, а наоборот, оказывает губительное действие на их рост и развитие.

Таким образом, полученный гидролизат из продуктов пчелиного производства является универсальным, обеспечивающим высокий рост и развитие спирохет, обеспечивает предприятиям биологической промышленности значительное повышение производительности труда при небольших затратах на приготовлении гидролизатов.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства и использованию их при изготовлении питательных сред для культивирования спирохет. Способ состоит в том, что гидролизуемый субстрат измельчают на гомогенизаторе 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Экспозиция ультразвукового облучения 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц. По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступают к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. Надосадочную жидкость разливают по флаконам, закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120°С. Способ позволяет достичь полного ферментативного гидролиза, что обеспечивает высокий рост и развитие спирохет.

Способ получения гидролизата из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет, предусматривающий обработку белоксодержащего сырья ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железой, измельчение, отделение от нерастворимых примесей, нейтрализацию до рН 7,0-7,2, автоклавирование при 120°С в течение 1 ч, отличающийся тем, что в качестве белоксодержащего сырья используют продукты пчелиного производства: обрезки, подмор, при этом сырье измельчают на гомогенизаторе при 3 тыс. об/мин, затем его разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком мощностью 400 Вт, причем экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А и частоте 35 кГц, после ферментативного гидролиза проводят центрифугирование при 3 тыс. оборотов в течение 5 мин.