ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/30 C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно - к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования бруцеллезного микроба.

Известна питательная среда - мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является мясная вода - до 1000,0 мл; пептон ферментативный - 10,0 г; натрия хлорид - 5,0 г; кровь - 10,0 г; агар микробиологический - 15,0-20,0 г; рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°С (М.С.Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб.-2008.- С. 64-65.; С. 269).

Недостатком данной среды является недостаточная питательная ценность для бруцелл.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения питательной среды-заменителя «Альбими»-агара для культивирования бруцелл, содержащей, на 1 л: 20,0 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г химически чистого хлористого натрия и 20 г агар-агара, рН 7,3. Указанные ингредиенты растворяют в автоклаве под текучим паром и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой и хорошо отжатый). Затем добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2-7,3. Разливают в необходимую посуду и стерилизуют 40 минут под текучим паром, а потом при 110°С в течение 20 мин. Дрожжевая вода: 1 кг хлебных дрожжей и 1 л дистиллированной воды кипятят до растворения. Затем фильтруют через полотно. Хранить нужно под хлороформом в темноте не более двух недель (Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза. Методические указания МУ 3.1.7. 3402-16. Издание официальное. Минздрав России, Москва. 2017 г. с. 58).

Недостатком питательной среды, полученной данным способом, является медленный рост возбудителя.

Целью изобретения является разработка способа получения питательной среды плотной для культивирования бруцелл, обеспечивающей рост колоний возбудителя через 24 и 48 ч, что имеет существенное значение для диагностики инфекции и производства биопрепаратов.

Достигаемый технический результат заключается в том, что в технологию изготовления питательной среды вводится получение стимулятора С, который является смешанным гидролизатом подвергшихся специальной обработке эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц. В качестве питательной основы и источника азота среда содержит ферментативный сухой пептон, а также включает: натрий хлористый, агар микробиологический и дистиллированную воду.

Сущность изобретения заключается в применении стимулятора С, который в составе питательной среды для культивировании возбудителя бруцеллеза обеспечивает значительное сокращение времени роста колоний бруцелл, образующихся в ранние сроки - через 24 и 48 ч, на пластинках питательной среды, содержащей следующие ингредиенты:

пептон сухой ферментативный 20,0 г; натрий хлористый 5,0 г; агар микробиологический 9,0 г; стимулятор С (смешанный гидролизат эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц) 35,0 мл; дистиллированная вода до 1 л

В качестве исходного сырья для получения стимулятора С используют эмбриональные и внеэмбриональные ткани птиц. После многостадийной предварительной обработки сырья путем сначала кислотного, затем ферментативного гидролиза получают смешанный гидролизат (Rzhepakovsky I.V., Timchenko L.D., Areshidze D.A., Avanesyan S.S., Budkevich E.V., Piskov S.I., Mannino S., Lodygin A.D., Kovalev D.A., Kochergin S.G. Antioxidant activity of chicken embryo tissues powder obtained by different methods of hydrolysis /Journal of Hygienic Engineering and Design (Македония, электронный.). - 2019. - Vol. 27. - pp. 127-133. E-ISSN:1857-8489 http://www.jhed.mk/categories/view/478/457.

Характеристика получаемого гидролизата: стерильная, прозрачная жидкость коричневого цвета, без консервантов; содержание сухого вещества (35,0±3,0) г/л, рН гидролизата 7,0-7,5, реакция с сульфосалициловой кислотой на протеины - отрицательная, общий азот (0,37±0,03) %, аминный азот (0,11±0,02) %, степень гидролиза (30,8±3,0) %.

Схема получения смешанного гидролизата (стимулятора С):

- предварительная обработка эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц в процессе инкубирования 9-10 суточных куриных эмбрионов для стимуляции обменных процессов;

- выдерживание в холодильной камере в течение 7 суток;

- гомогенизация тканей;

- наноструктурирование массы в гомогенизаторе высокого давления;

- замораживание и лиофилизация полученной массы;

- фракционирование полученного белоксодержащего порошка на белки, пептиды, аминокислоты, углеводы, нуклеиновые кислоты, минеральные соединения и т.п.;

- кислотный гидролиз;

- ферментативный гидролиз;

- очистка субстанции;

- автоклавирование.

Натрий хлористый - хч, ГОСТ 4233-77, партия 24. Произведен в г. Барнаул. Дата изготовления 06.2017 г. Срок годности 3 года. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Натрий хлористый необходим для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - ГОСТ 13805-76. Производитель ООО «НПО «Порт-Петровск». Дата изготовления 05.2018 г. Годен до 05.2021 года. Пептон представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся при нагревании (пептоны, пептиды, аминокислоты и т.д.). Пептон ферментативный в своем составе содержит 16 аминокислот, мг %: аспарагиновая кислота 0,40±0,03; треонин 0,30±0,01; серии 0,40±0,03; глутаминовая кислота 0,50±0,03; глицин 0,50±0,01; аланин 1,0±0,02; валин 0,80±0,02; метионин 0,40±0,02; изолейцин 0,70±0,01; лейцин 2,40±0,06; тирозин 0,40±0,01; фенилаланин 1,30±0,01; лизин 1,30±0,05; гистидин 0,20±0,02; аргинин 1,70±0,09; триптофан 0,06±0,01 (Шепелин А.П., Дятлов И.А. Питательные среды для энтеробактерий. Оболенск 2017. С. 43; с. 232).

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Дата изготовления: октябрь 2017 г. Срок годности: до 10.2022 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания 30-37°С, прочность студня не менее 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность при 90°С.

Дистиллированная вода - ГОСТ 6709-72, отвечает всем санитарно-гигиеническим требованиям. Внешний вид - прозрачная жидкость, хлориды, мг/дм нет, нитраты, мг/дм нет. Удельная электропроводимость при 20°С, См/м - 0,38, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например, в реакциях гидролиза.

Получение смешанного гидролизата из эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц (стимулятора С).

Из сублимата эмбриональных и внеэмбриональных тканей 9-10-суточных куриных эмбрионов (Инкубатор для яиц ИЛБ-0,5, Россия и Лиофильная сушилка ЛС-500, Проинтех, Россия) удаляют липиды петролейным эфиром (Роторный испаритель RV 10 Basic V, IKA, Германия) с последующим высушиванием обезжиренного белоксодержащего остатка (Лиофильная сушилка ЛС-500, Проинтех). Берут 500 мл дистиллированной воды (дистиллятор, Liston, Россия) вносят в 20 г белоксодержащего порошка, перемешивают и помещают в шейкер-термостат ES 20/60 (Biosan, Латвия) для выдерживания при 50°С в течение 30 мин и при встряхивании 100 об./мин. Затем к раствору добавляют 35% HC1 до ее концентрации 0,5% и выдерживают при 50°С в течение 60 мин и при встряхивании 100 об./мин в шейкер-термостате ES 20/60 (Biosan, Латвия). Затем полученную массу автоклавируют при 125°С 60 мин в стерилизаторе паровом СПВА-75-1НН (Транс-сигнал, Россия). Охлажденный до 37°С автоклават нейтрализуют 1 М NaOH до рН 7,0-7,5, вносят трипсин 25 мкг/мл, выдерживают при перемешивании 120 мин при 37°С в шейкер-термостате ES 20/60 (Biosan, Латвия) при встряхивании 100 об./мин. Ферментацию останавливают нагревом до 90°С в течение 10 мин на термобане ЛАБ-ТЖ-ТБ-01/26 (Медлаб, Россия). Полученный гидролизат центрифугируют (центрифуга с охлаждением SL40R (Thermo fisher scientific, США) при 4000-5000 g в течение 120 минут при температуре 4°С.Полученную после центрифугирования жидкость последовательно фильтруют с помощью фильтрационной системы Vivaflow 50 (Sartorius, Франция) с применением ПЭС кассет (размеры пор 0,2 мкм, 30 kDa и 10 kDa) и автоклавируют при 120°С 10 мин в стерилизаторе паровом СПВА-75-1НН (Транс-сигнал, Россия).

Приготовление питательной среды плотной

Для приготовления питательной среды плотной на весах взвешивают пептон сухой ферментативный - 20,0 г, натрий хлористый - 5,0 г, агар микробиологический - 9,0 г, мерно набирают смешанный гидролизат эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц (стимулятор С) - 35,0 мл (из расчета по сухому остатку (из расчета содержания сухих веществ 35,2 г/л). Все ингредиенты вносят в эмалированную кастрюлю, туда же вливают дистиллированную воду до 1 л. Затем все нагревают до кипения, кипятят в течение двух минут до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1. Готовый фильтрат светло-желтого цвета разливают в градуированные флаконы объемом 450 мл по 250,0 мл, которые закрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт, герметично закрепляют резиновыми кольцами, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 мин.

Готовую питательную среду плотную остужают до (53±3)°С, разливают в чашки Петри по 35-40 мл. Используют для культивирования бруцелл.

Ростовые свойства полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., используя тест-штаммы Brucella abortus 19 ВА и В. melitensis Rev I. Испытуемые культуры тест-штаммов выращивают на поверхности скошенного агара, рН 7,2±0,1, при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл, смытых с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, готовят взвеси концентрацией 10 единиц по оптическому стандарту мутности бактериальных взвесей ОСО 42-28-85-2018 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, эквивалентную 1,7×10⁹ бруцелл в 1 мл. Полученные микробные взвеси тест-штаммов разводят сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл, затем, серийными десятикратными разведениями, - до 1×10³ м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры В. abortus 19 ВА и В. melitensis Rev I из разведений 10-6 (100 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемой средой и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С.

Учет результатов. Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования бруцелл проводят путем подсчета количества выросших колоний тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis Rev I через 24, 48 и 72 ч. В качестве контроля используют агар Альбими.

Пример 1. Культуры тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis REV I выращивали на питательной среде плотной для культивирования бруцелл, содержащей следующие ингредиенты: пептон сухой ферментативный - 10,0 г, натрий хлористый - 4,0 г, агар микробиологический - 8,0 г, смешанный гидролизат эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц (стимулятор С) - 30,0 мл, дистиллированную воду до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов в испытуемой среде при культивировании на ней тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis REV I из посевов по 100 м.к. колонии начинали формироваться появился видимый рост колоний через 24 часа, а через 48 ч количество колоний со средним диаметром 1,3 мм для обоих штаммов было в среднем 87 и 126, соответственно, тогда как на контрольном агаре Альбими рост при посеве 100 м.к. составил в среднем 71 и 99 колоний, соответственно, со средним диаметром 1,3 мм через 72 ч.

Пример 2. Культуры тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis REV I выращивали на питательной среде плотной для культивирования бруцелл, содержащей следующие ингредиенты: пептон сухой ферментативный - 20,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; агар микробиологический - 9,0 г; смешанный гидролизат эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц (стимулятор С) - 35,0 мл, дистиллированная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов в испытуемой среде при культивировании на ней тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis REV I из посевов по 100 м.к. колонии начинали формироваться через 24 часа, а через 48 ч количество колоний со средним диаметром 1,5 мм для обоих штаммов было в среднем 115 и 157, соответственно, тогда как на контрольном агаре Альбими рост при посеве 100 м.к. составил в среднем 71 и 99 колоний, соответственно, со средним диаметром 1,3 мм через 72 ч.

Пример 3. Культуры тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis REV I выращивали на питательной среде плотной для культивирования бруцелл, содержащей следующие ингредиенты: пептон сухой ферментативный - 30,0 г; натрий хлористый - 6,0 г; агар микробиологический - 10,0 г; смешанный гидролизат эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц (стимулятор С) - 40,0 мл, дистиллированная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов в испытуемой среде при культивировании на ней тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis REV I из посевов по 100 м.к. колонии начинали формироваться через 24 часа, а через 48 ч количество колоний со средним диаметром 1,3 мм для обоих штаммов было в среднем 75 и 116, соответственно, тогда как на контрольном агаре Альбими рост при посеве 100 м.к. составил в среднем 71 и 99 колоний, соответственно, со средним диаметром 1,3 мм через 72 ч.

Таким образом, заявленный способ получения питательной среды плотной для культивирования бруцелл с использованием смешанного гидролизата эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц (стимулятора С) (пример №2) является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет выращивать достаточное количество колоний в максимально ранние сроки - через 24-48 ч.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой плотную питательную среду для культивирования бруцелл, включающую смешивание пептона сухого ферментативного, натрия хлористого, агара микробиологического, смешанного гидролизата эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц - стимулятора С с дистиллированной водой, нагревание до кипения, кипячение до полного расплавления агара, фильтрование, корректирование рН раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1, разливание готового фильтрата во флаконы и герметичное укупоривание, стерилизацию в автоклаве. Использование данной среды позволит выращивать достаточное количество колоний возбудителя бруцеллеза в ранние сроки - через 24-48 ч. 3 пр.

Питательная среда плотная для культивирования бруцелл, включающая смешивание пептона сухого ферментативного, натрия хлористого, агара микробиологического, смешанного гидролизата эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц - стимулятора С с дистиллированной водой, нагревание до кипения, кипячение до полного расплавления агара, фильтрование, корректирование рН раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1, разливание готового фильтрата во флаконы и герметичное укупоривание, стерилизацию в автоклаве при следующем соотношении исходных ингредиентов: