КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ОЖИРЕНИЯ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/16 C07K14/155 

Ожирение - это патологическое нарушение, вызванное избыточным накоплением жира в различных тканях, особенно в жировых тканях брюшной полости. Избыточное потребление пищи с высоким содержанием жира, отсутствие физической нагрузки, генетические, физиологические факторы, фактор окружающей среды - все это причины, вызывающие ожирение.

Ожирение, обусловленное количеством и качеством потребляемой пищи, наследственными и физиологическими факторами и фактором окружающей среды в развитом обществе, представляет собой патологическое нарушение, возникающее в результате накопления жира в тканях, особенно жировых. Ожирение считается прямой или косвенной причиной сахарного диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, малой продолжительности жизни и других болезней. Предотвращение и лечение ожирения является важной проблемой здоровья и здорового образа жизни.

2. Описание уровня техники на дату подачи заявки

Многие исследования показывают, что уменьшение жировой массы вследствие строгой диеты или регулярной физической нагрузки резко снижает описанные выше риски для здоровья. К сожалению, диета и физическая нагрузка часто не помогают. Неудача в значительной мере обусловлена возрастанием аппетита, предпочтением высококалорийной пищи, сниженной физической активностью, а также различными генетическими факторами, связанными с биосинтезом липидов. Особенно трудно поддаются лечению люди с высокими генетическими факторами риска, страдающие ожирением. Поэтому необходимо новое терапевтическое средство для лечения ожирения.

Хотя диета и физическая нагрузка могут препятствовать возникновению ожирения у людей, потенциально к ней предрасположенных, большинство из них в конце концов заболевают ожирением. Таким образом, для предотвращения ожирения и его лечения с помощью сравнительно простого терапевтического метода, мы в настоящем изобретении предложили относительно простые полипептиды, которые в виде белковых лекарств или генных терапевтических средств могут быть использованы для предотвращения или лечения ожирения.

Поликлональные антитела для биохимических и молекулярно-биологических исследований мы обычно готовили, собирая сыворотку при подкожном инъецировании взвеси, состоящей из смеси рекомбинантных антигенов и адъюванта, в гиподерму белого кролика, приблизительно 2-4 раза за 4-6 недель. В одном из таких опытов мы обнаружили, что определенный полипептид (здесь и далее обозначаемый как SynLeptin) вызывает потерю веса кроликов более чем на 20%. Основная причина потери веса была в резком уменьшении жировой массы брюшины или органов брюшины и подкожной жировой массы. Этот полипептид может быть использован как средство, предотвращающее ожирение, или как терапевтическое средство при его лечении.

Настоящее изобретение предоставляет биологический агент, препятствующий ожирению. При обычных методах лечения ожирения применяются гормон анти-ожирения, белок, Лептин, диета и физическая нагрузка. Однако настоящее изобретение представляет новаторское средство против ожирения, с сильной способностью подавлять образование жировой ткани или жира в организме. Более конкретно, настоящее изобретение относится к белку, который резко подавляет образование жировой ткани, будучи инъецированным в гиподерму вместе с протеином, состоящим из 72 или 86 аминокислот, смешанным с адъювантным маслом. Так как парциальные Tat (транс-активирующий белок вируса иммунодефицита человека) полипептидные фрагменты, состоящие из 71 или 86 аминокислот, как показано, обладают активностью, препятствующей ожирению. Tat полипептиды, состоящие из всех 101-ой аминокислот или их части, также будут препятствовать ожирению. Настоящее изобретение базируется на новом открытии того, что Tat протеины подавляют биосинтез жиров в организме. Больные спидом могут худеть благодаря присутствию Tat протеина. Tat полипептиды и их различные производные могут быть использованы как превентивные или терапевтические средства против ожирения в виде протеиновых лекарственных средств или средств генной терапии.

Краткое изложение сущности изобретения

Таким образом, для решения описанной выше проблемы настоящее изобретение должно представить биологическое терапевтическое средство для эффективного предотвращения или лечения ожирения.

Для достижения обозначенной выше цели настоящее изобретение представляет полипептид, показанный в SEQ ID:1, 2 и 3, или его соли, пригодные для фармацевтического использования.

В настоящем изобретении полипептид SEQ ID NO:1 представляет собой Tat протеин, состоящий из 101 аминокислоты, полипептид SEQ ID NO: 2 состоит из 86 аминокислот N-концевых участков Tat, а полипептид SEQ ID NO:3 состоит из 71 аминокислоты N-концевых участков Tat. Тем не менее полипептиды настоящего изобретения, обладающие активностью, препятствующей накоплению жира в различных тканях, содержат вышеупомянутые Tat полипептиды и их мутантные полипептиды разных типов (различные варианты естественных и искусственных мутантов Tat), содержащие Tat как целое или его часть.

Настоящее изобретение также представляет гены, имеющие нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID NO:2 и 3, которые кодируют полипептиды, препятствующие ожирению, и pcDNA3.0 SynLeptin-1 и -2 или pGEX4T SynLeptin-1 и -2 - слитой ген рекомбинантных плазмид.

Полипептид настоящего изобретения может быть использован в виде разнообразных белковых лекарственных средств или агентов генной терапии как превентивное или терапевтическое средство против ожирения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует потерю веса, вызванную введением SynLeptin полипептида, препятствующего ожирению и подавляющего накопление жира в различных тканях кроликов, включая жировую. Сравнение с контрольной группой показывает, что SynLeptin-1 полипептид, подавляя образование жировой ткани, вызывает 20% потерю веса (см. Фиг.3).

Фиг.2 иллюстрирует потерю веса при инъецировании 2 раза каждые 2 недели SynLeptin-1 или -2 полипептида в гиподерму двенадцатинедельных ZFD крыс с нефункциональным лептиновым рецептором. Приблизительно через 30 дней в контрольной группе, обработанной солевым раствором, наблюдали 8.5% возрастание веса; в группе, обработанной SynLeptin-1, было 3.5% возрастание веса; группа же, обработанная SynLeptin-2, напротив, показала 4.3% потерю веса.

Фиг.3 иллюстрирует результаты аутопсии. На Фиг.3А стрелки обозначают распределение жировой ткани в различных органах подопытного кролика, которому три раза каждые две недели в гиподерму был инъецирован SynLeptin-2 полипептид в смеси с адъювантом. На Фиг.3В стрелки обозначают распределение жировой ткани в различных органах после инъецирования в гиподерму солевого раствора в смеси с адъювантом, 3 раза каждые 2 недели. Как показано на Фиг.3, полипептиды настоящего изобретения заметно снижают количество жира в различных тканях организма, включая жировую.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет объяснено на примерах осуществления, описанных в деталях, со ссылками на сопроводительные фигуры, которые даны только в качестве иллюстраций и, таким образом, не ограничивают настоящего изобретения.

Как упоминалось выше, ожирение представляет собой патологическое нарушение, происходящее из-за избыточного накопления жира в различных тканях, в особенности в жировых. Тучность является прямой или косвенной причиной таких болезней как сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, малая продолжительность жизни и другие. Как сообщалось, снижение веса на 5% может заметно улучшить состояние здоровья больных указанными болезнями или даже предотвратить их.

Высшие позвоночные точно регулируют количество жировой ткани с помощью системы гормональной регуляции. С ростом веса тела из-за увеличения количества жировой ткани концентрация в крови лептинового гормона, регулирующего вес тела или количество жировой ткани, увеличивается, и Лептин связывается с рецептором гипоталамуса головного мозга. Серия процессов регуляции, приводящая к снижению веса тела, происходит вследствие гормон-рецепторного взаимодействия. Это взаимодействие промотирует секрецию меланоцит-стимулирующего гормона, а также увеличивает число меланокортин - 4 рецепторов. Эти процессы приводят к уменьшению потребления пищи из-за снижения аппетита, увеличивают потерю энергии и стимуляцию симпатической нервной системы. Напротив, с уменьшением веса тела из-за уменьшения количества жировой ткани количество лептинового гормона в крови уменьшается, и гипоталамус головного мозга воспринимает это состояние. Ряд регуляторных процессов, которые воспринимают низкую концентрацию Лептина, увеличивают вес тела посредством увеличения концентрации нейропептида Y и числа Y-рецепторов. Эти процессы приводят к увеличению потребления пищи из-за роста аппетита, уменьшению расхода энергии, снижению репродуктивной способности и температуры тела и увеличению стимуляции парасимпатической нервной системы. Следовательно, как показано выше, точный механизм обратной связи и регуляции питания регулирует количество жировой ткани и вес тела.

Гены гормонов, играющие существенную роль в регуляции веса тела, содержат Obese (ob), Diabetes (db) и agouti. В частности, (ob) представляет собой 16 kDa (килодальтон обозначает массу полипептида, прим. Перев.) полипептид (называемый Лептином), который синтезируется в жировой ткани и переносится в кровоток. Если имеют место такие мутации, как аномальные экспрессия и функция гена, кодирующего полипептид, или ошибки в числе и функции поверхностного гормонального рецептора клетки, то количество жировой ткани заметно возрастает и растет вес тела.

Предыдущие исследования показали, что ob полипептид (Лептин), инъецированный в кровь, оказывает явное влияние на лечение ожирения у подопытных животных. Клинические испытания его применения для лечения человека находятся в процессе разработки. Эти испытания показывают, что некоторые тучные люди при лечении Лептином теряют до 7.1 килограмм веса, тогда как у других больных при лечении Лептином потери веса не происходит. Дальнейшее исследование показало, что биология ожирения сложна и обусловлена различными генетическими нарушениями, включая ob рецептор, (db) и ob гены.

Опыт на крысах дает возможность предположить, что независимо от веса тела ob полипептид, увеличивая метаболизм глюкозы, может лечить сахарный диабет 2-го типа.

Цель настоящего изобретения - посредством подавления накопления жира в различных тканях эффективно предотвращать или лечить ожирение, являющееся причиной многих трудноизлечимых болезней. Протеин в настоящем изобретении, по всей вероятности, оказывает терапевтическое воздействие на людей, страдающих ожирением и резистентных к Лептину. Лептин осуществляет свою биологическую функцию, связываясь со своим рецептором, но так как SynLeptin-1 и -2 полипептиды, содержат мембранно-проницаемые PTD (домен протеиновой трансдукции), то эти полипептиды могут подавлять образование жировой ткани, несмотря на изменения в числе и функции лептинового рецептора. Действительно, опыт на животных показывает, что ZDF крысы с нефункциональным ob рецептором (db) теряют в весе при обработке SynLeptin полипептидами (фиг.2). В соответствии с этим полипептиды настоящего изобретения, вероятно, имеют терапевтический эффект применительно к людям, страдающим ожирением, и резистентным к Лептину.

Более того, если для достижения значительной потери веса Лептин должен инъецироваться в кровоток ежедневно, то SynLeptin-1 и -2 с PTD доменом может быть очень легко введен в организм. Например, от двух до трех подкожных инъекций композиции этого полипептида и адъювантного масла оказывается достаточно для поддержания состояния худощавости в течение более чем 150 дней.

Хотя люди используют различные пути для предотвращения и лечения ожирения, такие как диета, интенсивная физическая нагрузка и химиотерапия, но с прекращением лечения состояние накопления или генерации жира в разных тканях предотвращают и лечат ожирение.

Пример 1: Получение pGEX4T-3-SynLeptin-1 и -2, экспрессирующих плазмид и производство SynLeptin-1 и -2 полипептидов

PCR (полимеразная цепная реакция) на SynLeptin-1 осуществлялась с использованием смыслового праймера (GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTAAATCCTAGCCTAG) и анти-смыслового праймера (GATCGAATTCCTTTGATAGAGAAACTTGATG).

Условия проведения PCR были следующими. После того, как Tat cDNA денатурировали в течение 5 минут при 94°С, провели 30 циклов реакции амплификации (94°С, 30 сек; 60°С, 30 сек; 72°С, 30 сек) и заключительную реакцию при 72°С в течение 5 мин.

Продукты PCR были отделены от 2.0% геля агарозы, очищены и затем обработаны рестриктазами BamH1 и EcoR1. pGEX4T-3 (Pharmacia Co.) экспрессирующий вектор был обработан теми же рестриктазами (BamH1 и EcoR1) и сшит с фрагментами SynLeptin-1 cDNA/(BamH1-EcoR1) с использованием ДНК-лигазы фага Т4. Лигированная смесь была введена экспрессирующему хозяину Е. coil BL21 (DE3) путем трансформации.

Для получения pGEX4T-3-SynLeptin-2 - экспрессирующей плазмиды, содержащей Tat полипептиды, состоящие из 86 аминокислот, и производства SynLeptin-2 - белка проводили PCR реакцию с использованием смыслового праймера (GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGC), анти-смыслового праймера (GATCGAATTCTTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCT) и Tat cDNA в качестве матрицы. Условия проведения PCR и метод получения pGEX4T-3-SynLeptin-2 были такими же, как условия и метод, описанные выше.

Трансформированная экспрессирующая бактерия-хозяин (Е. coil BL21 DE3) с pGEX-4T-3-SynLeptin-1 или - 2 были высеяны в жидкую культуральную среду TY, содержащую 100 μг/мл получения pGEX4T-3-SynLeptin-2 были такими же, как условия и метод, описанные выше.

Трансформированная экспрессирующая бактерия-хозяин (Е. coil BL21 DE3) с pGEX-4T-3-SynLeptin-1 или -2 были высеяны в жидкую культуральную среду TY, содержащую 100 μг/мл ампициллина, и выращивались на этой среде в течение ночи. Один мл ночной бактериальной культуры добавили к 100 мл жидкой среды TY, содержащей 100 μг/мл ампициллина, и растили в течение полутора часов. Синтез гибридного белка индуцировали 0.2 ммоля IPTG (изопропилтиогалактозид прим. Перев.) при 30°С в течение 10 часов. SynLeptin-1 и -2 белки очищали посредством афинной хроматографии на глютатион-агарозе.

pc-DNA3.0 SynLeptin-1 и -2 экспрессирующий вектор млекопитающих были получены в результате следующего процесса. pc-DNA3.0 (Clontech) плазмида была обработана рестриктазами BamH1 и EcoR1. BamH1-EcoR1 фрагменты SynLeptin c-DNA-1 или -2 генов (около 220 пар оснований), упомянутые выше, и обработанная плазмида были лигированы ДНК лигазой фага 4 и встроены путем трансформации в Е coli DH5α. Рекомбинантные плазмиды были приготовлены методом щелочного лизиса.

Пример 2: Эксперимент на животных по снижению веса тела путем подавления накопления жировой ткани.

4 белых кролика, весом 1.2 кг, были разделены на контрольную и опытную группы, по 2 кролика в каждой. 500-700 мг очищенного SynLeptin-1 или -2 белка или солевого раствора были смешаны с 2 мл адъюванта (производство Sigma) и затем инъецированы в 4 разные участка гиподермы кролика. Через 2 недели было инъецировано равное количество протеин-адъювантной композиции, спустя еще 2 недели была осуществлена третья инъекция. После этого потеря веса измерялась через 10 дней. Был получен следующий результат. Вес тела в опытной группе, обработанный SynLeptin-1, был 1,8 и 2,08 кг соответственно(в среднем 1,94 кг), тогда как вес тела в контрольной группе составлял 2,5 и 2,45 кг соответственно (в среднем 2,48 кг). По сравнению с контрольной группой опытная группа показывает 22%-ную потерю веса тела (фиг.1). Дополнительно, в течение 30 дней мы обрабатывали SynLeptin-1 или -2 полипептидами ZDF крыс, с геном нефункционального лептинового рецептора (фиг.2). Опытная группа, обработанная SynLeptin-1, показала увеличение веса тела на 3.5%. В контрольной группе, напротив, вес тела увеличился на 8.5%. Существенно, что в опытной группе, обработанной SynLeptin-2, наблюдалось 4.3% уменьшение веса тела в сравнении с контрольной группой (фиг.2).

Пример 3: Аутопсия подопытного животного

Причины снижения веса тела мы анализировали при аутопсии и патолого-анатомических исследованиях. В опытной и контрольной группах кролики перед вскрытием обнаруживали нормальную жизнедеятельность и поведение. Когда кролики были забиты и произведено вскрытие, никаких патологических нарушений в органах не наблюдалось. Однако было очевидным заметное уменьшение жировой массы не только в жировых тканях брюшины и подкожных жировых тканях, но и в тканях, окружающих различные органы. Особенно заметно уменьшился размер жировой ткани в области брюшины (фиг.3).

Протеин, представляемый в настоящем изобретении, подавляя образование жировой ткани или жира в различных органах животного, оказывает сильное влияние на предотвращение или лечение ожирения. В результате протеин настоящего изобретения может быть использован в виде белковых лекарственных средств или средств генной терапии как средство против ожирения.

Перечень последовательностей приведен в конце описания.

Изобретение относится к области биохимии и генной инженерии и может быть использовано в медицине. Показана способность полноразмерного трансактивирующего белка вируса иммунодефицита человека (ТАТ-белка), а также двух его N-концевых фрагментов, состоящих соответственно из 86 и 71 аминокислотных остатков, подавлять образование жировой ткани in vivo, в связи с чем предложено использовать названные полипептиды, в том числе и полученные методом рекомбинантных ДНК, в качестве активного начала фармацевтических препаратов. В частности предложена композиция для предотвращения и лечения ожирения, включающая полный ТАТ-белок (SEQ ID №1) или любой из его фрагментов (SEQ ID №2 или SEQ ID №3) и подходящий адъювант. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Композиция для предотвращения или лечения ожирения, включающая полипептид, выбранный из группы, состоящей из (а) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №1, и (б) активного фрагмента полипептида (а), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №2 или SEQ ID №3, и адъювант.2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что полипептид с последовательностью SEQ ID №1, SEQ ID №2 и SEQ ID №3 кодируется соответственно нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4, SEQ ID №5 и SEQ ID №6.