Способ сохранения иммунокомпетентных клеток Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

vj

со ю

СХ) Изобретение относится к медицин в частности к способам консервации иммунокомпетентных клеток. Известен способ сохранения куль туры лимфоцитов, заключаняцийся в том, что лимфоциты периферической крови замораживают и хранят при (-170)°С в течение 3-6 нед. fl. Однако известный способ требует дорогостоящей аппаратуры с программным замораживанием и оттаиванием.. Известен также способ сохранени иммунокомпетентных клеток путем культивирования их в питательной среде McCoy 5а с глутамином и антибиотиками 2. Однако такой способ ведет к нарушению функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток, кро ме того, срок сохранения их ограни чен (до 3 сут.). Целью изобретения является повы шение срока сохранения функциональ ной активности иммунокомпетентных клеток. . Указанная цель достигается тем, что согласно способу сохранения им мунокомпетентных клеток путем куль тивирования их в питательной среде в предварительно охлажденную до питательную среду вводят 10%-рый раствор желатина и культив рование проводят при постепенном понижении температуры с периодичес перемешиванием, а хранение осущест ляют при . Спосрб осуществляют следующим образом.. Гепаринизированную периферическ кровь (25 Е/1 мл гепарина СпоФа ), разведенную в 199 в соотношении 1:3, или гомогенат тка ней органов, например селезенки или трансплантированной почки, наслаивают на стандартный градиент плотности фиколл-верографина (1,077-1,078).Выделение иммунокомпетентных клеток производят при 400 д 30 мин. Выделенные иммуноком петентные клетки трижды отмывают от фиколла и верографина средой 199 при следующем режиме центрифугирования: 100 д на протяжении 10-15 мин. Затем полученные лимфоциты помещают в стеклянные емкости с предварительно охлажденной до 5-15°С питательной средой 199, до полнительно содержащей желербразуЮ щие компоненты (фабричный 10%-ный раствор желатины ,фиксйруклаие при по жении температуры (до ) иммунокрмпетентные клетки во взвешенно-разделенном состоянии и поддерживающие их в жизнеспособном состо нии, а также инактивированную сыворотку 1 группы крови человека. 1%-ный раствор 1-глутамина и 2%-ный раствор 1-аспарагина при следующем соотношении компонентов, мае.г: 0,01-0,8 Среда 199 Инактивированная сыворотка 1 груп0,05-0,5 пы крови человека 10%-ный раствор 0,1-1,0 желатина 10-кратная среда 199 0,01-0,1 , 1%-ный раствор 0,001-0,008 1-глутамина 2%-ный раствор 0,001-0,008 1-аспарагина При этом сохранение иммунокомпетентных клеток в культурешьной среде производят при 0-4с Концентрация клеток доводится до 1-2-10 клеток на 1 мл питательной среды. Емкости с культуральной средой и клетками ставят в бытовой холодильник и время от времени периодически встряхивают до момента перехода культуральной среды из жидкого состояния в желеобразное с последующим визуальным контролем равномерного распределения клеток. Если помещенные в емкости клетки за время застывания культуральной среды и перехода ее в состояние геля успевают преимущественно собраться у дна емкостей, необходимо разогреть содер жимое емкостей при температуре, не превышающей 37С, а затем снова охладить до . Образовавшийся гель с иммунокомпетентными клетками культивируют при . При этом иммунокомпетентные клетки получают из одного забора крови и/или органов. . Пример. Предлагаемый способ сохранения иммунокомпетентных клеток испытан на культурах клеток крови больных, проходящих курс гемодализного лечения по поводу терминальной почечной недостаточности, а также на культурах крови больных раком мочевого пузыря U ст., клиническая группа На , и культурах клеток крови практически здоровых лиц. Кроме того, тестировались иммунокомпетентные клетки, выделенные из селезенок практически эдоровых крыс и из селезенок доноров трупной почки. Выход Клеток после выделения составил во всех случаях 75-90%. Проба на жизнеспособность клеток после вьщеления из периферической гепаринизированной крови выявила высокий выход жизнеспособных клеток. После сохранения иммунокомпетентных клеток по предлагаемому способу на протяжении различных

сроков (i-6 дн) проба.также выявила высокий выхбд |жиэ({еспдсобных клеток (табл.1).

Количественные характеристики «мунокснлпетевтных клеток (Т-и В лймФоцитс1в) определялись в реакции розеткообраэования с эритроцитами барана: Б- и БАС-РОК (табл.2).

Функциональные параметры Т- и В-лимфоцитов изучались в реакциях бласттрансфоЕтации лимфоцитов

.IT а б л и ц а 1 ,

,

Срежевыпеленные- Количество сохранившихся иммунокомпетентных в стандартном гра- клеток, %, на протяжении, дн.

диенте фиколл- «« .

верографина лимфо-Т Т | Т Т

циты, %12 56

75-9090 -90 87 85 83 80

В табл.2 приведены количествен- яммунокомпетентных клеток в процессе ные и качественные характеристики .хранения.

Эритроциты Свежевыделеннне Количество иммунокомпетентных

клетки, % клеток, % при хранении, сут

(РВТЛ) под влиянием митогенщях доз ФГА (Weefcome, Бп.) и ЛИС (вьзделенный из Е.соИ штгшм 0/55) .

Учет реакций производился морфолгивеския} способом.

В табл.1 представлены данные выхода иммунркомпонентных клеток, вьщеленяых в стандартном градиенте плотности фиколл- верографина при различных сроках их хранения.

Таблица2

.....-...-..„....-.

СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК путем культивирования их в питательной среде, о т личающийся тем, что, с целью повышения срока сохранения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, в предварительно охлажденную до питательную среду вводят 10%-ныЙ раствор желатина и культивирование проводят при постепенном понижении температуры с периодическим переме1Ш1ванием, а хранение осуществляют при температуре от О до 4с. СО

Е-РОК Е АС-РОК РБТЛ на ФГА РБТЛ на ЛГК

38,5t5,8 14,2+7,1 31,4111,2 I8,ll7,9

34,5t5,2 815,0 27,5i7,5 11,318,4 Группа практически здоровых лиц() 48,2115,7 4б,3±9,740,513,8 20,1+6,320,5±1,4 14,844,0 52,4+17,057,3+3,6 53i2,0 21,2±4,125,5±2,75 22,5i:4,5 Группа больных, получающих курс гемодиализного лечения по поводу терминальной почечной недостаточности ()

Группа больных раком мочевого пузыря II ст. Па клиническая группа )

20,2±5,8 12,416,1 13,7+8,3 ФГА 19,3t7,l ЛПС Таким образом, способ позволяет повысить срок хранения жизнеспособПродолжение табл. 2

17,518,1 9,,7 7i4vO 14,3+3,5 ; ности клеток в 2 раз а при сохранении 25 высокой функциональной активности.