СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОГО ПРОЦЕССА В СУСТАВАХ У БОЛЬНЫХ ОСТЕОАРТРОЗОМ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/96 

Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии, в частности к лабораторной диагностике аутоиммунных процессов в суставах при остеоартрозе, и может быть использовано для определения показаний либо противопоказаний к внутрисуставному введению хондропротекторов на основе гидролизатов гликозаминогликанов суставного хряща.

Известен способ определения каталитических аутоантител и способ диагностики системных аутоиммунных заболеваний с их использованием: проводят электрофорез выделенных аутоантител, а диагностику осуществляют по количеству распрямленной плазмидной ДНК (Патент 2173464, РФ. Опубл. 10.09.2001).

Известен способ определения антител к гиалуроновой кислоте и ГАГ-полисульфату, который проводили с помощью оригинальной модификации твердофазного иммуноферментного метода (Бабаева А.Р. Клиническое и патогенетическое значение исследования сыворотчных гликозаминогликанов и антител к ним при заболеваниях внесуставных мягких тканей// Автореф. Дисс. Д.м.н. - С.10).

Однако в известном способе в качестве антигена применяют ГАГ-полисульфат, он не предусматривает использование чистого антигена.

Известен способ определения концентрации антител к гликозаминогликанам в сыворотке крови больных остеоартрозом, где в качестве антигена использовался ГАГ-полисульфат, при этом ретроспективно оценивали эффективность лечения хондропротекторами - артепароном и румалоном (Коваленко Е.А. Взаимосвязь уровня антител к гликозаминогликанам хряща у больных остеоартрозом с эффективностью лечения хондропротекторами. Автореферат дисс. к.м.н., Волгоград, 1997, 23 с.).

Однако известный способ не позволяет определять локализацию аутоиммунного процесса, так как антитела известным способом определяют в сыворотке крови.

Известен способ, в котором выявлена связь уровня антител к гликозаминогликанам хряща у больных с остеоартрозом с эффективностью лечения хондропротекторами, с использованием сыворотки крови методом твердофазного иммуноферментного анализа, где в качестве антигена используют гликозаминогликан-полисульфат (Заводовский Б.В. и др. «Связь уровня антител к гликозаминогликанам хряща у больных с остеоартрозом с эффективностью лечения хондропротекторами», Терапевтический архив, 1999, 71, №5, с.47-50).

Однако известный способ не позволяет определять локализацию аутоиммунного процесса, так как антитела известным способом определяют в сыворотке крови.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа диагностики аутоиммунного процесса в суставе и определения показаний к внутрисуставному введению хондропротекторов.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики аутоиммунного процесса в суставах у больных остеоартрозом, включающем иммуноферментный анализ, в качестве антигена используют хондроитинсульфат, иммобилизуют его на плоскодонном иммунологическом планшете, регистрируют результаты с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм (хромоген-тетраметилбензидин), определяют оптическую плотность образцов синовиальной жидкости и сыворотки крови, значения позитивного и негативного контроля, оптической критической плотности, и по интенсивности окрашивания диагностируют наличие искомых антител в пробах.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием и примерами его выполнения.

Способ осуществляют следующим образом:

Для выполнения способа готовят тест-систему, включающую антиген - хондроитин сульфат («Sigma», U.S.A), иммобилизованный на пластиковом иммунологическом плоскодонном планшете, позитивный контроль - сыворотки больных, у которых верифицирован несколькими достоверными методами диагноз аутоиммунного заболевания, негативный контроль - сыворотки, не содержащие антител к гликозаминогликанам, тестированные в промышленных условиях по требуемым стандартам. Система визуализации реакции антиген-антитело - иммуноферментная, то есть содержит античеловеческие антитела, меченые ферментом-пероксидазой (коньюгат), субстратная система предполагает использование ТМБ (тетраметилбензидина).

Под пробой понимают исследуемый материал - сыворотку крови и синовиальную жидкость, - в котором предполагается наличие антител к гликозаминогликанам. Необходимое для анализа количество исследуемого материала составляет 10 мкл.

Подготовленные к исследованию пробы инкубируют в лунках иммунологического планшета в течение 1 часа при 37°С, затем вносят конъюгат, снова инкубируют в том же режиме, визуализируют результат при помощи иммуноферментной реакции и останавливают развитие цветной реакции одновременно с негативным и позитивным контролями. Результаты визуализации документируют на планшетном фотометре. При окраске исследуемой пробы выше значения оптической критической плотности реакция расценивается как положительная, что означает, что данный образец биологического материала содержит антитела к гликозаминогликанам суставного хряща.

Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце антител к ГАГ.

Примеры выполнения способа.

Больной Бодров Ю.С., 65 лет. ист. болезни №20061.

Диагноз: 2-сторонний идиопатический гонартроз II стадии, киста Бейкера, распространенный остеохондроз, коксартроз, полиартроз. Ревмопробы отрицательные.

Способом артроцентеза произвели забор синовиальной жидкости из коленного сустава и из локтевой вены - сыворотки крови. Провели твердофазный иммуноферментный анализ. В качестве антигена использовали хондроитинсульфат, который иммобилизовали на плоскодонном иммунологическом планшете. Затем регистрировали результаты с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм (хромоген-тетраметилбензидин). Определили оптическую плотность образцов синовиальной жидкости и сыворотки крови, значения позитивного и негативного контроля. Вычислили величину оптической критической плотности: ОПкрит.=0,084+0,2=0,284.

В синовиальной жидкости получили величину оптической плотности:

ОП=(0,996+0,960)/2=0,978 - результат определения титра антител в синовиальной жидкости - положительный.

В сыворотке крови получили величину оптической плотности:

ОП=(0,560+0,247)/2=0,403 - результат определения титра антител в сыворотке крови - положительный.

По получению позитивного результата определения титра антител к гликозаминогликанам был диагносцирован аутоиммунный процесс.

Больная Масленникова В.А., 54 г. амбулаторная карта больного №...

Диагноз: 2-сторонний идиопатический гонартроз II стадии. Киста Бейкера. Ревмопробы отрицательные.

Способом артроцентеза произвели забор синовиальной жидкости из коленного сустава и из локтевой вены - сыворотки крови. Провели твердофазный иммуноферментный анализ. В качестве антигена использовали хондроитинсульфат, который иммобилизовали на плоскодонном иммунологическом планшете. Затем регистрировали результаты с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм (хромоген-тетраметилбензидин). Определили оптическую плотность образцов синовиальной жидкости и сыворотки крови, значения позитивного и негативного контроля. Вычислили величину оптической критической плотности: ОПкрит.=0,084-0,2=0,284.

В синовиальной жидкости получили величину оптической плотности:

ОП=(0,402-0,205)/2=0,304 - результат определения титра антител в синовиальной жидкости - положительный.

В сыворотке крови получили величину оптической плотности:

ОП=(0,211-0,093)/2=0,152 - результат определения титра антител в сыворотке крови - отрицательный.

По получению позитивного результата определения титра антител к гликозаминогликанам в синовиальной жидкости был диагносцирован локальный аутоиммунный процесс.

Прелагаемый способ используется в клинико-лабораторном отделе ФГУН РНЦ "ВТО" им Г.А.Илизарова. Он может быть использован в специализированных учреждениях соответствующего профиля.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для выявления аутоиммунного процесса в суставах у больных остеоартрозом. Сущность изобретения состоит в том, что исследование проводят в образце синовиальной жидкости, в качестве антигена используют хондроитинсульфат, определяют значение оптической критической плотности и оптической плотности образца при 450 нм и при значении оптической плотности образца выше оптической критической плотности диагностируют аутоиммунный процесс в суставах у больных остеоартрозом. Техническим результатом является выявление аутоиммунного процесса в суставах для определения показаний или противопоказаний к внутрисуставному введению хондропротекторов на основе гидролизатов гликозаминогликанов суставного хряща.

Способ диагностики аутоиммунного процесса в суставах у больных остеоартрозом, включающий иммуноферментный анализ, отличающийся тем, что исследование проводят в образце синовиальной жидкости, в качестве антигена используют хондроитинсульфат, определяют значение оптической критической плотности и оптической плотности образца при 450 нм и при значении оптической плотности образца выше оптической критической плотности диагностируют аутоиммунный процесс в суставах у больных остеоартрозом