СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ IN VITRO ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС, ОБУСЛОВЛЕННЫХ АНТИФОСФОЛИПИДНЫМ СИНДРОМОМ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/571 

С 90-х годов XX столетия в России отмечен резкий рост заболеваемости сифилисом, при этом в структуре заболеваемости значительный удельный вес составляют скрытые формы - от 23 до 37% [Васильев Т.В. 1979; Борисенко К.К. и соавт., 1989; Ильин И.И. 1997; Прохоренков В.И. 2000].

В диагностике скрытого сифилиса часто отмечаются затруднения. В частности, постановка диагноза на основании результатов серологических исследований крови при отсутствии клинических симптомов болезни, отрицательных данных конфронтации и анамнеза. В этих случаях необходимо дифференцировать скрытый сифилис с ложноположительными реакциями (ЛПР) на сифилис.

Наиболее частой причиной ЛПР являются заболевания с иммунным механизмом развития [Zajac W. Puclio К., 1981]. ЛПР являются серологическим маркером антифосфолипидного сицндрома (АФС) - аутоиммунной васкулопатии, связанной с тромботическим окклюзионным поражением сосудов. [Harris E.N. и соавт., 1983; Hughes G.R.V. и соавт., 1986].

Ложноположительные реакции на сифилис обусловлены антикардиолипиновыми антителами (аКЛ), которые синтезируются как при антифосфолипидном синдроме, так и при сифилисе. Однако антиген, который используется в серологических реакциях, применяемых для диагностики сифилиса, состоит из кардиолипина, фосфотидилхолина и холестерина в объемных соотношениях 1:10:30. Полагают, что аКЛ, присутствующие в сыворотках больных сифилисом, распознают кардиолипинный антигенный эпитоп, находящийся в специфической ламеларной конфигурации, которая обоеспчивается фосфотидилхолином. В сыворотках больных АФС могут обнаруживаться антитела к такому антигену, но, как правило, в низком титре, в то время при использовании "чиcтoгo" кардиолипина выявляется очень высокий уровень антител. В свою очередь сыворотки больных сифилисом, имеющие высокий титр антител, часто не реагируют с "чистым" кардиолипином, иммобилизованным на твердой фазе [Bernard С. Biological true and false serological tests for syphilis: their relationship with anticardiolipin antibodies. - Dermatologica - 1990; 180(3): 151-3; Koike Т. Specificity of mouse hybridoma antibodies to DNA. II. Phospholipid reactivity and biological false positive serological test for syphilis. - Clin Exp Immunol - 1984 Aug; 57(2): 345-50; Koike Т. Anti-phospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol -1984 Apr; 56(1): 193-9; Shoenfeld Y. Circulating anticoagulant and serological tests for syphilis. - Acta Derm Venereol - 1980; 60(4): 365-7].

Дальнейшие исследования показали, что антикардиалипиновые антитела, иммобилизованные на твердой фазе, обнаруживаются как в сыворотках пациентов с АФС, так и больных сифилисом [Guerin J - Glin Exp Immunol -1997Aug; 109(2): 304-9; Guerin J - Autoimmunity - 1999 Oct; 31(2):109-16].

Для связывания антител, присутствующих в сыворотках больных аутоиммунными, но не инфекционными заболеваниями, с кардиолипином необходимо наличие плазменного компонента (кофактора), который был идентифицирован как β₂-гликопротеин-1 (β₂-ГП-1) [McNeil H.P. и соавт., 1990, Galli М. и соавт., 1990].

При более детальном исследовании этого феномена, J.E. Hunt и соавт. (1992) показали, что аКЛ у больных малярией, инфекционным мононуклеозом, туберкулезом, гепатитом, сифилисом не требовали присутствия β₂-ГП-1, в отличие от пациентов с аутоиммунным заболеванием.

Таким образом, определение антител к β₂-ГП-1 у пациентов с сифилисом и ЛГР на сифилис позволяет дифференцировать антитела, образующиеся при инфекционных и аутоиммунных заболеваниях.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть использовано для дифференциальной диагностики серологической позитивности при скрытом сифилисе и ложноположительных реакциях на сифилис; обусловленных антифосфолипидным синдромом.

Целью изобретения является повышение точности дифференциальной диагностики in vitro серологической позитивности при раннем скрытом сифилисе и ложноположительных реакциях на сифилис, обусловленных антифосфолипидным синдромом. Цель достигается тем, что в сыворотке пациента методом иммуноферментного анализа определяют антитела класса IgM и IgG к β₂-гликопротеину l. Уровень антител изотипа IgM и IgG к β₂-гликопротеину l более 10 Ед/мл свидетельствует об аутоиммунных механизмах гиперпродукции антифосфолипидных антител и, следовательно, о ложноположительных реакциях на сифилис.

Способ осуществляется следующим образом. Используют иммуноферментный набор для количественного определения антител классов IgM и IgG к β₂-гликопротеину I (производства ORGenTec Diagnostika).

Калибраторы, контроли и предварительно разбавленные пробы сыворотки пациентов вносят в микроячейки. После 30-минутной инкубации ячейки промывают. Раствор коньюгата античеловеческого IgM и античеловеческого IgG с пероксидазой хрена добавляют в ячейки. После 15-минутной инкубации избыток ферментного конъюгата удаляют промывочным раствором. Раствор хромогенного субстрата, содержащий ТМБ, добавляют в ячейки. В течение 15-минутной инкубации цвет раствора становится голубым. Развитие окраски останавливают добавлением 1 М соляной кислоты в качестве стоп-раствора. Раствор меняет цвет на желтый. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации IgM и IgG в образце. Оценку результатов производят путем непосредственного сравнения оптической плотности опытной и контрольной проб на фотометре. Считают оптическую плотность при 450 нм.

Пример 1. Пациент В, 20 лет, история болезни 1879, поступил в УрНИИДВиИ 04.09.01 с диагнозом: обследование на сифилис. Впервые положительные серологические реакции на сифилис выявлены 30.03.01 в ОКБ 1, куда был направлен с диагнозом: неспецифический аорто-артериит с поражением брюшного и грудного отделов аорты (?). Мигрень с аурой. Объективно: кожные покровы, половые органы, слизистые оболочки, перианальная область свободны от специфических высыпаний. Серологические реакции: РВ_к отр. , РВ_т отр., МР 4+, РПГА отр., РИФ_абс - 2+; РИБТ 43% (слабоположительная). Половая жизнь с 19 лет, вне брака. Данные обследования полового партнера - клинико-серологически здорова. Другие половые контакты категорически отрицает. Обследованы бытовые контакты (отец, мать) - клинико-серологически здоровы.

При повторном исследовании серологические реакции: РВ_к отр., РВ_т отр., МР 4+, РПГА отр., РИФ_абс - отр., РИБТ - отр. Из анамнеза жизни - с 13 лет беспокоит головная боль с "мурашками" перед глазами. После бега появляется частичное выпадение полей зрения с последующим появлением сильной головной боли, рвоты.

Был обследован предлагаемым способом - антитела к IgG-β₂-ГПl - 48,3 Ед/мл, антитела к IgM-β₂-ГП-1 - 44,5 Ед/мл. Повышенный уровень антител к β₂-ГП-1 свидетельствует об аутоимунных механизмах образования антител и, следовательно, о ложноположительных реакциях на сифилис. Направлен для дообследования к ревматологу, выставлен диагноз: вероятный АФС.

Пример 2. Пациентка П, 16 лет, история болезни 1393, поступила в УрНИВДВиИ 16.06.00 с диагнозом: обследование на сифилис. Половой жизнью не жила. Специфических, характерных для сифилитической инфекции высыпаний на коже и слизистых оболочках выявлено не было. Серологические реакции: PВ_к 4+, 1/5, РВ_т 4+, МР 4+, 1/2, РПГА отр., РИФ_aбс - отр; РИБТ 18% (отрицательная). Для исключения syphilis congenital tarda была обследована мать - клинико-серологически здорова.

Была обследована предлагаемым способом - антитела к IgG-β₂-ГП - 12,6 ЕД/мл, антитела к IgM-β₂-ГП-1 - 46,8 Ед/мл. Повышенный уровень антител к β₂-ГП-1 свидетельствует об аутоимунных механизмах образования антител и, следовательно, о ложноположительных реакциях на сифилис. Направлена для дообследования к ревматологу. Выставлен диагноз: вероятный АФС. Обследование у эндокринолога (УЗИ, пункционная биопсия щитовидной железы, исследование гормонального фона) позволило верифицировать аутоиммунный тиреоидит, гипотиреоз.

Таким образом, предлагаемый способ является дополнительным критерием при дифференциации проблемных сывороток и сифилиса, обеспечивает сокращение сроков обследования и диспансерного наблюдения, улучшает качество жизни пациентов, способствует выявлению скрытых иммунологических расстройств.

Изобретение относится к медицине, а именно к венерологии, и может быть использовано для диагностики in vitro ложноположительных реакций на сифилис, обусловленных антифосфолипидным синдромом. Способ характеризуется тем, что в сыворотке пациента методом иммуноферментного анализа определяют антитела изотипа IgM и IgG к β₂ -гликопротеину I, уровень более 10 Ед/мл свидетельствует об аутоиммунных механизмах гиперпродукции антифосфолипидных антител и, следовательно, о ложноположительных реакциях на сифилис. Способ является дополнительным критерием при дифференциации проблемных сывороток и сифилиса, и его использование обеспечивает сокращение сроков обследования и диспансерного наблюдения, улучшает качество жизни пациентов, способствует выявлению скрытых иммунологических расстройств.

Способ диагностики in vitro ложноположительных реакций на сифилис, обусловленных антифосфолипидным синдромом, путем исследования сыворотки пациента, отличающийся тем, что методом иммуноферментного анализа определяют антитела изотипа IgM и IgG к β₂-гликопротеину I, при уровне антител изотипа IgM и IgG к β₂-гликопротеину I более 10 Ед/мл диагностируют аутоиммунную гиперпродукцию антифосфолипидных антител и, следовательно, ложноположительные реакции на сифилис.