Изобретение относится к технологии приготовления эталонных сывороток для контроля качества тест-систем и может быть использовано в медицине, биотехнологии и иммунологии.
Известно, что для оценки диагностических тест-систем, предназначенных для определения антител, главным инструментом служат панели стандартных сывороток, содержащих и не содержащих специфические антитела.
Основной проблемой при создании панели эталонных сывороток, особенно содержащих специфические антитела, служит выбор конкретных репрезентативных образцов. Следует подчеркнуть, что сыворотки, содержащие специфические антитела, существенно отличаются по своим характеристикам в зависимости от стадии развития инфекционного заболевания. Так, в частности, в начальной стадии ВИЧ-инфекции происходит первичное накопление вируса в клетках-мишенях, при этом антитела к вирусным белкам отсутствуют и возможна постановка диагноза только с использованием методов определения вирусного антигена или вирусных нуклеиновых кислот. В дальнейшем при формировании иммунного ответа на образованный антиген происходит появление антител к вирусным белкам. Когда уровень антител превышает уровень синтеза вирусных белков и свободный антиген перестает выявляться, в сыворотке тестируется наличие антител только к определенным вирусным белкам. При финальных стадиях заболевания, когда иммунная система человека уже не отвечает в достаточной степени выработке защитных антител, наблюдается обратный процесс, т.е. вирус размножается, но уровень антител недостаточен для связывания всех вирусных белков: в этой ситуации также определяется свободный вирусный антиген и низкий титр специфических антител.
Задача создания панелей эталонных сывороток является актуальной для диагностики вируса иммунодефицита человека, вирусных гепатитов и определения других антител.
Вследствие большого разнообразия возбудителей вирусных гепатитов дифференциальная диагностика различных нозологических форм, прогноз исхода инфекции, эффективная профилактика и лечение, решение многих научных, эпидемиологических и экологических задач представляют собой сложную проблему. Только выявление специфических вирусных маркеров (в том числе антител) с применением современных иммунологических диагностикумов позволяет успешно преодолевать имеющиеся трудности.
Крайне желательным является включение в панель сывороток с различными параметрами, включая сыворотки с низкой концентрацией антител к отдельным вирусным белкам, которые характеризуют в первую очередь начальные инфекции. Подбор таких сывороток является достаточно сложной задачей, поскольку это предусматривает выявление и наблюдение за широким кругом контактных лиц (для начальной стадии инфекции) и получение достаточных количеств материала для исследования и дальнейшего использования в качестве стандартных образцов.
Важной характеристикой используемых сывороток служит содержание антител к индивидуальным белкам ВИЧ. По требованиям ВОЗ сыворотка считается положительной, если в ней содержатся антитела к одному из белков оболочки ВИЧ - gp160/120 или gp41 (ген env) и антитела к одному из белков гена gag (p55, p24, p17). Как правило, наиболее сложными для выявления антител в диагностических тестах являются сыворотки, которые характеризуются невысоким уровнем антител к белкам гена gag и содержат в основном антитела к оболочечнным белкам. Именно такие сыворотки характерны для ранних стадий инфекций, наиболее важных при диагностике [1].
Всемирной организацией Здравоохранения (ВОЗ) рекомендуется использование панели положительных на ВИЧ сывороток (40-50 образцов) и отрицательных, предварительно охарактеризованных методом иммунного блотинга и в различных иммуноферментных тест-системах [2,3].
Известно, что в Российской Федерации для аттестации коммерческих тест-систем используются национальные диагностические панели сывороток, состоящие из 50 положительных и 40 отрицательных сывороток (ОСО 42-28-145-88) [4]. Способ получения таких панелей включает подбор сывороток, содержащих специфические антитела ко всем основным белкам тестируемого антигена ВИЧ-1 и имеющих разную концентрацию этих антител.
Недостатками данного способа получения панели сывороток [4] является низкая чувствительность изготовляемых положительных панелей сывороток, т.к. они составлены из нативных сывороток, имеющих в основном высокие титры (1-2 сыворотки из 50 с низким содержанием антител). Такая панель нативных специфических сывороток не позволяет проконтролировать истинный показатель чувствительности тест-систем, т. к. высоким титрам нативных сывороток соответствуют очень высокие значения оптических плотностей (ОП) в иммуноферментном анализе (ИФА). Панель оказывается малоэффективной в области значений ОП, близких к критическим значениям (ОПкрит) при дискриминации ложноположительных сывороток, имеющих значения ОП, близкие или совпадающие с ОПкрит.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения эталонных сывороток для контроля качества тест-систем, предназначенных для определения антител, включающий приготовление иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител, причем наибольшее количество сывороток приготавливают с концентрациями антител, близкими к их минимальной концентрации в иммунных сыворотках, служащей границей между положительными и отрицательными исследуемыми сыворотками, а наименьшее количество сывороток - с концентрациями антител, близкими к концентрациям их в нативных иммунных сыворотках [5] . Причем разную концентрацию специфических антител в сыворотках получают путем разведения нативных иммунных сывороток отрицательной сывороткой, не содержащей антитела к тестируемому антигену. Использование разведенных положительных сывороток позволяет получить образцы этих сывороток с заданной низкой концентрацией антител к тестируемому антигену, что характеризуется низкой оптической плотностью в иммуноферментных тест-системах.
Однако данный способ имеет следующие недостатки. Спектр антител разведенных положительных сывороток характеризуется, как правило, сохранением антител к тем же белкам, что и в исходной нативной позитивной сыворотке, но в меньшей концентрации. В то же время важно иметь сыворотки не только с низкой концентрацией антител, но и сыворотки с антителами преимущественно к тем же белкам, которые преобладают на разных стадиях вирусной инфекции. Например, спектр антител разведенных ВИЧ-положительных сывороток характеризуется преобладанием антител к белкам гена gag и с небольшим количеством антител к наиболее ценным при постановке диагноза ВИЧ-инфекция - белкам гена env. Таким образом, полученные предлагаемым способом эталонные положительные сыворотки методом разведения исходных нативных сывороток имеют недостаточную чувствительность, изначально ограничены уже имеющимся соотношением антител к различным белкам вируса и при разведении антитела, исходно присутствующего в небольшой концентрации, могут не выявляться в иммуноблоте.
Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа, который позволил бы приготавливать более высокочувствительные панели эталонных положительных сывороток, имеющих разную концентрацию и представительство антител к вирусным белкам и пригодных для использования в качестве стандартных образцов при изготовлении и аттестации коммерческих диагностических тест-систем.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения эталонных положительных сывороток для контроля качества тест-систем, предназначенных для определения антител, включающем приготовление иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител, причем наибольшее количество сывороток приготавливают с концентрациями антител, близкими к их минимальной концентрации в иммунных сыворотках, служащей границей между положительными и отрицательными исследуемыми сыворотками, а наименьшее количество сывороток - с концентрациями антител, близкими к концентрациям их в нативных иммунных сыворотках, согласно изобретению представительство и разную концентрацию специфических антител в иммунных сыворотках получают путем истощения иммунных сывороток инкубацией с соответствующими антигенами, отличающимися по наличию и их концентрации в реакционной смеси в течение времени и условиях инкубации, достаточных для связывания антител с антигенами. Иммунные сыворотки инкубируют с таким представительством вирусных антигенов, которые обеспечивают минимально необходимый спектр антител в иммунных сыворотках, достаточный для признания их серопозитивными.
Предложенный способ конструирования эталонных сывороток методом истощения иммунных сывороток инкубацией с вирусными антигенами имеет большие возможности для создания разнообразных сывороток с заранее заданными параметрами, так как вариации определяются представительством вирусных белков в используемых антигенах, а также наличием и концентрацией антител в иммунных сыворотках. Этот подход, базирующийся на реакции антиген-антитело, является общим для различных вирусных и бактериальных антигенов, где степень соответствия между антигенной детерминантой и антигенсвязывающей областью активного центра антитела (иммунологическая специфичность) определяется химической и пространственной комплементарностью, а специфичность взаимодействия характеризуется аффинностью антител.
В предлагаемом способе приготовления эталонных положительных сывороток моделируются процессы, происходящие в организме инфицированного человека, где представительство антител к различным белкам вируса регулируется двумя основными факторами: 1) уровнем накопления индивидуальных вирусных белков и 2) гуморальным иммунным ответом, т.е. уровнем образования антител к индивидуальным белкам (эпитопам этих белков вируса). В реальной ситуации определяемый иммуноферментными тест-системами титр антител определяется соотношением между уровнем накопления вирусных антигенов и антител к этим антигенам и представляет собой некую суммарную характеристику.
Способ иллюстрируется следующими графическими материалами.
На фиг. 1 приведен иммуноблот, на котором представлен спектр белков некоторых исследованных антигенов, где:
1 - лизат Т;
2 - лизат инактивированного очищенного вируса;
3 - концентрат культуральной жидкости;
4 - лизат 11;
На фиг. 2 изображена электрофореграмма положительной сыворотки А-7 после истощения вирусными препаратами, где:
1 - исходная сыворотка А-7
2 - сыворотка (1:8) + АГ N6;
3 - сыворотка (1:8) + лизат 11;
4 - сыворотка (1:4) + лизат очищенного вируса;
5 - сыворотка (1:4) + лизат М;
6 - сыворотка (1:8) + лизат М;
7 - сыворотка (1:3) + лизат RF;
8 - сыворотка (1:16) + лизат RF.
Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения.
Пример 1. Способ получения эталонных положительных сывороток для контроля качества тест-систем на ВИЧ-1.
Для осуществления способа ВИЧ-положительную сыворотку в различных разведениях смешивают с охарактеризованными в иммуноблоте антигенами ВИЧ-1.
В работе используют штамм ЭКВ, выделенный от больного лимфоаденопатией, поддерживаемый в хронически инфицированных этим штаммом клетках линии U-937 (линия клеток ГКВ 4005), депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского, депонент N 4005.
Кроме того, используют штамм HIV-1/RF, поддерживаемый в виде хронически инфицированной этим штаммом линии клеток Н-9, полученный из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН России.
При получении эталонных сывороток исследуют различные вирусные антигены: препараты культуральной жидкости, концентрированные ультрафильтрацией через мембранные фильтры "Milipore", образцы вируса, очищенного центрифугированием в градиенте сахарозы, и в препаратах вирусных белков, солюбилизированных из мембран инфицированных клеток (лизаты). Спектр белков в некоторых из исследованных антигенов представлен на иммуноблоте (на фиг. 1).
Положительные на антитела к ВИЧ сыворотки человека получают от инфицированных лиц. Исследование сывороток проводят методом непрямого ИФА в тест-системе производства НПО "Вектор" с последующим подтверждением в тест-системе иммуноблот собственного производства.
Сыворотки, не содержащие антител к ВИЧ, получают от здоровых лиц и проверяют аналогичным образом.
Для истощения выбирают три сыворотки: плазма, А-7. Cu, положительные в ИФА и иммуноблоте. Истощение проводят 10-кратным концентратом культуральной жидкости ЭВК/ИРА-3, носящим название АГ N 6, и препаратом вирусных белков, солюбилизированных из мембран инфицированных клеток - лизат N 11 (Л.11).
При выборе вирусных антигенов для истощения руководствуются принципом наименьшего содержания оболочечных белков gp 160/120 и gp 41, как, например, в лизате 11 на фиг. 1.
Пример истощения положительной сыворотки А-7 различными вирусными препаратами представлен на фиг. 2.
Из серии предварительных экспериментов выбирают подходящие разведения исходных сывороток:
для плазмы 1:8 и 1:16;
для А-7 1:32 и 1:64;
для Cu 1:16 и 1:32.
В качестве разводящего раствора используют отрицательную сыворотку. Истощение проводят инкубацией с вирусными препаратами в соотношении 1:1 в течение 60 мин при 37oC с последующим определением в тест-системе "Антиген", "РекомбиБест-АнтиВИЧ-1,2" (Вектор-Бест) и иммуноблоте собственного производства.
После смешивания сывороток с антигенами в указанных соотношениях получен набор "истощенных" сывороток, которые являются ВИЧ-положительными по данным иммуноблота, но существенно отличаются по данным иммуноферментного анализа (табл. 1). В результате удалось получить набор сывороток, содержащих антитела преимущественно к оболочечным белкам ВИЧ и характеризующихся низкими значениями оптической плотности при исследовании их в иммуноферментных тест-системах.
Пример 2. Исследование срока хранения эталонных сывороток, полученных предлагаемым способом.
При изучении срока годности полученных сывороток было выявлено, что они стабильны при хранении при -10oC в течение не менее 3-х месяцев. Использование предложенных эталонных сывороток позволяет эффективно оценить качество коммерческих тест-систем для определения антител. Как видно из таблицы 1, в тест-системе "Антиген" все полученные сыворотки выявляются как положительные, а в тест-системе "РекомбиБест-антиВИЧ-1,2" оптическая плотность существенно ниже и сыворотка N 10 не выявляется, т.к. имеет пограничное значение оптической плотности. Данные по сроку хранения сывороток представлены в таблице 2, из которой видно, что в тест-системе "Антиген" все сыворотки тестируются как положительные, в то время как тест-система РекомбиБест-антиВИЧ 1, 2 не выявляет 7 из 12 полученных сывороток. При проверке этих сывороток в тест-системе "Рекомбинант ВИЧ-1,2 ДС/М" производства г. Бердск не выявляется только сыворотка N 10. Проведенные исследования наглядно показывают применимость полученных сывороток для контроля качества тест-систем.
Пример 3. Способ получения эталонных положительных сывороток для контроля качества тест-систем на гепатит А.
В случае инфекционного гепатита А маркером для ранней дифференциальной диагностики являются антитела IgM. Сыворотку, содержащую антитела IgM к вирусу гепатита А в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80, инкубировали с антигеном вируса гепатита А, полученным культивированием вируса в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки. Инкубацию проводили в течение 60 минут при 37oC при соотношении препаратов 1:1 с последующим определением в тест-системе ВЕКТОГЕП-А-IgM (произв-во ГНЦ ВБ "Вектор")
Как видно из таблицы 3, при соответствующем подборе соотношений препаратов можно получить сыворотки, имеющие значения оптической плотности, близкие к критическому значению.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет по сравнению с известными аналогами приготавливать более высокочувствительные наборы эталонных положительных сывороток, имеющих разную концентрацию и представительство антител к вирусным белкам и пригодных для использования в качестве стандартных образцов при изготовлении и аттестации коммерческих диагностических тест-систем.
Источники патентной и научно-технической информации:
1. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А. СПИД, Москва, 1992, с. 141.
2. Carrett A.J., Saegroatt V., Suprun E.N. et al.,(1988) Wld. Hlth. Org. Rep., v.66, p. 44-50.
3. Report of the WHO Meeting on Criteria for Evaluation and Standartization of Diagnostic Tests for the Detection of HIV Antibody, Stockholm, 1987.
4. Воробьева М.С., Шаламберидзе Т.Л., Федорова Г.М. и др. Вопр. Вирусол. - 1990, N2,-с.125-127.
5. Канев А.И., Гутова Е.А., Ломанова Г.А. и др. Вопр. вирусол.-1993, N 2,- с. 86-89, (прототип).
Изобретение может быть использовано в медицине, биотехнологии и иммунологии. Способ включает приготовление иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител. Наибольшее количество сывороток приготавливают с концентрациями антител, близкими к их минимальной концентрации в иммунных сыворотках, служащей границей между положительными и отрицательными исследуемыми сыворотками, а наименьшее количество сывороток - с концентрациями антител, близкими к концентрациям их в нативных иммунных сыворотках. Спектр и разную концентрацию специфических антител в иммунных сыворотках получают путем истощения иммунных сывороток инкубацией с соответствующими антигенами, отличающимися по наличию и их концентрации в реакционной смеси, в течение времени и условиях инкубации, достаточных для связывания антител с антигенами. Сыворотки инкубируют с таким представительством вирусных антигенов, которые обеспечивают минимально необходимый спектр антител в иммунных сыворотках, достаточный для признания их серопозитивными. Способ позволяет приготавливать более высокочувствительные наборы эталонных положительных сывороток, имеющих разную концентрацию и представительство антител к вирусным белкам и пригодных для использования в качестве стандартных образцов при изготовлении и аттестации коммерческих диагностических тест-систем. 1 з.п.ф-лы, 3 табл., 2 ил.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИСЫВОРОТКИ | 1992 |
|
RU2019190C1 |
| Канев А.И., Гутова Е.А | |||
| и др | |||
| Вопросы вирусологии, 1993, N 2, с | |||
| Пюпитр для работы на пишущих машинах | 1922 |
|
SU86A1 |
