СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ ТЕРАПИИ У ДЕТЕЙ ПРИ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/49 

Данное изобретение относится к области медицины и клинической лабораторной диагностики и позволяет оценить состояние процессов свободно-радикального окисления (СРО) в иммунокомпетентных клетках крови (ИКК) для дифференцированного применения антиоксидантной терапии.

Одной из центральных проблем при инфекционных заболеваниях остается роль биологических мембран иммунокомпетентных клеток в формировании иммунного ответа, исследование механизмов активации лимфоцитов. Известно, что реализация лимфоцитами функций иммунной защиты находится в прямой зависимости от структурного и функционального состояния биологических мембран, в том числе от интенсивности процессов СРО. Активные формы кислорода (АФК) в нормально функционирующем организме участвуют в метаболизме структурных компонентов клеточных мембран (белков, липидов, углеводов) и соответственно регулируют не только скорость их метаболизма, но и функциональное состояние самой мембраны клетки. Течение и исход вирусных и бактериальных инфекций в значительной мере связаны с состоянием лимфоцитарной системы, определяющей цепь последовательно развивающихся иммунных процессов; а также с состоянием основных метаболических систем в органах и тканях. В связи с углубленным изучением механизмов биохимических нарушений появилась возможность выделения ряда показателей для характеристики данных процессов и возникла необходимость их терапевтической коррекции с использованием антиоксидантной терапии (АО). Однако существует большой разрыв между научными достижениями в изучении процессов СРО на биологических объектах и их практическим использованием с целью определения показаний к приему тех или иных антиоксидантов и контроля за их эффективностью.

До недавнего времени интенсивность СРО плазмы крови оценивали путем измерения величины хемилюминесценции (ХЛ) с перекисью водорода (Журавлев А.И. с соавт., 1975). Использованный вариант исследования ХЛ плазмы крови позволял охарактеризовать способность к образованию АФК. Однако состояние процессов СРО по уровню ХЛ плазмы крови характеризует метаболические процессы в организме в целом, не позволяя оценить иммунные процессы, что особенно важно при инфекционных заболеваниях. Широкий спектр антиоксидантов в арсенале современного врача и отсутствие критериев их назначения диктовали необходимость определения показаний для проведения АО терапии. Данная методика не позволяла определить адресное назначение АО терапии для конкретного больного, а следовательно, была не информативной для решения данной задачи.

Поэтому возникла необходимость создания способа определения показаний для проведения антиоксидантной (АО) терапии при инфекционной патологии у детей путем оценки состояния процессов СРО в ИКК, а именно в лимфоцитах.

Наиболее приближенным способом к заявленному является способ: «Определение интенсивности СРО в лимфоцитах по уровню диеновых конъюгатов (ДК) путем спектрофотометрического исследования», описанный в статье Иванова В.В., Говорова Л.В., Тихомирова О.В. Варианты биохимического ответа лимфоцитов на инфекционный процесс //Мед. Акад.журн. 2003. Т.3. №4. С.47-58; и в пособии для врачей В.В.Иванова, Л.В.Говорова, О.В.Тихомирова, и др. Оценка интенсивности свободно-радикального окисления в клетках и плазме крови для дифференцированного подхода к назначению антиоксидантной терапии. - Пособие для врачей. - СПб: НИИДИС - 2002. - 31 с.).

В лимфоцитах больных определяли концентрацию 3-х показателей: ДК, диенкетонов, общих ненасыщенных липидов (спектрофотометрически). Причем каждый из перечисленных показателей исследовался в липидном экстракте после длительного подготовительного этапа: фильтрации и очистки от нелипидных примесей, упаривания. По уровню ДК были выделены группы больных с различной интенсивностью СРО в лимфоцитах: низкие и высокие, для которых терапия антиоксидантами должна была быть дифференцированной. Концентрация диеновых конъюгатов в лимфоцитах могла быть ниже N-2m, 2) равна норме, 3) выше N+2m, и 4) значительно выше нормы (>4N). Сравнение частоты встречаемости этих вариантов изменений характеристик ПОЛ выявило их наличие при всех видах изучавшихся острых инфекций (табл.1).

Таблица 1.
ВАРИАНТЫ ИЗМЕНЕНИЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ СРО ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.Группы, к-во больныхКонцентрация ДКДК<N-2mДК=NДК>N+2mДК≫4Nздоровые (30)7%86%7%0ОРВИ (180)30%3%62%5%грипп А (25)38%10%38%14%грипп В (23)50%10%40%0Парагрипп (18)15%054%31%RS-инфекция (17)17%33%50%0Аденовир (24)70%20%10%0ЦМВ (28)10%15%75%0Герпес (36)75%025%0ОРВИ+бак.осл. (200)48%2%38%10%пневм.пневм. (140)43%4%34%9%гемоф.пневм. (35)34%6%56%19%стафилл.пнев. (24)42%2%49%9%Инф.мононуклеоз (70)50%050% Менингококк. мен-т. (48)40%047%13%Герпетич.энц. (35)29%050%21%Энтеровирусн. мен-т (27)44%047%9%Гемофильн. менингиты (16)30%050%20%Дизентерия (35)71%5%13%11%Дифтерия (59)44%054%2%

Однако для определения интенсивности СРО в лимфоцитах по уровню ДК применяется довольно сложная и трудоемкая биохимическая методика, занимающая около 1,5-2 суток, а следовательно, использование полученных данных не представляется возможным для широкого практического применения в связи с несвоевременностью рекомендаций по назначению АО терапии в острый период заболевания. К тому же для осуществления данной методики необходимо использование органических растворителей (метиловый спирт, хлороформ, гексан, гептан), которые оказывают токсический эффект на здоровье исследователя.

Для ликвидации указанных недостатков предложен способ выявления показаний для проведения АО терапии у детей при инфекционной патологии путем оценки интенсивности СРО в лимфоцитах, отличающийся тем, что в реакции ХЛ используют раствор Хенкса в комплексе с люминолом и гидроперекисью, инициируют СРО, измеряют интенсивность ХЛ на флюорате-02М АБЛФ в лимфоцитах и выявляют у инфекционных больных в остром периоде: низкий уровень суммарной ХЛ (менее 60 имп.×10^-3/ мин.), при котором прямая антиоксидантная терапия противопоказана, высокий уровень суммарной ХЛ (от 100 до 300 имп.×10^-3/мин), при котором показана витамино-антиоксидантная терапия и сверхвысокий уровень суммарной ХЛ (более 300 имп.×10^-3 / мин), при котором назначается направленная АО терапия.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении информативности и ускорении метода для осуществления способа определения показаний для АО терапии.

Предлагаемый унифицированный способ обеспечивает дифференцированнное назначение АО терапии инфекционным больным за счет максимального упрощения и резкого сокращения времени исследования с использованием реакции ХЛ.

Авторы впервые предложили использовать экспресс-метод ХЛ для оценки процессов СРО в ИКК-лимфоцитах. Однако некоторое затруднение было связано с инициацией СРО именно в лимфоцитах. Впервые нами было предложено для инициации СРО в лимфоцитах использовать в комплексе с люминолом и гидроперекисью - среду Хенкса, что позволило дать оценку процессов СРО в лимфоцитах. Полученные результаты на основании определения уровня СРО на ранних этапах инфекционного процесса, позволили впервые выделить детей, которым АО терапия противопоказана.

Способ осуществляется следующим образом.

Лимфоциты выделяют из 3 мл гепаринизированной крови по методу Mendes et а1.(1974) на градиенте фиколл-верографин (1,076 г/см) с последующей четырехкратной промывкой 0,85 % NaCl. Чистоту выделенной фракции лимфоцитов и их целостность контролируют с помощью светооптической микроскопии и подсчитывают в камере Горяева количество клеток в суспензии. Из 3 мл крови выделяют 1,5-4,0×10* лф в 1 мл суспензии. Приготовленную суспензию лимфоцитов используют для исследования ХЛ.

Интенсивность процессов СРО в крови оценивают по уровню ХЛ лимфоцитов в присутствии люминола, раствора Хенкса и гидроперекиси при инициации процессов СРО добавлением гидроперекиси. В работе используют хемилюминометр флюорат -02М АБЛФ производства ф. Люмэкс, С-Петербург.

Состав инкубационной пробы при проведении ХЛ: 0,1 мл люминола (1 мг в 3 мл димексида, разведенного физиологическим раствором 1:3); среда Хенкса [(D-Глюкоза (1,000 г); калий фосфорнокислый однозамещенный (0,060 г); калий хлористый (0,400 г); кальций хлористый безводный (0,140 г); магний сернокислый безводный (0,098 г); магний хлористый 6-водный (0,100 г); натрий углекислый кислый (0,350 г); натрий фосфорнокислый двузамещенный, безводный (0,048 г); натрий хлористый (8,000 г); вода дистиллированная (до 1 л)]; 0,1 мл взвеси лимфоцитов (0,5-1,0×10⁶ клеток в 1 мл) - реакцию запускают добавлением гидроперекиси 0,2 мл (1/500 разведение). Измерение времени развития максимальной ХЛ 60 сек. Все исследование занимает около 2,5 часов от момента взятия крови.

Выявлены 3 варианта развития реакций адаптации в иммунокомпетентных клетках (ИКК) крови в ответ на инфекционный стресс.

Таблица 2.
Характеристики СРО в лимфоцитах больных с острыми инфекционными заболеваниями в остром периодеГруппы больныхХарактеристики СРО имп × 10 /минХЛ макс (n )светосумма за 1 минХЛ макс (n)светосумма за 1 минХЛ макс (n)светосумма за 1 минНизкий уровень ХЛ лфВысокий уровень ХЛлфСверхвысокий уровень ХЛ лфПодозр.на мен-т, энц.0,33+0,05 *(17)32,7+6,4*0,92+0,08*(6)156+18,63,22+0,95(5)408+59,5*Клещевые энцефалиты0,55+0,08 (13)52,8+7,81,0+0,11(6)125+153,9+0,42*(4)855+118*Демиэлиниз остр.,хрон.0,57+0,12 (10)52,5+10,80,88+0,09(3)92,8+17,63,1+0,32(5)675+68,5Серозные вир.мен-ты0,40+0,06 (20)33,4+6,5*0,8+0,2(6)100+152,07+0,2(2)369+27*Инф.-аллерг. заб.ПНС0,33+0,04 (18)27,7+4,4*1,52+0,21(14)220+25*3,6+0,3(3)650+45*Гемофильн. менингит0,53+0,08(8)72+261,28+0,13*(13)293,8+31,5*4,00+0,05*(4)517+35,8*Дизентерия0,61+0,09 (10)115,5+26,40,99+0,27(16)177,9+55,21,73+0,3(4)350,9+74,0Н/о ОРЗ+ВПГ0,4+0,09(4)35,2+10,5*0,79+0,11(9)137+21  Н/о ОРЗ+ ЦМВ0,32+0,03 (2)41,8+3,3*1,13+0,32(3)252+60,4*  Н/о ОРЗ+ВЭБ0,57+0,28 (4)25,6+10,3*0,86+0,22(2)152+40  Бр.-лег.осл. ОРЗ+ВПГ0,33+0,09 (4)33,5+7,3*0,65+0,09(6)128+14*  Бр.-лег.осл. ОРЗ+ЦМВ0,38+0,05 (11)22,5+1,5*0,69+0,06(+6)134+20*  Бр.-лег.осл. ОРЗ +ВЭБ0,49+0,07 (3)25,2+4,7*  2,42+0,71(2)609+165*здоровые0,6±0,1(10)60±10 р < 0,05 при сравнении с нормой

Первый уровень: низкий - угнетение процессов СРО в лимфоцитах (снижение уровня суммарной ХЛ ниже 60 имп.×10^-3 / мин), отсутствие бактерицидной защиты в достаточном объеме. У этих больных часто наблюдается развитие осложнений, наслоение вторичных бактериальных инфекций, хронизация процесса - АО терапия противопоказана.

Второй уровень: высокий - активация СРО в лимфоцитах в физиологически допустимых пределах (рост уровня ХЛ в 2-3 раза 100-300 имп.×10^-3/мин), обеспечение бактерицидного эффекта «дыхательного взрыва» в остром периоде заболевания, достаточно быстрый выход из болезни без хронизации и развития осложнений - возможно применение витаминов-антиоксидантов. Третий уровень: сверхвысокий - гиперактивация процессов СРО в лимфоцитах (рост уровня ХЛ в 8-10 раз более 300 имп.×10^-3 /мин), что свидетельствует о развитии патологических нарушений СРО, сопровождается значительными повреждениями мембранных структур, развитием суперинфекции, тяжелыми воспалительными осложнениями, интоксикацией, неблагоприятным прогнозом течения инфекционного процесса - показано применение АО терапии.

В таблице 2 приведены примеры разных уровней ХЛ у больных с острой инфекционной патологией. Полученные результаты различного метаболического ответа организма ребенка на инфекционный процесс обусловливали различия терапевтического подхода к лечению детей с высокой и низкой интенсивностью ПОЛ в лимфоцитах. Поскольку терапию витаминами-антиоксидантами осуществляли у больных ОРВИ и сверхвысокий уровень ХЛ встречался у незначительного количества больных, в группу с высоким уровнем СРО были объединены все больные с интенсивностью суммарной ХЛ более 100 имп.×10^-3 /мин ( в том числе и больные с интенсивностью ХЛ более 300 имп.×10^-3 /мин).

Были использованы в качестве дополнительных методов коррелирующей терапии витамины про- и антиоксидантного действия ( вит. С и Е).

Соответственно в комплекс терапии детей с низкой интенсивностью СРО в лимфоцитах включался витамин С, тогда как при лечении детей с высокой интенсивностью СРО применяли витамин Е.

Проведенные исследования характеристик СРО в лимфоцитах больных ОРВИ детей после целенаправленного применения про- и антиоксидантов показали достоверный коррелирующий эффект использованных витаминов на интенсивность СРО. Выявлена достоверная активация процессов СРО в лимфоцитах на фоне применения per os терапевтических доз витамина С (табл.3).

Прием витамина С приводил к достоверному росту, а прием витамина Е сопровождался достоверным снижением уровней суммарной ХЛ в лимфоцитах больных в периоде реконвалесценции, более выраженных, чем в группах сравнения. Наряду с влиянием корригирующей терапии на показатели СРО в лимфоцитах отмечены достоверные различия по длительности проявления характеристик катарального синдрома: кашель, насморк, одышка, хрипы (табл.4).

Таблица 3.
Динамика показателей СРО в лимфоцитах (лф) у детей, больных ОРВИ, при использовании терапии витаминами С и Е.Суммарная ХЛ(n)^-3 имп.х 10^-3/минИсследование до терапииТерапия с витамином СТерапия с витамином ЕГруппа сравненияХЛлф<6042,9±13,7 (34)98,6±16,3^2,3 (9) 50,5±19,8² (14)ХЛ лф>100368,9±45,7 (38) 143,5±25,6^2,3 (11)286,5±37,2^1,2 (16)Норм. уровень ХЛ лф (60-99)75,5±10,6 (10)   1 - р < 0,05 при сравнении с нормой (практически здоровые дети);
2- р< 0,05 при сравнении с исходным исследованием (до назначения терапии);
3 - р>0,05 при сопоставлении с группой сравнения.

У больных с низкой интенсивностью процессов СРО в лимфоцитах длительность проявления исследуемых характеристик катарального синдрома была больше, чем у больных с высоким уровнем ХЛ. При применении витамина С в комплексе корригирующей терапии для больных с низким уровнем ХЛ в лимфоцитах длительность проявления катаральных симптомов сокращалась по сравнению с аналогичной группой больных, которые лечились стандартной симптоматической терапией.

Применение в качестве антиоксиданта витамина Е в комплексе обычной симптоматической терапии для больных с высоким уровнем СРО в лимфоцитах оказало достоверный оптимизирующий эффект на уровень СРО в лимфоцитах, предотвращая, таким образом, развитие некротических изменений в лимфоцитах. Однако не оказало положительного эффекта на длительность проявлений катаральных симптомов (имело место незначительное увеличение длительности этих симптомов относительно группы сравнения, которую составили дети, не получавшие АО терапию).

Таким образом, было показано, что АО терапию следует применять только у больных с активацией процессов СРО выше физиологически допустимых границ, т. е. более чем в 2-3 раза превышающей нормальные показатели уровня ХЛ в лимфоцитах (превышение интенсивности ХЛ в 8-10 раз относительно уровня здоровых детей).

Таблица 4
Длительность клинических симптомов у детей с осложненными формами ОРВИ при использовании терапии витаминами С и Е.Симптомы (дни)Высокий уровень СРОНизкий уровень СРОГр. сравнения n=14После вит.Е n=18Гр. сравнения n=16После вит.С n=11Дл-ть темпер.2,6±0,23,3±0,42,9±0,23,2±0,4Кашель5,5+0,36,4±0,66,4±0,4*5,1±0,6*Насморк4,2±0,34,8±0,54,5±0,33,9±0,5*Одышка0,9±0,21,5±0,41,1±0,20,8±0,3*Хрипы3,9±0,54,4±0,73,8±0,43,4±0,5*• - р < 0,05 при сравнении эффекта терапии, включавшей вит.С и обычной патогенетической терапии в группе сравнения.

Применение витамина С в комплексе симптоматической терапии при ОРВИ оказывало заметный прооксидантный эффект на характеристики СРО лимфоцитах, однако наблюдавшийся рост уровня суммарной ХЛ оставался в физиологически допустимых пределах и обеспечивал бактерицидный эффект без патологических изменений; способствовал снижению длительности проявлений катаральных симптомов.

В качестве конкретных примеров можно привести данные обследования нескольких больных.

Пример 1. Крапивкин Толя. 1 г. ОРВИ, пневмония.

1 исследование (при поступлении) - 51,6 имп.×10^-3 / мин - низкий уровень суммарной ХЛ - угнетение процессов СРО в лимфоцитах. Антиоксидантная терапия абсолютно противопоказана. В остром периоде заболевания в комплекс терапии включен прооксидант-витамин С.

2 исследование (в период реконвалесценции) - 78,5 имп.×10^-3 / мин - нормализация интегнсивности СРО.

Пример 2. Гаврилов Влад 1 мес. 20 дн. ОРВИ, бронхит.

1 исследование (при поступлении) - 295,3 имп.×10^-3/ мин - высокий уровень сумм. ХЛ - активация СРО в лимфоцитах. Показано использование антиоксиданта-витамина Е.

2 исследование (в период реконвалесценции) - 119,0 имп.×10^-3/ мин - тенденция к нормализации интенсивности СРО.

Пример 3. Сущев Игорь. 3 мес ОРВИ

1 исследование (при поступлении) - 77,6 имп.×10^-3/мин - уровень СРО в пределах нормы. Базисная терапия без АО коррекции.

2 исследование (в период реконвалесценции) - 78,1 имп.×10^-3/ мин - нормальный уровень сохраняется, организм справляется без дополнительной коррекции процессов СРО.

Из всего вышесказанного видна значимость определения показаний ХЛ для проведения антиоксидантной терапии у детей при инфекционной патологии, что позволяет направленно оптимизировать уровень СРО в лимфоцитах.

Наряду с собственно витаминами-антиоксидантами для терапии ОРВИ применяли препарат виферон (в состав которого помимо рекомбинантного человеческого ИФН-α2β входят мембраностабилизирующие антиоксиданты - витамин Е и витамин С в терапевтически эффективных дозах - см. табл.5), что обеспечивало не только оптимизацию характеристик СРО в лимфоцитах, но и за счет заместительной α-интерферонотерапии обеспечивало положительный терапевтический эффект в остром периоде ОРВИ.

Таблица 5.
Особенности влияние циклоферона и виферона на процессы СРО в плазме и клетках крови больных геппетическими инъекциями и ОРВИ.Показатели СРОnВариант терапииБазисная терапияnБазис + Виферон1 исслед.2 исслед.1 исслед.2 исслед.Низкийуровень СРОХЛ макс имп.×10^-3260,37±0,050,47±0,09170,39±0,040,50±0,10Светосумма имп.×10^-335,7±5,1455,8±22,333,1±4,463,4±12,3*Высокий уровень СРОХЛ макс имп.×10^-3241,07±0,090,74±0,1261,36±0,090,70±0,10*Светосумма имп.×10^-3216,9±25,1181,4±27,5298±39,5134,1±26,4*- р < 0,05 при сравнении 1 и 2 исследований

Применение иммунокорректора - виферона выявило достоверный модулирующий эффект этого препарата на интенсивность процессов СРО в лимфоцитах (табл.5). Отмечена достоверная нормализация интенсивности процессов СРО как у больных с низким уровнем ХЛ лф, так и у больных с высоким уровнем ХЛ лф. У больных, получавших в острый период ОРВИ виферон, выявлен достаточно быстрый лечебный эффект - на 3-4 день лечения.

Предлагаемый авторами экспресс-метод определения уровня ХЛ в лимфоцитах позволяет своевременно, в острый период заболевания, оценить интенсивность процессов СРО и определить противопоказания к назначению АО терапии у конкретного больного. Кроме того, нашим методом возможно осуществление контроля за эффективностью назначенной АО терапии.

От прототипа предлагаемый метод отличается значительно большей простотой и скоростью выполнения, что обуславливает его экономическую эффективность. Он может быть применен в лабораториях при любой инфекционной патологии у детей в качестве основного метода для назначения и оценки эффективности антиоксидантной терапии. Предлагаемый способ определения показаний для проведения антиоксидантной терапии у детей при инфекционной патологии обладает новизной и может быть использован в клинической практике.

Изобретение относится к области медицины и клинической лабораторной диагностики. Сущность способа заключается в том, что определение показаний для проведения антиоксидантной терапии (АО) у детей при инфекционной патологии осуществляют путем оценки интенсивности свободно-радикального окисления (СРО) в лимфоцитах. В реакции хемилюминесценции (ХЛ) используют раствор Хенкса в комплексе с люминолом и гидроперекисью, инициируют СРО, измеряют интенсивность ХЛ в лимфоцитах. При низком уровне суммарной ХЛ - менее 60 имп.×10^-3/мин - прямая АО терапия противопоказана, при высоком - от 100 до 300 имп.×10^-3/мин - показано применение витаминов-антиоксидантов и при сверхвысоком уровне суммарной ХЛ - более 300 имп.×10^-3/мин - назначается направленная АО терапия. Использование способа позволяет повысить информативность определения показаний для проведения АО терапии у детей с инфекционной патологией и обеспечивает возможность дифференцированного назначения АО терапии. 5 табл.

Способ определения показаний для проведения антиоксидантной терапии у детей при инфекционной патологии путем оценки интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) в лимфоцитах, отличающийся тем, что в реакции хемилюминесценции (ХЛ) используют раствор Хенкса в комплексе с люминолом и гидроперекисью, инициируют СРО, измеряют интенсивность ХЛ в лимфоцитах и выявление у инфекционных больных низкого уровня суммарной ХЛ - менее 60 имп · 10^-3/мин - считают противопоказанием для прямой антиоксидантной (АО) терапии, выявление высокого уровня ХЛ - от 100 до 300 имп · 10^-3/мин - считают показанием для применения витаминов-антиоксидантов, а при выявлении сверхвысокого уровня суммарной ХЛ - более 300 имп · 10^-3/мин - назначают направленную АО терапию.