СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОЧИЩЕННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ МЕНИНГОКОККОВ СЕРОГРУПП А И С Российский патент 2006 года по МПК A61K39/95 

Изобретение относится к медицине и микробиологии и может быть использовано при создании вакцин для профилактики менингококковой инфекции.

Инфекционное заболевание человека, вызываемое бактерией Neisseria meningitidis, характеризуется высокой смертностью и серьезными осложнениями. Для вакцинации против менингита, вызываемого микроорганизмом N. meningitidis серогрупп А и С успешно применяются препараты, приготовленные на основе капсульного полисахарида.

Способы получения капсульных полисахаридов серогрупп А и С описаны. Так, в патенте US 3636192, Gotschlich, 18.01.1972 описан способ приготовления и очистки специфических полисахаридов серогрупп А и С. Полисахариды обладают высокой молекулярной массой в пределах от 60 до 5000 кДА. Способ предусматривает выращивание культуры менигококков, выделение полисахарида, очистку посредством спирта и ацетона, высушивание полисахаридов.

Известны также методы получения высокомолекулярных менингококковых полисахаридов серогруппы С, получаемых с помощью модифицированного метода Gotschlich (US4123520, Hagopian, 31.10.1978; US 4235994, Stoudt, 25.11.1980), на заключительном этапе фракционирования с конечной концентрацией 30-45 об.% этанола обеспечивается получение менингококкового полисахарида, в котором более 80% веса, как указывается, имеет молекулярную массу более 1000000. Для осаждения микробной массы во всех способах используется гексадецилтриметил аммоний бромид (hexadecyltrimethyl ammonium bromide).

В изобретении (WO 2005000345, Ryall R., 06.01.2005) описан способ выделения очищенных полисахаридов менингококков серогрупп А и С, в котором для удаления примесей нуклеиновых кислот производится обработка РНК-азой и ДНК-азой, а примесь белка удаляется добавлением этанола. Однако набор приемов, используемых для очистки полисахаридов, существенно сложнее предложенного ранее Gotschlich. В указанном изобретении ставится другая задача - деполимеризации капсульных полисахаридов для получения их низкомолекулярных производных для последующего конъюгирования с белком для получения белково-полисахаридных вакцин для профилактики менингита младших возрастов.

Наиболее близким по совокупности признаков является способ получения очищенных полисахаридов менингококков серогрупп А и С по упомянутому патенту US 3636192. Он состоит из двух основных стадий: стадии получения полупродукта полисахаридов в виде сухой фракции и стадии очистки полупродукта. Первая стадия заключается в выращивании микробной массы, осаждении ее путем добавления 10% раствора гексадецилтриметиламмония бромида (Cetavlon) до конечной концентрации 0,1% в микробной взвеси с образованием полисахаридного комплекса, который отделяют центрифугированием. Этот комплекс далее экстрагируют кальция хлоридом, экстракт отделяют центрифугированием, очищают спиртом, выпавший осадок отделяют на центрифуге с охлаждением, повторно очищают спиртом и ацетоном с получением сухого полупродукта. На второй стадии проводят очистку полисахаридов. Полупродукт полисахаридов смешивают с раствором натрия ацетата с последующей выдержкой, обрабатывают смесью фенола с насыщенным раствором натрия ацетата. Далее проводят разделение продуктов центрифугированием, диализируют отобранный верхний (надосадочный) слой против раствора кальция хлорида, осаждают спиртом, подвергают центрифугированию с получением в осадке очищенного полисахарида. Финальной стадией является высушивание полисахарида.

Однако практика показывает, что нередки случаи, когда при полном соблюдении технологии, тем не менее, молекулярные параметры полисахаридов оказываются ниже регламентированных. В таком случае полисахариды бракуются как непригодные для приготовления вакцин. Требуется произвести переосаждение продукта, то есть повторить ряд операций, что, соответственно, снижает производительность процесса. В процессе экспериментов установлено, что нестабильность молекулярных параметров, отчасти, может быть обусловлена наличием в составе выделяемых полисахаридов низкомолекулярных компонентов, от которых возможно освободиться с помощью ультрафильтрации.

Технический результат изобретения - повышение содержания высокомолекулярной фракции полисахаридов без снижения производительности процесса при приготовлении очищенных полисахаридов из сухих полупродуктов, полученных по методу Gotschlich.

Технический результат достигается тем, что способ получения очищенных полисахаридов менингококков серогрупп А и С из сухих полупродуктов, полученных по методу Gotschlich, состоит в растворении сухого полупродукта полисахарида в растворе натрия ацетата с последующей экспозицией, обработке смесью фенола с насыщенным раствором натрия ацетата, центрифугировании, диализе отобранного верхнего слоя против раствора кальция хлорида, осаждении спиртом, центрифугировании с получением в осадке очищенного полисахарида и его высушивании.

Дополнительно продукт диализа отобранного верхнего слоя подвергают ультрафильтрации на мембранах для освобождения от низкомолекулярных примесей с молекулярной массой менее 100 кДА для полисахарида серогруппы А и с молекулярной массой менее 300 кДА - для полисахарида серогруппы С.

Способ может характеризоваться тем, что при растворении сухого полупродукта полисахарида используют раствор натрия ацетата концентрацией 0,3 моль/л из расчета 0,2 л раствора на 1,0 г полупродукта полисахарида, при этом смесь экспонируют 10-12 часов при температуре 4-5°С.

Способ может характеризоваться и тем, что полученный раствор полисахарида обрабатывают равным объемом фенола, насыщенного натрия ацетатом, смесь перемешивают, центрифугируют, а верхний слой, содержащий полисахарид, отбирают, при этом указанную обработку повторяют по меньшей мере четырехкратно.

Способ может характеризоваться также тем, что диализ отобранного полисахарида против раствора кальция хлорида концентрацией 0,1 моль/л проводят в течение 20-30 ч до полного удаления фенола.

Способ может характеризоваться также и тем, что осаждение концентрата полисахарида серогруппы А, собранного ультрафильтрацией на мембране, проводят с добавлением 2 об.% насыщенного раствора натрия ацетата при рН 7.0 и 4 объемов 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С.

Способ может характеризоваться, кроме того, и тем, что собранный ультрафильтрацией на мембране концентрат полисахарида серогруппы С подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g в течение 2,5-3 ч, надосадочный слой отсасывают и осаждают растворенный полисахарид 4 объемами 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С.

Пример реализации. Микробную массу выращивают в бутылях, содержащих модифицированную среду Франца. Бутыли инкубируют при температуре 37±1°С при постоянном встряхивании в 12-16 час. Содержимое бутылей объединяют и добавляют 10% раствора гексадецилтриметиламмония бромида (Cetavlon) до конечной его концентрации во взвеси 0,1%, взвесь тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Затем надосадок декантируют, а осадок центрифугируют, отмывают дистиллированной водой, взвешивают. Далее осадок гомогенизируют и добавляют к нему экстрагирующий раствор кальция хлорида (0,9 моль/л из расчета 0,5 л раствора на 100 г комплекса). Экстракцию проводят при Т=4-5°С при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием, полученный экстракт сливают, а осадок вновь экстрагируют в указанных выше условиях, после чего оба экстракта объединяют и добавляют 96%-ный этанол до конечной концентрации 25%. После экспозиции в течение ночи осадок отделяют центрифугированием на холоду.

Полученную надосадочную жидкость отфильтровывают через батистовый фильтр и к фильтрату добавляют охлажденный до 2-4°С 96%-ный этанол до конечной концентрации 80%. Выпавший осадок собирают центрифугированием, промывают три раза спиртом, два раза ацетоном и высушивают до постоянной массы над прокаленным кальцием хлоридом до получения окончательной доли влаги не более 15 %. Полученный таким способом сухой полупродукт - полуочищенный полисахарид хранится при температуре минус 20°С не более 2,5 лет. Наращивание микробной массы обоих серогрупп может осуществляться в ферментерах (см, например, SU 1159948, а также упомянутые патенты US 4123520, US 4235994).

Для заключительной очистки полуочищенные полисахариды серогруппы А или серогруппы С растворяют в растворе натрия ацетата концентрацией 0,3 моль/л из расчета 0,2 л раствора на 1,0 г полуочищенного полисахарида. Смесь выдерживают 10-12 часов при температуре 4-5°С. К полученному раствору добавляют равный объем фенола, насыщенного натрия ацетатом. Встряхивают, центрифугируют, верхний слой отсасывают и еще 4 раза обрабатывают фенолом, повторяя указанную процедуру, а осадок удаляют.

Очищенные фенолом растворы полисахаридов диализируют в течение 20-30 ч против раствора кальция хлорида концентрацией 0,1 моль/л до полного удаления фенола. Продукт диализа полисахарида освобождают от низкомолекулярных примесей с молекулярной массой менее 100 кДА для полисахарида серогруппы А и 300 кДА - для полисахарида серогруппы С путем ультрафильтрации на мембранах. Используются мембраны фирмы Amicon марки ХМ-100 и ХМ-300, соответственно.

К собранному на мембране концентрату полисахарида серогруппы А добавляют 2% (по объему) насыщенного раствора натрия ацетата (рН 7,0) и 4 объема охлажденного 96%-ного этанола.

Собранный на мембране концентрат полисахарида серогруппы С подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g в течение 3 ч, осадок отбрасывают, надосадочный слой отсасывают, а затем к нему добавляют 4 объема 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С.

Полученные спиртовые смеси оставляют на 16-18 ч при температуре 4-5°С для формирования осадка. Осадки собирают центрифугированием, промывают двукратно спиртом и ацетоном, сводя одногрупповые осадки в один стакан. На заключительной стадии осадки полисахаридов высушивают 2-4 суток в холодильнике при 4-5°С, а затем досушивают в эксикаторе над прокаленным кальцием хлоридом до массовой влаги не более 15%. Полученные препараты могут храниться при температуре минус 20°С не более 2,5 лет.

Молекулярные параметры, выраженные как процент выхода полисахарида до достижения константы распределения K_d=0,5 должны составлять не менее 65% для полисахарида серогруппы А и не менее 80% для полисахарида серогруппы С.

Приведенные сведения (табл.1, 2) подтверждают достижение технического результата и правильность сделанного вывода о возможности повышения качества получаемых полисахаридов путем проведением ультрафильтрации на одной из стадий текущего процесса, что исключает необходимость повторения всего цикла очистки полученного продукта. В табл.1 указаны фактические данные по биохимическим характеристикам полисахаридов серогруппы С, полученные в результате дополнительной очистки с помощью ультрафильтрации на мембранах ХМ-300 фирмы Amicon. Сухие некондиционные препараты растворяли и подвергали дополнительной очистке на упомянутых мембранах. Видно, что практически все биохимические показатели улучшаются в процессе ультрафильтрации. Аналогичные результаты получены и для полисахаридов менингококков серогруппы А при ультрафильтрации на мембранах ХМ-100.

Табл.1
Влияние ультрафильтрации (УФ) на биохимические показатели полисахарида серогруппы С№ серииРегламентированные ВОЗ биохимические показателиБелок ≤1,0 %Сиаловая к-та ≥80 %O-ацетил ≥1,5 %Нуклеин, к-ты ≤1,0%Молек. п-ры ≥80 %До уфПосле УФДо УФПосле УФДо УФПосле УФДо УФПосле УФДо УФПосле УФ110,810,3772,683,62,12,351,250,9580,581,3120,80,681,090,62,42,71,71,178,683,8130,420,3171,379,22,32,51,10,976,081,0140,330,2970,476,02,42,92,11,1479,087,0150,440,3376,081,02,32,461,10,8686,190,0Табл.2
Влияние ультрафильтрации на молекулярные параметры менингококковых полисахаридов серогрупп А и С в процессе их выделенияСерогруппа полисахаридаУФ на мембране% выхода полисахарида до K_d=0.5Серия 1Серия 2Серия 3Серия 4Анет62636564да66676768Снет72757778да83808181

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает растворение сухого полуочищенного полисахарида в растворе натрия ацетата с последующей экспозицией, обработку смесью фенола с насыщенным раствором натрия ацетата, центрифугирование, диализ отобранного верхнего слоя против раствора кальция хлорида, осаждение спиртом, центрифугирование, отделение осадка и его высушивание. При этом после проведения диализа продукт диализа отобранного верхнего слоя дополнительно освобождают от низкомолекулярных примесей с молекулярной массой менее 100 кДА для полисахарида серогруппы А и с молекулярной массой менее 300 кДА - для полисахарида серогруппы С путем ультрафильтрации на мембранах. После чего к отобранному на мембране полисахариду А добавляют 2%-ный насыщенный раствор ацетата натрия и осаждают растворенный полисахарид 4 объемами 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С. А отобранный на мембране полисахарид С подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g в течение 2,5-3 ч, надосадочный слой отделяют и также осаждают растворенный полисахарид 4 объемами 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С. Способ позволяет повысить содержание высокомолекулярной фракции полисахаридов без снижения производительности процесса при приготовлении очищенных полисахаридов из сухих полупродуктов. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ выделения очищенных полисахаридов менингококков серогрупп А и С, включающий растворение сухого полуочищенного полисахарида в растворе натрия ацетата с последующей экспозицией, обработку смесью фенола с насыщенным раствором натрия ацетата, центрифугирование, диализ отобранного верхнего слоя против раствора кальция хлорида, осаждение спиртом, центрифугирование, отделение осадка и его высушивание, отличающийся тем, что после проведения диализа продукт диализа отобранного верхнего слоя дополнительно освобождают от низкомолекулярных примесей с молекулярной массой менее 100 кДА для полисахарида серогруппы А и с молекулярной массой менее 300 кДА - для полисахарида серогруппы С путем ультрафильтрации на мембранах, после чего к отобранному на мембране полисахариду А добавляют 2%-ный насыщенный раствор ацетата натрия при рН 7,0 и осаждают растворенный полисахарид 4 объемами 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С, а отобранный на мембране полисахарид С подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g в течение 2,5-3 ч, надосадочный слой отделяют, и также осаждают растворенный полисахарид 4 объемами 96%-ного этанола, охлажденного до 4-5°С.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при растворении сухого полупродукта полисахарида используют раствор натрия ацетата концентрацией 0,3 моль/л из расчета 0,2 л раствора на 1,0 г полупродукта полисахарида, при этом смесь экспонируют 10-12 ч при температуре 4-5°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный раствор полисахарида обрабатывают равным объемом фенола, насыщенного натрия ацетата, смесь перемешивают, центрифугируют, а верхний слой, содержащий полисахарид, отбирают, при этом указанную обработку повторяют по меньшей мере четырехкратно.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что диализ отобранного полисахарида против раствора кальция хлорида концентрацией 0,1 моль/л проводят в течение 20-30 ч до полного удаления фенола.