Способ получения полисахаридно-белковой вакцины против NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В Советский патент 1992 года по МПК A61K39/95 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения вакцин для профилактики менингококковой инфекции

Известен способ получения вакцин против N. menlngltidis серогруппы В, включающий культивирование штамма в жидкой питательной среде, содержащей природное сырье (гидролизат казеина), в условиях аэрации, отделения культуральной жидкости от бактериальной массы, добавление цетавлона к супернатанту, экстракцию полисахаридно- белкового комплекса хлористым кальцием, обработку этиловым спиртом с последующим отделением полученного комплекса центрифугированием, лиофилизацией, гельфильтра- цией в присутствии в препарате тиомерсала с последующим добавлением к фракции выходящей в свободном объеме дезоксихолата натрия, стерилизацией через мембраны,

осаждением фильтрата этиловым спиртом, приготовлением целевого продукта - растворения полисахаридно-белкоеого комп лекса в натрий-фосфатном буфере в 5%-ном растворе лактозы и А12(504)з

Состав питательной среды г/л

Фосфорнокислый

двузамещенный калий0230

L-глутаминовая

кислота00013

Цистеин

гидрохлорид0 130

Углекислый-кислый

натрий 0 842

Гидроксиметил-метил

глицин0716

Сернокислое железо

7-водное0 0028

Хлористый аммоний0 500

VJ

СЛ

о о

00

о

Сернокислый

калий0,048

Раствор хлористого кальция 0,0074%1мл

Гидролизат казеина0,020

1 Хлористый магний

6-водный0,107

Глюкоза7,500

Культивирование менингококка простое - неуправляемое. Цетавлон добавляется до концентрации 1%. Полиеахаридно- белковый комплекс обрабатывают дважды 3-мя объемами этанола. Полисахаридно- белковый комплекс подвергают гельфильт- рации на колонке с сефадексом CL-2B и собирают фракцию, входящую в свободном объеме.

Недостатки известного способа: неуправляемое культивирование не позволяет получать стандартный целевой продукт; необходимость включения в питательную среду природного сырья - гидролизата казеина, загрязняющего препарат неме- нингококковыми макромолекулярными соединениями; использование двух разных детергентов (цетавлон и дезоксихолат натрия), а также консерванта тиомерсала, от остатков которого нужно избавляться, как от вредной примеси; использование сложного и плохо воспроизводимого процесса гельфильтрации; низкая активность получаемого препарата и как следствие этого необходимость его введения совместно с адъювантом (гидроокисью алюминия) для индукции синтеза антикапсульных антител.

Таким образом, недостатками известного способа является сложность и низкая активность вакцины.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение активности вакцины.

Цель достигается тем, что культивирование проводят экспоненциальным отлив- но-доливным методом в жидкой синтетической питательной среде, содержащей L-глутамат натрия, хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний 7- водный, фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный, цитрат натрия трехзаме- щенный, глюкозу - при следующем содержании компонентов, г/л:

L-глутамат

натрия1,300±0,100

L-цистеин

гидрохлорид0,030±0,010Хлористый

калий0,090±0,010

Хлористый

натрий6,000±1,000

0

0,060±0,010 1,250±0,010

2,500±0.200

0,500±0.100 1,600±0,200

Сернокислый магний 7-водный Хлористый аммоний Фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный Цитрат натрия трехзамещенный Глюкоза Дистиллированная вода До 1,00 л Цетавлон добавляют к выросшей культуре до конечной концентрации 0,05-0,15%, 5 выдерживают до образования осадка, аналогично приведенному выше способу проводят экстракцию хлористым кальцием, обработку спиртом осуществляют, добавляя его в объеме 0,20-0.30 мл в течение 2-4 ч, 0 далее полученный надосадок повторно обрабатывают 0,75-0,85 объема спирта в течение 16-20 ч.

Пример 1. Приготовление синтетической питательной среды. 5 Сухая синтетическая питательная среда представляет мелкодисперсный порошок белого цвета. Для приготовления 1 л питательной среды взвешивают (11,75±0,10) г сухой питательной среды следующего со- 0 става, г/л;

L-глутамат

натрия1,30±0,100

L-цистеин гидрохлорид0,03 ±0,010 5 Хлорид калия |0,09±0,010 Хлорид натрия6,00±1,000 Сернокислый магний 7-водный0,06±0,010 Хлорид аммония1,25±0,010 0 Фосфорнокислый

двузамещенный натрий 12-водный2,50±0,200 Цитрат натрия трехзамещенный0,50±0,100 5 и растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, подогревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН 7,2-7,3 с помощью 30,0±1,0% HCf, фильтруют через батистовый фильтр и разливают мерно в емкости. 0 Питательную среду стерилизуют при 112±1 °С в течение 30±5 мин. После стерилизации добавляют стерильный раствор 40±1% глюкозы из расчета 4,0±0.1 мл на 1,0 л питательной среды. В бутыли в стерильных условиях вставляют сифоны, позволяющие стерильно перекачивать питательную среду в ферментер. Приготовление посевной культуры. В стерильных условиях вскрывают ампулу с лиофильно высушенной культурой

5

менингококка штаммов № 125 или № 150. Пастеровской пипеткой вносят в ампулу (0,5±0,1) мл стерильного (0,85±0,01)% раствора хлорида натрия и полученную взвесь последовательно рассеивают на 3 чашки с 5 20% сывороточным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют при 37±0,5°С в течение 18-20 ч в эксикаторе со свечой. Выросшие колонии должны быть в S-форме, прозрачные с голубоватым оттенком, с ровными 10 краями и гладкой блестящей поверхностью, не более 2 мм в диаметре. В мазке, окрашенном по Граму в модификации Калины культура должна представлять собой мелкие грамотрицательные диплококки. Вы- 15 росшая микробная взвесь должна давать положительную реакцию агглютинации на стекле с коммерческой сывороткой N.meningltldls серогруппы В. Культуру, типичную по всем показателям, рассеивают 20 на 15 чашек или 3 матраца с 20%-ным сывороточным агаром Хоттингера, инкубируют при 37±0,5°С в течение 18-20 ч, смывают стерильным 0,85±0,01 %-ным раствором хлорида натрия и помещают в стерильную 25 колбу с сифоном и используют в качестве посевной культуры.

Культивирование в ферментере.

Посевную культуру, находящуюся в колбе с сифоном, присоединяют к шлангу засе- 30 ва и с помощью резиновой груши через шланг со стерильным фильтром в ней создают избыточное давление, позволяющее перелить содержимое колбы в ферментер. Выращивание культуры в синтетической пи- 35 тательной среде проводят при постепенном увеличении частоты вращения мешалки от 70±10 об/мин в начале процесса до (200±10) об/мин в конце экспоненциальной фазы роста (к 7-8 ч роста). К 7-8 ч роста, т.е. 40 к концу экспоненциальной фазы, оптическая плотность (ОД) достигает значений 1,5±0,2 ед. по показателям ФЭК-56М или 46±2 единиц мутности по стандарту оптической плотности ГИСК. В этот момент из фер- 45 ментера сливают половину объема культуры и доливают свежей питательной среды до прежнего объема. После долива питательной средой ОД становится равной 0,72 ±0,1 ед. или 23±2 единицы мутности по стандар- 50 ту оптической плотности ГИСК. Через 2±0,5 ч оптическая плотность культуры достигает уровня, существовавшего до первого слива культуры. Вновь осуществляют слив половины объема -культуры и долив свежей пита- 55 тельной средой до прежнего объема. Такие сливы-доливы производят через каждые- 2,0±0,5 ч. Уровень растворенного в среде кислорода поддерживают на значениях

25±5% от полного насыщения. Слитую из ферментера культуру собирают в стеклянные сосуды.

Получение цетавлонового осадка.

К микробной культуре добавляют свежеприготовленный 10±1%-ный раствор це- тавлона до конечной концентрации 0,10±0,05%. Культуру перемешивают вращением бутыли и оставляют при 20-25°С на 2 ±0,1 ч. За это время полисэхаридно-белко- вый комплекс с цетавлоном выпадает в осадок, и одновременно происходит стерилизация культуры под воздействием цетавлона.

Получение полуфабриката вакцины.

Цетавлоновый осадок отделяют центрифугированием при 4±2°С при 3000 ± 500 об/мин в течение 30±5 мин, промывают дистиллированной водой, при повторном центрифугировании. Осадок взвешивают и сохраняют при -20±2°С.

В дальнейшем осадок хорошо растирают, переносят в химиче ский стакан и прибавляют 1 моль/л раствор CaCl2 в соотношении 1:10. Экстракцию проводят в течение 30±5 мин при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Экстракт отделяют центрифугированием при 6200±100 в течение 30±5 мин и сливают о чистый химический стакан. Повторяют процесс экстракции, добавляя новую порцию раствора СаСЬ. Полученные экстракты объединяют и добавляют 96±1 % этанол до конечной концентрации 25 ±5%, перемешивают и оставляют на 18-20 ч при 6±2°С. Выпавший осадок отделяют на Центрифуге при 6200±100 в течение 30±5 мин и отбрасывают. К надосадочной жидкости добавляют 96±1 % этанол до конечной концентрации 80±15%. Смесь перемешивают и оставляют на 3±0,1 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 2600±100 в течение 30±5 мин. Этот осадок, представляющий собой полуфабрикат вакцины, отмывают три раза 96±1% этанолом, 2 раза ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе над прокаленным CaCte.

Получение вакцины.

Готовят 0,2±0,05%-ный раствор полуфабриката в 1±0,1% апирогенном растворе лактозы. Для удаления нерастворившихся частиц раствор центрифугируют при 12000±1000 об/мин в течение 30±5 мин. Надосадочную жидкость собирают и подвергают стерилизующей фильтрации на фильтрах Milllpore с размером пор 0,45±0,01 мкм. Полученный стерильный раствор вакцины разливают по 1,0±0,1 мл в стерильные ампулы и лиофильно высушивают. Все эти работы проводят с соблюдением правил асептики

Характеристика вакцины. Вакцина представляет собой природный комплекс группоспецифического полисахарида (В-полисахарида) и белков наружной мембраны менингококков серо- группы В. Препарат имеет вид рыхлого порошка белого цвета. Выпускается в сухом виде в ампулах по 3-6 иммунизирующих доз в пересчете на группоспецифический В- полисахарид. Вакцина должна полностью растворяться при добавлении (0,85 ±0,01)%- ного стерильного раствора хлорида натрия в течение 1 ±0,5 мин. Раствор должен представлять бесцветную жидкость, опалесци- рующую, но без видимых включений и осадка. Остаточная влажность готового продукта не более 2,5%. Одна иммунизирующая доза содержит 85-105 мкг белка и 50-55 мкг сиаловых кислот. Отношение в готовой вакцине белок/полисахарид (1:0,6)- (1:0,7). Вакцина должна быть стерильной, не токсичной при испытании ее в тестах на мышах и морских свинках, апирогенной при внутривенном введении кроликам. Вакцина должна быть иммуногенной для мышей и вызывать нарастание в сыворотках иммунизированных мышей титров специфических В-антител, выявляемых в РПГА.

В табл. 1 приведены основные характеристики менингококковой В-вакцины.

Как видно из табл. 1, полученная по предлагаемому способу вакцина индуцирует образование антикапсульных антител в сыворотках мышей при однократной иммунизации в отсутствии адыовантэ, что не достигалось при использовании способа- прототипа.

Полученная по предлагаемому способу вакцина проверена на людях. Под наблюдением находилось 82 человека в возрасте 19-22 г., из которых 56 были вакцинированы подкожно однократно и 43 двукратно. Лица, входившие в контрольную группу, получали инъекции физиологического раствора. Кровь из локтевой вены брали до иммунизации, через 10-24 и 54 дня после первой инъекции и спустя 30 дней после 2-ой инъекции препаратов, т.е. на 85-ый день после первой инъекции. Сыворотки отсасывали и исследовали в реакции пассивной гемагг- лютинации (РПГА), используя в качестве ди- агностикума эритроциты человека с группой крови -(О), сенсибилизированные высокоочищенным капсульным полисахаридом менингококков группы В,

Как видно из табл. 2, двукратная инъекция разработанной вакцины с интервалом в

54 дня обеспечивала интенсивную индукцию антикапсульных антител. При этом 4- кратное нарастание титра антител отмечено у 62,8±7,5% лиц, получивших 2 инъекции

вакцины. Естественное противоэпидимичи- вание обеспечивало аналогичный эффект лишь у существенно меньшего количества 20,8±8,5% лиц в контрольной группе (р 0,05).

Пример 2. Обоснование выбора фазы роста культуры менингококка.

Получение культуры в экспоненциальной фазе роста позволяет сохранять антигены в высокомолекулярном состоянии. Это

показано в следующих опытах, представленных в табл. 3.

Опыт 1. Культивирование менингококка штамма № 125 серогруппы В осуществляли в ферментере экспоненциальным отливнодоливным способом, указанным выше в примере 1, различие состоит в том, что использовали модифицированную полусинтетическую питательную среду Коэн-Виллер. Из выращенных культур выделяли группоспецифический полисахарид по методу Gotschllch C.E. (5) в модификации Кувакиной В.И.. Молекулярную массу полисахаридов определяли методом гельфильтрации на Се- фарозе 4В. При анализе профиля элюции

этого препарата оказалось, что выход полисахарида до ,25 составил 61%.

Опыт 2. Штамм, питательная среда, метод выделения антигена и др. полностью соответствуют опыту 1. Отличие состоит в

том, что процесс культивирования менингококка вели до начала стационарной роста. Все это повлияло на выход высокомолекулярного полисахарида (до Kd 0-25). Он со ста вил-46%.

Опыт 3. Он аналогичен опыту 1, отличие в том, что выращивание менингококка осуществляли до поздней стационарной фазы роста. Выход В-полисахарида до ,25 составил -25%.

Таким образом видно, что по мере роста культуры количество высокомолекулярного компонента в препаратах В-полисахарида снижалось, что обосновывает целесообразность получения культуры в экспоненциальной фазе роста, поскольку высокомолекулярный полисахарид более иммуногенен.

Пример 3. Обоснование использования синтетической питательной среды. Выращивание менингококка осуществляли в двух средах: синтетической и полусинтетической - Коэн-Виллер способом, указанным в примере 1. Способ выделения полисахаридно-белкового комплекса также аналогичен способу, указанному в примере

1. Сравнительный анализ выхода комплекса показал преимущества использования синтетической питательной среды.

В табл. 4 приведены данные, свидетельствующие о преимуществах использования синтетической среды при получении полуфабриката вакцины.

Пример 4. Определение оптимальной концентрации цетавлона.

Штамм, питательная среда, выращива- ние менингококка, сбор культуры аналогичны примеру 1. Для определения оптимальной концентрации цетавлона, добавляемого в культуру, использовали следующие растворы цетавлона - 0,01%-ный, 0,05%-ный, 0,10%-ный, 0,15%-ный, 0,50%- ный.

Втабл.5 приведены данные по обработке культуры разным количеством цетавлона, свидетельствующие о том, что 0,10±0,05% является минимальной концентрацией цетавлона, обеспечивающей гибель менингококков и формирование осадка в течение 2 ч.

Пример 5. Определение оптимальных условий обработки этанолом для выделения полисахаридно-белкового комплекса.

Штамм, питательная среда, способ культивирования менингококка, получение цетавлонового осадка, выделение из него экстракта аналогичны примеру 1. Для определения оптимальных условий обработки этанолом полученных экстрактов использовали различные концентрации при однократной и двукратной обработке.

В табл. 6 приведены результаты определения условий обработки этанолом, из которых следует (опыт 4), что предварительная обработка экстракта (20±5)% этанолом с последующим удалением осадка значительно повышает растворимость препарата, и при этом не происходит потеря сиаловой кислоты (капсульного полисахарида).

Таким образом, предлагаемый способ обладает новизной, заключающейся в ис- пользовании для получения биомассы управляемого отливно-доливного экспоненциального способа культивирования менингококка в синтетической питательной среде. Существенные отличия заключаются в ис- пользовании для обработки цетавлоном цельной культуры, минимальных концентраций цетавлона (0,10±0,05%) и предварительном удалении из солевых полисахаридно-белковых экстрактов фрак- ций, осаждаемых 25% этанолом.

Положительный эффект состоит в значительном упрощении способа получения противоменингококковой вакцины (табл. 7),

которая в отличие от прототипа индуцирует синтез антикапсульных антител у животных в отсутствии адъюванта. Предложенный способ позволил получить препарат, у которого, в отличие от ранее предлагавшихся препаратов, достоверно зарегистрирована способность к индукции антикапсульных антител у человека без применения ионов металла.

Формула изобретения Способ получения полисахаридно-бел- ковой вакцины против Nelsserla meningitldls серогруппы В, включающий культивирование штамма в условиях аэрации в жидкой синтетической питательной среде, содержащей L-цистеин гидрохлорид, глюкозу, хлористый аммоний и дистиллированную воду, сбор культуры, добавление цетавлона, отделение осадка, экстракцию полисахаридно-белкового комплекса хлористым кальцием, многократную обработку экстракта 96%-ным этиловым спиртом с последующим отделением полученного комплекса центрифугированием, стерилизацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения активности вакцины, культивирование проводят экспоненциальным отливно-доливным методом в жидкой питательной среде, дополнительно содержащей L-глутамат натрия, хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний се- миводный, фосфорнокислый двузамещен- ный натрий двенадцат йв одный и цитрат натрия трехзамещенный при следующем содержании компонентов, г/л:

L-глутамат натрия1,2-1,4

L-цистеин гидрОхлорид0,02-0,04

Хлористый калий0,09-0,1

Хлористый натрий5-7

Сернокислый магний

семиводный0,05-0,07

Хлористый аммоний 1,24-1,26

Фосфорнокислый

двузамещенный

натрий двенадцативодный2,3-2,7

Цитрат натрия трехзамещенный0,4-0,6

Глюкоза. 1,4-1,8

Дистиллированная

водаДо 1л

цетавлон добавляют до конечной концентрации 0,05-0,15 об.%, обработку экстракта спиртом осуществляют последовательно при объемном соотношении экстракта и спирта 1:0,2 - V0,3 соответственно, а затем - при объемном соотношении 1:0,75 - 1:0,85 соответственно в течение 16-20 ч

Таблица 1

Использование профилактика менинго кокковой инфекции, медицинская биотехнология. Сущность изобретения вакцинный штамм культивируют в жидкой синтетиче ской питательной среде экспоненциальным отливно-доливчым методом К выросшей культуре добавляют цетавлон до конечной концентрации 0,05-0 15% Выдерживают до образования осадка Преципитат отдел я ют центрифугированием и проводят экстра кцию цетавлонового комплекса хлористым кальцием Экстракты многократно обрабатывают этанолом На заключительном этапе экстрагированный комплекс обрабатывают ацетоном, стерилизуют и лиофильно высу шивают. Полученная вакцина может быть использована для вакцинации людей без применения адъюванта 7 табл сл

аРа«терШйка п)рёпарата белково-полисахарйдной менингококковой В-вакцины

ой W Достаточнйя для сенсибилизации эритроцитов в реакции рассивной гемагглютинации. .

С-г тиет ич«еки значимо у«елиивмие по Ера (нения с контрол«я при р «10.001

Влияние фазы роста культуры N meningitldls серо- группы В на выход высокомолекулярного полисахарида

Сравнительный выход природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны N. menlngitidis серогруппы В штамма №125 при выращивании в ферментере до конца экспоненциальной фазы роста в различных жидких питательных средах.

Определение оптимальной концентрации цетавлона

Т а 6 л и ц л 3

Таблица 4

Таблица 5

Определение оптимальных условий обработки этанолом

Сравнение способа получения полисахаридно-беякового комплекса менингококка серогруппы В

Приготовление препарата в стерильных условиях

Синтез знтикапсульных антител в отсутствии адтиованта.

до рН 8-9

К раствору содержащему Нет 10 мкг комплекса добавляют 0,01 М фосфат натрия до рН - 7,1 и 0,0001 М

НетЕсть

Таблица 6

Т л блица 7