Способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита "В" у взрослых Российский патент 2019 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита «В» у взрослых.

Одной из актуальных проблем современной медицины является высокая заболеваемость герпесвирусными инфекциями. Герпесвирусы достаточно широко распространены в человеческой популяции, они способны поражать практически все органы и системы организма, вызывая латентную, острую, хроническую и медленную формы инфекции [1, 2, 4]. Особое место среди герпесвирусов занимает инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ). ВЭБ-инфекция относится к наиболее актуальным и распространенным заболеваниям в современной педиатрии и детской инфектологии, а также среди взрослого населения [3, 5]. Одной из часто встречаемых форм Эпштейна-Барр-вирусной инфекции является инфекционный мононуклеоз (ИМ) [1, 4]. Такие заболевания, как острый бактериальный тонзиллит и острый вирусный гепатит были выбраны с учетом схожих клинических проявлений. Так, острый бактериальный тонзиллит или ангина, могут встречаться как самостоятельное заболевание или как симптом инфекционного мононуклеоза; также и острый вирусный гепатит может быть отдельным заболеванием или симптомом инфекционного мононуклеоза, что затрудняет проведение дифференциального диагноза между этими заболеваниями.

Наиболее распространенным способом диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии является иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразно-цепная реакция (ПЦР), но на ранних стадиях процесса или происходит медленный иммунный ответ, когда эти методы дают отрицательный результат. Сложность диагностики и изучения проблемы инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии заключается в том, что у взрослых исследования практически не проводятся, в основном это заболевание изучается у детей.

Известен «Способ диагностики инфекционного мононуклеоза». Пархоменко В.А., Каргаполов А.В. Патент на изобретение №2299439 от 20.05.2007 г основанный на исследовании сыворотки крови методом инфракрасной (ИК) спектроскопии. Характеристика: данный способ позволяет оценивать функциональное состояние организма на молекулярном уровне, позволяет проводить диагностику на уровне особенностей химических процессов, составляющих основу жизнедеятельности тканей организма. Исследование ИК спектра сыворотки крови проводили с помощью 9-ти канального инфракрасного анализатора, сопряженного с ПЭВМ. Аппарат имеет набор специальных фильтров для определения по характерным зонам поглощения количества различных химических связей веществ, входящих в состав биологической ткани. При этом цикл одного измерения не превышает одной секунды. В кювету помещают 30 мкл сыворотки крови. Анализ ИК-спектра сыворотки крови проводят в девяти диапазонах, которые характеризуют химические связи основных компонентов крови: 1 канал - 3500-3200 см-1, 2 канал - 3085-2832 см-1, 3 канал - 2120-1880 см-1, 4 канал - 1710-1610 см-1, 5 канал - 1600-1535 см-1, 6 канал - 1543-1425 см-1, 7 канал - 1430-1210 см-1, 8 канал - 1127-1057 см-1 и 9 канал - 1067-930 см-1.

Недостатком способа является сложность аппаратуры и неудобство вычисления.

Также известен «Способ дифференциальной диагностики дифтерии, ангины и инфекционного мононуклеоза». Краснов В.В., Гордецов А.С., Игнатьев А.А. Патент на изобретение №2184962 от 10.08.2000 г. Характеристика: в качестве объекта исследования является сыворотка крови. Образец крови высушивают, вводят полученный сухой остаток в вазелиновое масло с последующим приготовлением суспензии и регистрации спектров поглощения образца в области 1200-1000 см^-1, определяют показатели и диагностируют заболевание. Недостаток способа - сложность вычисления.

За ближайший аналог заявляемого способа является «Способ диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр» (Левина А.С., Иванова В.В., Железникова Г.Ф., Монахова Е.Н. Патент на изобретение №2285262 от 20.04.2005 г.). Сущность способа заключается в том, что на ранних сроках заболевания определяют комплекс цитокинов - гамма-интерферона, фактора некроза опухоли - альфа, интерлейкина-4, устанавливают следующие уровни этих цитокинов: при первом обследовании (с 2 по 10 день болезни) - гамма-интерферона ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли альфа ниже 50 пг/мл, интерлейкина-4 выше 150 пг/мл, при выписке (с 12 по 20 день болезни) - гамма-интерферона ниже 250 пг/мл, на основании которых прогнозируют развитие у детей рецидивирующего течения инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ-инфекцией.

Недостатком данного аналога является узкий спектр исследуемых цитокинов, что может привести к недостоверности дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии и схожих с ним заболеваний (острый бактериальный тонзиллит, острый вирусный гепатит).

Задача изобретения - разработка эффективного способа дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита «В» в короткие сроки, что крайне важно для выбора обоснованной тактики ведения пациента.

Сущность изобретения заключается в исследование пробы венозной крови и определение в комплексе цитохимическую активность кислой фосфатазы (КФ) лимфоцитов, уровень про- (IL-1α, IL-1β, IFN-γ) и противовоспалительных (IL-4, IL-1Ra) цитокинов в сыворотке крови, субпопуляционный состав (CD3-, CD4-, CD8-, CD16-, CD19-) лимфоцитов периферической крови, экспрессию молекул B-клеточного рецепторного комплекса (CD19⁺CD21⁺CD81⁺) и при условии снижения активности кислой фосфатазы лимфоцитов в 0,6 раза (на 19,0%) относительно нормы с равномерным распределением клеток всех степеней активности; повышения в сыворотке крови уровней IL-1α в 1,7 раза, IL-1β в 1,6 раза и INF-γ в 4,3 раза также от нормы; увеличения количества CD3⁺- и CD8⁺-лимфоцитов, снижения числа CD4⁺-, CD16⁺- и CD19⁺-лимфоцитов, включая CD19⁺CD21⁺CD81⁺-, CD19⁺CD21^-CD81⁺- и CD19⁺CD21⁺CD81^--клеток, в периферической крови при увеличении плотности молекул CD19, CD21 и CD81 в экспрессирующих их субпопуляциях В-клеток, подтверждают наличие инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии; при остром бактериальном тонзиллите определяют снижение активности КФ лимфоцитов в 2,4 раза (на 60,0%) от значений нормы; повышение в 2 раза уровней IL-1β и INF-γ; увеличение количества CD19⁺CD21⁺CD81⁺- и CD19⁺CD21^-CD81⁺-лимфоцитов относительно нормы при неизменной плотности молекул CD19, CD21 и CD81 в экспрессирующих их субпопуляциях В-клеток; снижение активности КФ лимфоцитов в 3,5 раза (на 70,0%), повышение уровней IL-1β в 18 раз, INF-γ в 2,3 раза и IL-1Ra в 1,3 раза определяют острый вирусный гепатит «В».

Технический результат настоящего изобретения состоит в сокращении сроков идентификации этиологического агента, вызвавшего заболевание, что крайне важно для выбора обоснованной тактики ведения пациента, и приведет к сокращению пребывания на койке и сроков медико-социальной реабилитации.

Способ осуществляют следующим образом: Было обследовано 93 человека с предварительными диагнозами «инфекционный мононуклеоз», «острый бактериальный тонзиллит» и «острый вирусный гепатит В». В качестве контроля при исследовании в сыворотке крови используют образцы сыворотки здоровых доноров, не имеющих хронических заболеваний. Оценку результатов проводят с использованием статистических методов.

Активность кислой фосфатазы определяют по методу Goldberg, Barka в модификации М.Г. Шубича, М.Г. Авдеевой (1989). Уровень содержания про- (IL-1α, IL-1β, IFN-γ) и противовоспалительных (IL-1Ra, IL-4) цитокинов в периферической крови (сыворотка) обследуемых определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответствующих коммерческих тест-систем производства ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург, Россия) на иммуноферментном анализаторе «ASCENT» (Финляндия), с чувствительностью 1 пикограмм на миллилитр (пг/мл). В основу используемого метода ИФА положен принцип «сэндвич-варианта», для реализации которого используют два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к цитокинам. Методом лазерной проточной цитофлюориметрии (Cytomics FC-500 «BeckmanCoulter», США) проводят оценку состояния клеточного звена иммунитета с применением моноклональных антител к CD3-, CD4-, CD8-, CD16-, CD19-рецепторам лимфоцитов. Оценку рецепторного аппарата лимфоцитов проводят при тестировании одномоментной экспрессии на мембране клеток молекул CD19, CD21, CD81 методом проточной цитометрии на CYTOMIC SFC500 (Beckman Coulter, США) с использованием панели моноклональных антител: CD19, CD21, CD81 (фирма Beckman Coulter, США). Наряду с оценкой абсолютного содержания лимфоцитов, одномоментно экспрессирующих CD19, CD21, CD81, исследуют уровень плотности экспрессируемых молекул по показателю интенсивности флуоресценции (MFI). Субпопуляционный состав лимфоцитов определяют путем двойного гейтирования по CD19⁺. Статистическую обработку полученных данных производят с использованием программы для IBM PC "BIOSTAT" (Stenton A. Glantz, Ph.D., 1999).

Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах:

Пример 1.

Больная Т., 18 лет, история болезни №5264. Предварительный диагноз: Инфекционный мононуклеоз? Острый бактериальный тонзиллит.

Поступила в ГБУЗ СКИБ на 5-й день болезни с жалобами на выраженную общую слабость, повышение температуры тела до 39,5С ежедневно, першение, боль в горле, усиливающиеся при глотании, увеличение шейных лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней степени тяжести за счет интоксикационного синдрома, температура тела 38,5°С, носовое дыхание свободное, голос осиплый, зев ярко гиперемирован, миндалины отечные, гипертрофированы до 2-3 степени, покрыты гнойными налетами с двух сторон, увеличены подчелюстные лимфатические узлы в диаметре до 1,0-1,5 см, при пальпации эластичные, болезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень при пальпации на уровне края реберной дуги, селезенка нормальных размеров. В общем анализе крови лейкоцитоз 10,6×10⁹/л, лимфоцитоз 55%, атипичные мононуклеары 17%; в биохимическом анализе крови - цитолиз (АЛТ 58 Ед/л, ACT 45 Ед/л). ИФА ВЭБ - IgM - сомнительный, ЕА IgG, NA IgG - отрицательный, ДНК ВЭБ - отрицательно.

Проведены дополнительные методы исследования:

активность КФ - 124,0 у.е. (в 0,6 раза ниже контрольной группы 210,4±12,85 у.е) с относительно равномерным распределением по степеням активности: нулевая - 28%, слабая - 30%, умеренная - 20%, выраженная - 22% (определена по методу Goldberg, Barka в модификации М.Г. Шубича, М.Г. Авдеевой (1989));

цитокиновый профиль (определяется методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответствующих коммерческих тест-систем производства ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург, Россия) на иммуноферментном анализаторе «ASCENT» (Финляндия), с чувствительностью 1 пикограмм на миллилитр (пкг/мл): IL-1α - 2528,9 пкг/мл (в 1,7 раза выше контрольной группы 1452,6±226,82 пкг/мл), IL-1β - 4,32 пкг/мл (в 1,6 раза выше контрольной группы 2,7±0,29 пкг/мл), IL-1Ra - 521,8 пкг/мл (не отличается от контрольной группы 502,2±73,82 пкг/мл), IL-4 - 45,7 пкг/мл (не отличается от контрольных значений 43,6±5,48 пкг/мл), INF-γ - 160,2 пкг/мл (в 4,3 раза выше значений контрольной группы 37,1±3,14 пкг/мл);

иммунологические параметры (клеточное звено иммунитета определяется методом лазерной проточной цитофлюориметрии (Cytomics FC-500 «BeckmanCoulter», США; оценка рецепторного аппарата лимфоцитов проводят при тестировании одномоментной экспрессии на мембране клеток молекул CD19, CD21, CD81 методом проточной цитометрии на CYTOMIC SFC500 (Beckman Coulter, США) с использованием панели моноклональных антител): CD3⁺ - 80,3% (повышен результат при норме 73,2±2,5), CD4⁺ - 16,8% (показатель снижен, норма 42,1±1,8%), CD8⁺ - 52,5% (повышен, норма 33,7±1,6%), CD16⁺ - 11,8% (снижен, норма 16,2±2,4%), CD19⁺ - 3,6% (снижен, норма 10,0±1,32%); CD19⁺CD21⁺CD81⁺ - 1,25% (снижен при норме 3,65±1,06) при MFI 19 - 9,83% (повышен, норма 6,6±0,33), MFI 21 - 3,68% (повышен, норма 2,5±0,34), MFI 81 - 8,43% (повышен, норма 3,1±0,31); CD19⁺CD21⁺CD81^- - 0,93% (снижен, норма 2,2±0,57) при MFI 21 - 4,16% (повышен, норма 2,2±0,20); CD19⁺CD21^-CD81⁺ - 0,63% (снижен, норма 1,3±0,32) при MFI 81 - 14,3% (повышен, норма 4,7±0,84).

Заключительный диагноз: Инфекционный мононуклеоз, средней тяжести.

Пример 2.

Больной М., 21 год, история болезни №10559. Предварительный диагноз: Острый бактериальный тонзиллит. Инфекционный мононуклеоз?

Поступил в ГБУЗ СКИБ на 3-й день болезни с жалобами на общую слабость, ломоту во всем теле, повышение температуры тела до 38,5°С с ознобом ежедневно, першение, боль в горле, усиливающиеся при глотании, увеличение шейных лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней степени тяжести за счет интоксикационного синдрома, температура тела 37,5°С, носовое дыхание свободное, зев ярко гиперемирован, миндалины отечные, гипертрофированы до 2-3 степени, покрыты умеренно гнойными налетами с двух сторон, увеличены подчелюстные, передне-шейные лимфатические узлы в диаметре до 1,0 см, при пальпации эластичные, болезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень при пальпации 10/+0,5×9×8 см, селезенка не увеличена. В общем анализе крови лейкоцитоз 26,1×10⁹/л, сегментоядерный сдвиг 75%, СОЭ 40 мм/ч; в биохимическом анализе крови - цитолиз (АЛТ 48 Ед/л, ACT 39 Ед/л). ИФА ВЭБ - отрицательно.

Проведены дополнительные методы исследования:

активность КФ - 87,0 у.е. с распределением по степеням активности: нулевая - 54%, слабая - 37%, умеренная - 7%, выраженная - 2% (снижен на 60% нормы);

цитокиновый профиль - IL-1α - 1459,2 пкг/мл (не отличается от нормы), IL-1β - 5,72 пкг/мл (повышен в 2 раза от нормы), IL-1Ra - 506,3 пкг/мл (не отличается от нормы), IL-4 - 40,31 пкг/мл (не отличается от нормы), INF-γ - 75,14 пкг/мл (повышен в 2 раза от нормы);

иммунологические параметры - CD3⁺ - 77,4% (норма), CD4⁺ - 39,9% (норма), CD8⁺ - 34,3% (норма), CD16⁺ - 15,7% (норма), CD19⁺ - 10,2% (норма); CD19⁺CD21⁺CD81⁺ - 54,1% (повышен) при MFI 19 - 9,7% (норма), MFI 21 - 3,4% (норма), MFI 81 - 2,8% (норма); CD19⁺CD21⁺CD81^- - 2,25% (норма) при MFI 21 - 2,3% (норма); CD19⁺CD21^-CD81⁺ - 20,2% (повышен) при MFI 81 - 4,2% (норма).

Заключительный диагноз: Острый бактериальный тонзиллит, средней тяжести.

Пример 3.

Больная Ф., 25 лет, история болезни 10864. Предварительный диагноз: Острый вирусный гепатит. Инфекционный мононуклеоз?

Поступила в ГБУЗ СКИБ на 6-й день болезни с жалобами на общую слабость, ломоту во всем теле, повышение температуры тела до 38,0°С с ознобом ежедневно, увеличение шейных лимфатических узлов, желтушность склер, потемнение мочи, разбитость.

При поступлении состояние средней степени тяжести за счет интоксикационного синдрома, температура тела 37,2°С, носовое дыхание свободное, зев спокойный, миндалины за дужками, увеличены подчелюстные лимфатические узлы в диаметре до 0,5 см, при пальпации эластичные, безболезненные, не спаянные с окружающими тканями. Умеренная иктеричность склер и слизистых, кожные покровы загорелые. Активных проявлений геморрагического синдрома нет. Печень при пальпации 12/+1,5×10×10 см, край эластичный, селезенка +2,0 см, край эластичный. В общем анализе крови лейкоциты 5,7×10⁹/л, лимфоцитоз 64%, СОЭ 10 мм/ч; в биохимическом анализе крови - холестаз (общий билирубин 80,1 мкмоль/л, прямой билирубин 40,2 мкмоль/л), цитолиз (АЛТ 1115 Ед/л, ACT 1069 Ед/л). ИФА ВЭБ - отрицательно, ИФА на маркеры вирусных гепатитов В, С - отрицательно.

Проведены дополнительные методы исследования:

активность КФ - 64,0 у.е. (снижена на 70,0% от нормы) с распределением по степеням активности: нулевая - 68%, слабая - 30%, умеренная - 2%, выраженная - 0;

цитокиновый профиль - IL-1α 1528,4 пкг/мл (норма), IL-1β 50,64 пкг/мл (в 18 раз выше нормы), IL-1Ra 658,5 пкг/мл (в 1,3 раза выше нормы), IL-4 41,31 пкг/мл, INF-γ 90,4 пкг/мл (в 2,3 выше нормы);

при повторном исследовании в ИФА ВЭБ отрицательно, обнаружены HBsAg, At HBcor IgM.

Заключительный клинический диагноз: Острый вирусный гепатит «В», желтушная форма, циклическое течение, средней тяжести.

Список литературы:

1. Инфекционные болезни: национальное руководство / Под ред. Н.Д. Ющука, Ю.Я. Венгерова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.

2. Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В. Герпесвирусные инфекции человека: руководство для врачей / под ред. В.А. Исакова. - СПб.: СпецЛит, 2013. - 2-е изд., перераб. и доп. - 670 с.: ил.

3. Павленко О.А., Щербак В.А. Роль вируса Эпштейна-Барр в патологии верхних отделов пищеварительного тракта // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - №3. - С. 53-55.

4. Руководство по инфекционным болезням / Под ред. чл.-кор. РАМН, проф. Ю.В. Лобзина. 3-е, доп. и перераб. - СПб.: «Издательство Фолиант», 2003.

5. Симованьян Э.Н., Денисенко В.Б., Григорян А.В., Ким М.А., Бовтало Л.Ф., Белугина Л.В. Эпштейна-Барр вирусная инфекция у детей: совершенствование программы диагностики и лечения // Детские инфекции. - 2016. - №1. - С. 15-24.

6. Лебедев В.В., Авдеева М.Г., Шубич М.Г. Цитохимическое изучение лейкоцитов в клинике инфекционных болезней // Учебно-методическое пособие. - 1994. - С. 10-13, 20-22.

Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита «В» у взрослых. Предложено комплексное исследование факторов крови пациента и при условии определенных отклонений относительно нормы их значений дифференцируют заболевания. Способ позволяет упростить и ускорить дифференциальную диагностику. 1 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита «В» у взрослых, включающий клиническое обследование больного, исследование пробы венозной крови, отличающийся тем, что определяют в комплексе цитохимическую активность кислой фосфатазы (КФ) лимфоцитов, уровень про- (IL-lα, IL-lβ, IFN-γ) и противовоспалительных (IL-4, IL-1Ra) цитокинов в сыворотке крови, субпопуляционный состав (CD3-, CD4-, CD8-, CD16-, CD19-) лимфоцитов периферической крови, экспрессию молекул В-клеточного рецепторного комплекса (CD19⁺CD21⁺CD81⁺) и при условии снижения активности кислой фосфатазы лимфоцитов в 0,6 раза относительно нормы (210,4±12,85 у.е.) с равномерным распределением клеток всех степеней активности; повышения в сыворотке крови уровней IL-lα в 1,7 раза (норма 1452,6±226,82 пкг/мл), IL-1β в 1,6 раза (норма 2,7±0,29 пкг/мл) и INF-γ в 4,3 раза также от нормы (37,1±3,14 пкг/мл); увеличения количества CD3⁺- и СD8⁺-лимфоцитов, снижения числа CD4⁺-, CD16⁺- и СD19⁺-лимфоцитов, включая CD19⁺CD21⁺CD81⁺-, CD19⁺CD21^-CD81⁺- и CD19⁺CD21⁺CD81^--клеток, в периферической крови при увеличении плотности молекул CD19, CD21 и CD81 в экспрессирующих их субпопуляциях В-клеток, подтверждают наличие инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии; при остром бактериальном тонзиллите - снижение активности КФ лимфоцитов в 2,4 раза от нормы; повышение в 2 раза уровней IL-1β и INF-γ; увеличение количества CD19⁺CD21⁺CD81⁺- и CD19⁺CD21^-CD81⁺-лимфоцитов относительно нормы при неизменной плотности молекул CD19, CD21 и CD81 в экспрессирующих их субпопуляциях В-клеток; при снижении активности КФ лимфоцитов в 3,5 раза, повышении уровней IL-1β в 18 раз, INF-γ в 2,3 раза и IL-1Ra в 1,3 раза (норма 502,2±73,82 пкг/мл) определяют острый вирусный гепатит «В».