СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/68 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к детским инфекционным болезням.

В последние годы участились случаи клинических проявлений герпетических инфекций, эти инфекции характеризуются многообразием клинических проявлений и наиболее тяжелым течением у лиц со сниженным иммунитетом. Важнейшим свойством герпесвирусов является хроническое течение и их пожизненная персистенция в иммунокомпетентном организме и, как следует из данных литературы, могут развиваться иммунодефицитные состояния [1, 4, 5].

Одним из вариантов этих болезней является инфекционный мононуклеоз. Он представляет собой острое, обычно доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, чаще всего встречающееся в детском, юношеском возрасте (реже у взрослых), сопровождающееся иногда серьезными осложнениями [3, 5, 7].

Клинические проявления инфекционного мононуклеоза у детей разнообразны, что создает определенные трудности в своевременной и правильной диагностике [2, 3, 5], а также при дифференциально-диагностическом разграничении его от заболеваний, сопровождающихся мононуклеозоподобным синдромом.

По современным данным, вирус Эпштейна-Барр является возбудителем инфекционного мононуклеоза в 90% случаев заболевания. Но в последние годы этиологические понятия этого заболевания значительно расширились, что нашло отражение в Международной классификации болезней (10 пересмотра). Выделяют: инфекционный мононуклеоз, вызванный Эпштейна-Барр вирусом (ВЭБ), цитомегаловирусный мононуклеоз (ЦМВ) [6]. Особенности клиники инфекционного мононуклеоза в зависимости от этиологического фактора не до конца изучены, поэтому очень важна его дифференциальная диагностика на начальной стадии болезни.

Наиболее распространенным методом диагностики герпесвирусов является метод иммуноферментного анализа (ИФА). Сыворотки обследованных больных инкубируют с рекомбинантными белками антигенами ВЭБ и ЦМВ. Далее связавшиеся антитела выявляют при инкубации с конъюгатом антител к иммуноглобулинам с пероксидазой хрена. Учет результатов проводят по измерению оптической плотности растворов при длине волны 450 нм.

Но серологическое обследование имеет существенные недостатки: проведение исследования на антитела к ВЭБ и ЦМВ одновременно требует больших экономических затрат, с другой стороны наличие антител к ВЭБ и ЦМВ не является показателем инфекционного процесса (важнейшим свойством герпесвирусов является пожизненная их персистенция в иммунокомпетентном организме, в связи с чем может быть нарушено образование антител). У детей младшего возраста определение серологических маркеров малоэффективно, что обусловлено имеющимся трансплацентарным иммунитетом и небольшим количеством инфекционного агента, полученного от родителей.

В последние годы широко применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Но, учитывая способность герпесвирусов к пожизненной персистенции, ДНК вирусов можно обнаружить и при бессимптомном вирусоносительстве или латентной инфекции [1, 5].

Известны способы, основанные на исследовании сыворотки крови методом инфракрасной спектроскопии: («Способ диагностики инфекционного мононуклеоза». Пархоменко В.А., Каргаполов А.В. Патент на изобретение №2299439 от 20.05.2007 г.), («Способ дифференциальной диагностики дифтерии, ангины и инфекционного мононуклеоза». Краснов В.В., Гордецов А.С., Игнатьев А.А. Патент на изобретение №2184962 от 10.08.2000 г.).

Прототипом заявленного способа является «Способ диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр» (Левина А.С., Иванова В.В., Железникова Г.Ф., Монахова Е.Н. Патент на изобретение №2285262 от 20.04.2005 г.) Сущность способа заключается в том, что на ранних сроках заболевания определяют комплекс цитокинов - гамма-интерферона, фактора некроза опухоли - альфа, интерлейкина-4, устанавливают следующие уровни этих цитокинов: при первом обследовании (с 2 по 10 день болезни) - гамма-интерферона ниже 400 пг/мл, фактора некроза опухоли альфа ниже 50 пг/мл, интерлейкина-4 выше 150 пг/мл, при выписке (с 12 по 20 день болезни) - гамма-интерферона ниже 250 пг/мл, на основании которых прогнозируют развитие у детей рецидивирующего течения инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ-инфекцией.

Общим недостатком данных аналогов является то, что диагностика инфекционного мононуклеоза направлена на одного возбудителя - вирус Эпштейна-Барр.

Задача изобретения - разработка эффективного способа диагностики возбудителя болезни в короткие сроки, что крайне важно для прогноза развития заболевания и позволяет своевременно назначить патогенетическую терапию.

Технический результат настоящего изобретения состоит в укорачивании сроков выявления возбудителя инфекционного мононуклеоза, что крайне важно для прогноза развития заболевания и позволяет своевременно назначить патогенетическую терапию.

Заявленный способ диагностики возбудителя инфекционного мононуклеоза с использованием сывороточных цитокинов имеет следующие общие признаки с прототипом.

1. Методика забора исследуемого материала (кровь из локтевой вены не более 3-5 мл, двукратно).

2. Позволяет определить тип иммунного ответа при инфекционном мононуклеозе.

Отличительными от прототипа признаками заявляемого способа являются следующие признаки.

1. Определение содержания цитокинов сыворотки крови - ИЛ-6, ИЛ-8.

2. Определение сывороточных цитокинов у больных инфекционным мононуклеозом разной этиологии.

3. Определение статистически достоверных различий в секреции ИЛ-6 и ИЛ-8 у больных ИМ, вызванных ВЭБ и ЦМВ, а также их сочетанием.

Для устранения указанных недостатков авторы предлагают свой способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза в зависимости от этиологического агента, основанный на клинико-иммунологическом обследовании и отличающийся тем, что на ранних сроках заболевания определяют комплекс сывороточных цитокинов - интерлейкина-6 и интерлейкина-8, устанавливают уровни этих цитокинов, при которых можно диагностировать возбудителя инфекционного мононуклеоза.

Способ осуществляется следующим образом: с помощью метода сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем производства Санкт-Петербургской фирмы ООО «Цитокин» определяли в сыворотке крови больного комплекс цитокинов - интерлейкин-6 и интерлейкин-8. Были обследованы 3 группы пациентов с инфекционным мононуклеозом: 16 пациентов с инфекционным мононуклеозом, вызванным вирусом Эпштейна-Барр, 14 пациентов с цитомегаловирусным мононуклеозом и 12 пациентов с сочетанной формой инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр и цитомегаловирусом. В качестве контроля при исследовании уровня цитокинов в сыворотке крови использовались образцы сыворотки здоровых детей, не имеющих хронических заболеваний. Оценку результатов проводили с использованием статистических приемов для малых выборок. Статистическая обработка полученных материалов произведена с применением прикладной программы Statistica 6,0. с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

При изучении цитокинов в сыворотке крови при инфекционном мононуклеозе (таблица) содержание ИЛ-6, регулятора иммунного воспаления, в сыворотке крови в острый период зависело от вида возбудителя. Если при ИМ-ВЭБ наблюдалось повышение концентрации ИЛ-6 в 13 раз (112,7±19,6 пг/мл против 8,4±0,7 пг/мл у здоровых, р<0,001), то при ИМ-ЦМВ оно было достоверно меньшим (в 7,6 раза). Уровень ИЛ-6 при микст-инфекции достигал 56,5±8,1 пг/мл и превышал показатели контрольной группы в 6,7 раз.

Был показателен мониторинг одного из ранних медиаторов «доиммунного» воспаления, хемоатрактанта, индуцирующего экспрессию адгезионных молекул, ИЛ-8. В острый период болезни у больных с ИМ-ВЭБ наблюдается его гиперсекреция: 163,9±20,0 пг/мл против 19,0±0,8 пг/мл, р<0,001), что выше контроля в 8,6 раза. Менее активно этот процесс протекает при ИМ-ЦМВ (37,9±4,7 пг/мл). У детей, больных сочетанной формой инфекционного мононуклеоза, ИЛ-8 был выше в 4,7 раз по сравнению с контрольной группой (88,9±8,2 пг/мл против 19,0±0,8 пг/мл, р<0,01).

Нашими исследованиями определены статистически достоверные различия в секреции ИЛ-6 и ИЛ-8 у больных ИМ разной этиологии (ВЭБ и ЦМВ), что позволяет проводить косвенную диагностику данных возбудителей.

Таблица
Уровень сывороточных цитокинов у детей, больных инфекционным мононуклеозом различной этиологии в острый период заболевания (пг/мл)   Контрольная группа (n=10) Больные инфекционным мононуклеозом различной этиологии Достоверность различий ВЭБ(n=16) ЦВМ(n=14) ВЭБ+ЦВМ(n=12) 1 2 3 IL-6 8,4±0,7 112,7±19,6*** 63,6±11,9*** 56,5±8,1*** 1-2<0,05 1-3,2-3<0,01 IL-8 19,0±20,0 163,9±20,0*** 52,6±2,5*** 88,9±8,2*** 1-3<0,001 2-3,1-3<0,01

Примечание: статистическая достоверность различий показателей с группой контроля р<0,001- ***

Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах.

Пример 1.

Больная Л., 5 лет, история болезни №1355. Предварительный диагноз - Инфекционный мононуклеоз.

Поступила в ГКБ №2 в ДИО 2 на 2 день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 38,0°С, вялость, затрудненное носовое дыхание, храп во сне, увеличение шейных лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации, температура тела 38,3°С, носовое дыхание затруднено, в зеве яркая разлитая гиперемия, миндалины гипертрофированы до 2-3 степени, на обеих миндалинах обильные белые налеты. Пальпируются задне- и переднешейные лимфоузлы до 2,0 см, в виде «пакетов», умеренно-болезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень пальпируется на 2,5 см ниже реберной дуги. Селезенка +2,5 см. В клиническом анализе крови: лейкоцитоз 27,9×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 18%, СОЭ - 9 мм/час.В крови выявлены маркеры ВЭБ инфекции: anti-VEB-VCA IgM. Методом ПЦР обнаружено ДНК ВЭБ. Антитела к цитомегаловирусу не обнаружены. ДНК цитомегаловируса методом ПЦР не обнаружена.

Исследование цитокинового спектра:

1-3 день болезни: ИЛ-6 - 119 пг/мл, ИЛ-8 - 168 пг/мл.

14-16 день болезни: ИЛ-6 - 10 пг/мл, ИЛ-8 - 32 пг/мл.

Окончательный диагноз: Инфекционный мононуклеоз, типичный, среднетяжелое течение.

Пример 2.

Больная Д., 6 лет, история болезни №1184. Предварительный диагноз: ОРВИ. Шейный лимфаденит. Аллергическая сыпь.

Поступила в ГКБ №2 в ДИО 2 в первые сутки заболевания с жалобами на повышение температуры тела до 38,5°С, вялость, затрудненное носовое дыхание, боль в горле при глотании, кашель, увеличение шейных лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации Кожные покровы розовые, на теле и конечностях ярко-розовая пятнисто-папулезная сыть аллергического характера. Носовое дыхание затруднено, отделяемое скудное, слизистое. В зеве яркая разлитая гиперемия, миндалины гипертрофированы до 3 степени, гнойных налетов нет. Пальпируются задне- и переднешейные лимфоузлы до 2,0 см в виде «пакетов», безболезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень на 2,0 см ниже края реберной дуги. Селезенка увеличена на 1,5 см.

В клиническом анализе крови: лейкоцитоз 17,3×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 10%, СОЭ - 8 мм/час.

В крови выявлены маркеры: цитомегаловирусной инфекции: anti-CMV IgM.

Методом ПЦР: ДНК ЦМВ не обнаружено.

Исследование цитокинового спектра:

1-3 день болезни: ИЛ-6 - 81 пг/мл, ИЛ-8 - 53 пг/мл.

14-16 день болезни: ИЛ-6 - 25 пг/мл, ИЛ-8 - 20 пг/мл.

Окончательный диагноз: Инфекционный мононуклеоз цитомегаловирусной этиологии, среднетяжелое течение.

Пример 3.

Больной И., 4 года, история болезни №1819. Предварительный диагноз: Инфекционный мононуклеоз.

Поступил в ГКБ №2 в ДИО 2 в первые сутки заболевания с жалобами на повышение температуры тела до 38,0°C, вялость, затрудненное носовое дыхание, боль в горле при глотании, увеличение шейных и подчелюстных лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации, носовое дыхание затруднено, в зеве яркая разлитая гиперемия, миндалины гипертрофированы до 2 степени, на обеих миндалинах гнойные фолликулы, зернистость задней стенки глотки. На слизистой ротовой полости единичные афты. Пальпируются задне- и переднешейные лимфоузлы до 1,5 см, подчелюстные до 2,5 см, единичные, безболезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень на 2,0 см ниже края реберной дуги. Селезенка увеличена на 1,5 см.

В клиническом анализе крови: лейкоцитоз 15,7×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 29%, СОЭ - 24 мм/час.

В крови выявлены маркеры: ВЭБ-инфекции: anti-VEB-VCA IgM, anti-VEB-

NA IgG; цитомегаловирусной инфекции: anti-CMV IgM и anti-CMV IgG.

Методом ПЦР обнаружены ДНК ВЭБ и ЦМВ.

Исследование цитокинового спектра:

1-3 день болезни: ИЛ-6 - 53 пг/мл, ИЛ-8 - 86 пг/мл.

14-16 день болезни: ИЛ-6 - 40 пг/мл, ИЛ-8 - 19 пг/мл.

Окончательный диагноз: Инфекционный мононуклеоз микст-инфекция (ВЭБ+ЦМВ), среднетяжелое течение.

Настоящий способ определения возбудителя инфекционного мононуклеоза у детей позволяет своевременно предположить возбудителя данного заболевания.

Список литературы.

1. Кетлинский С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета / С.А.Кетлинский, Н.М.Калинина // Иммунология. - 1995. - №3. - С.30-44.

2. Лабораторная диагностика инфекционного мононуклеоза у детей / Н.Е.Новосад, О.В.Шамшева, Н.Д.Львов, Н.А.Гусева и др. // Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей: Материалы IV конгресса педиатров-инфекционистов России. - М., 2005. - С.135.

3. Пархоменко В.П. Инфекционный мононуклеоз у детей / В.П.Пархоменко, А.Ф.Виноградов // Рос. мед. журнал. - 2005. - №2. - С.56-58.

4. Петров Р.В. Иммунореабилитация и стратегия медицины / Р.В Петров, // International J. Immunorehabilitation. - 1994. - №1. - С.5-6.

5. Перадзе Х.Д. Клинико-лабораторные особенности острых и хронических форм Эпштейна-Барр вирусной инфекции (инфекционного мононуклеоза) у подростков и лиц молодого возраста: автореф. дис.… канд. мед. наук/ Перадзе Хатума Джемалиевна - СПб, 2003, 23 с.

6. Papesch М., Epstein-Barr virus infectious mononucleosis / M. Papesch, R. Watkins // Clin. Otolaryngol. - 2001. - Vol.26. - P. 3-8.

7. Susterman N.H. Fatal massive hepatic necrosis in cytomegalovirus mononucleosis / N.H. Susterman, C. Frauenhoffer, M.D. Kinsey //Ann. Intern. Med. - 1978. - Vol.88, №6. - P. 810-812.

Способ относится к области лабораторной диагностики и может применяться для дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусами Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловирусом (ЦМВ) и их сочетанием (микст). Для осуществления способа на ранних стадиях заболевания (1-3 дни болезни) в сыворотке крови больного методом сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа определяют цитокины: интерлейкин-6 и интерлейкин-8. При ВЭБ-инфекции уровень интерлейкина-6 ниже 160 пг/мл, а интерлейкина-8 ниже 200 пг/мл. При цитомегаловирусном мононуклеозе уровень интерлейкина-6 ниже 90 пг/мл, а интерлейкина-8 ниже 60 пг/мл. Микст-инфекцию диагностируют при показателях: интерлейкин-6 - ниже 90 пг/мл и интерлейкина-8 - ниже 100 пг/мл. Использование изобретения позволяет в начале заболевания достоверно точно определить возбудителя болезни в короткие сроки, что крайне важно для прогноза развития заболевания, и позволяет своевременно назначить патогенетическую терапию. 1 табл.

Способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза различной этиологии у детей, включающий оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что на ранних стадиях заболевания (1-3-й дни болезни) определяют комплекс цитокинов - интерлейкин-6 и интерлейкин-8, устанавливают уровни цитокинов: при ВЭБ-инфекции интерлейкин-6 ниже 160 пг/мл и интерлейкин-8 ниже 200 пг/мл, при цитомегаловирусном моноклеозе интерлейкин-6 ниже 90 пг/мл и интерлейкин-8 ниже 60 пг/мл, при мист-инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр и цитомегаловирусом - интерлейкин-6 ниже 90 пг/мл и интерлейкин-8 ниже 100 пг/мл.