СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ПРОАЛЛЕРГИЧЕСКИХ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ В НАЗАЛЬНОМ СЕКРЕТЕ У ДЕТЕЙ РАННЕГО И ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭТИОЛОГИИ РЕЦИДИВИРУЮЩИХ ОСТРЫХ РИНОФАРИНГИТОВ И АДЕНОИДИТОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии и иммунологии. Основано на современных методах определения иммунорегуляторного потенциала мукозального иммунитета, ассоциированного с носом и глоткой, и предназначено для диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возраста.

Известно, что инфекционный иммунитет регулируется молекулами межклеточных взаимодействий лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток - интерлейкинами (Ярилин, А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.). Полиморфизм в генах интерлейкинов определяет их конституциональную норму реакции, а в целом для индивидуума ограничивает иммунный ответ (Симбирцев, А.С. Роль цитокинов в регуляции эмбрионального развития и формировании первичных иммунодефицитов // Russian journal of immunology. - 2005. - Vol.9(2). - С.12-14). Данный постулат справедлив и для мукозальной иммунной системы, ассоциированной со слизистыми носа и глотки. Тем самым характер локального иммунного ответа на вирусы и бактерии, взаимодействующие с глоточным биотопом, также будет ограничен нормой реакции регуляторного потенциала, сформированного интерлейкинами носа и глотки (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. - М.: РГМУ, 1999, 74 с.). Этиология рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возраста связана с респираторными вирусами, с цитомегаловирусом, с вирусом Эпштейна-Бара, а также с персистированием представителей условно-патогенной микрофлоры глоточного биотопа (стрептококками, стафилококками, синегнойной и гемофильной палочками) (Дроздова М.В. Лимфопролиферативный синдром у детей с заболеваниями верхних дыхательных путей (этиология, патогенез, клиническая и лабораторная диагностика): Автореф. дисс. докт. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2010. - 34 с.). Было показано, что особенности локального цитокинового статуса назального секрета ассоциированы с клиническими характеристиками рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возрастов (Кутенкова Н.Е. Роль атопической сенсибилизации к условно-патогенной микрофлоре в патогенезе рецидивирующих респираторных инфекций у детей раннего и дошкольного возраста: Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Кемерово, 2012. - 24 с.). Исходя из этого, применение исследований интерлейкинового статуса назального секрета может быть определяющим в диагностике этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возрастов.

Исследования иммунорегуляторного потенциала, обеспеченного системой цитокинов, мукозальной иммунной системы для дополнительной этиопатогенетической диагностики патологии респираторного тракта предлагалось неоднократно.

Известен способ (Суровенко Т.Н., Маркелова Е.В., Чикаловец И.В., Костюшко А.В., Корявченкова И.В. Способ определения цитокинов и иммуноглобулина Е в конденсате выдыхаемой влаги, RU (11) 2222015 (13) C1, 29.05.2002) дополнительной патогенетической диагностики бронхиальной астмы. Данный способ позволяет эффективно диагностировать нарушения иммунорегуляторного потенциала при бронхиальной астме. Но данный способ не предназначен для диагностики этиологических факторов ринитов, фарингитов, аденоидитов у детей раннего и дошкольного возрастов.

Другой способ исследования цитокинов мукозального иммунитета респираторного тракта (Постникова Л.Б., Кубышева Н.И. Способ прогнозирования бронхиальной обструкции при хроническом бронхите, RU (11) 2245550 (13) С2, 29.04.2002) связан с исследованием провоспалительных и проаллергических интерлейкинов в бронхо-альвеолярной жидкости, крови и слюне одновременно. Увеличение концентрации интерлейкина-1-бэта в крови по отношению к бронхо-альвеолярной жидкости более чем в 10 раз является новым диагностическим критерием развивающейся бронхиальной обструкции. Данный метод увеличивает эффективность диагностики бронхиальной обструкции более чем 2,5 раза.

Основным недостатком данного метода является трудность выполнения забора бронхо-альвеолярной жидкости, требуется наркоз.

Наиболее близкими к заявленному способу по технической сущности и достигаемому результату является патент Постниковой Л.Б., Кубышевой Н.И. «Способ прогнозирования бронхиальной обструкции при хроническом бронхите, RU (11) 2245550 (13) С2, 29.04.2002», которые мы принимаем за прототип, а недостатки его изложены выше.

Технический результат изобретения заключается в улучшении эффективности диагностики рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возрастов за счет выявления дисбаланса провоспалительных и проаллергических цитокинов назального секрета. Известно, что при рецидивировании вирусных инфекций в крови повышается уровень интерферона-альфа (Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекций // Иммунология. - 2000. - Т.1. - с.61-64), а при выраженных аллергических реакциях, сопровождающихся нарушением прайминга Т-хелперов в сторону Т-хелперов 2 типа, в крови увеличивается концентрация интерлейкина-4 (Ярилин, А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.), также неоднократно показана связь между выраженностью инфекционного процесса и активизацией провоспалительных цитокинов (Учайкин В.Ф. Рецидивирующие респираторные инфекции у детей: применение иммуномодуляторов для лечения и профилактики // Педиатрия. - 2009. - №1. - Т.87. - с.127-131). Эти данные послужили отправной точкой для нового способа диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возраста.

Проведено обследование 91 ребенка от 3 до 6 лет с рецидивирующими (более 6 раз за год - критерий частой респираторной заболеваемости по Альбицкому В.Ю., Баранову, А.А. В кн.: Часто болеющие дети. Клинико-социальные аспекты. Пути оздоровления. Саратов, 1986. - 298 с.) ринофарингитами и аденоидитами (основная группа). Диагноз ринофарингит и аденоидит был выставлен при осмотре оториноларингологом. Также обследовано 109 условно здоровых детей соответствующего возраста, с половой дискретностью в выборке соответствующей общепопуляционной.

Концентрацию интерлейкина-1-бэта, рецепторного антагониста интерлейкина-1, интерлейкина-4, фактора некроза опухоли альфа и интерферона альфа в назальном секрете исследовали методом иммуноферментного анализа на коммерческих наборах ООО «Цитокин» г. Санкт-Петербурга согласно прилагаемым инструкциям в основной группе и в группе сравнения. Назальный секрет получали методом промывания носоглотки через носовые ходы 3 мл физиологического раствора. В литературе неоднократно вставал вопрос о трактовке концентраций того или иного аналита в секретах. Один из предлагаемых способов выравнивания концентраций связан с пересчетом количества анализируемого вещества на грамм белка, содержащегося в исследуемом секрете. Учитывая возможность различного разведения назального секрета, провели исследования в каждой пробе общего белка колориметрическим методом с использованием красителя пирогаллолового красного. Получили концентрацию общего белка 0,5 г/л в каждой пробе, величина была постоянная. Исходя из того, что соответствующий коэффициент пересчета концентраций цитокинов на грамм белка также получался постоянным, отказались от данного способа выравнивания и в дальнейшем концентрацию цитокинов, полученную в ИФА, анализировали в пг/мл.

На выборке условно здоровых детей (n=109) были определены нормы интерлейкинов назального секрета (среднее значение ±1,5 стандартного отклонения). Данные представлены в таблице 1.

В группе детей с рецидивирующими острыми ринофарингитами и аденоидитами и концентрацией в назальном секрете: альфа-интерферона, интерлейкина-1-бэта, фактора некроза опухоли-альфа, превышающей в 2 и более раза нормативные значения, частота выявлений герпетических вирусов и хламидии пневмонии была достоверно выше, чем в группе условно здоровых детей (таблица 2).

У детей с высокой концентрацией альфа-интерферона, интрелейкина-1-бэта и фактора некроза опухоли-альфа частота встречаемости экспрессии вирусов Эпштейна-Барра, простого герпеса I/II и цитомегаловируса была 64,7% 64,7% и 82,3% соответственно, в то время как среди условно здоровых детей частота выявления экспрессии этих вирусов не превышала 2%. Для данных вирусов был показан высокий уровень отношения шансов - OR (CI 95%): для вирусов Эпштейна-Барра и простого герпеса I/II типов OR был равен 98,1, а для цитомегаловируса - 10168,7. В целом для герпетических вирусов без их идентификации OR был равен 866,25. Учитывая, что при данном соотношении интерлейкинов назального секрета в 100% случаев выявляется тот или иной герпетический вирус, предлагаем данный способ для диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов у детей раннего возраста.

В группе детей с рецидивирующими острыми ринофарингитами и аденоидитами и концентрацией в назальном секрете: интерлейкина-4 более 48 нг/мл и рецепторного антагониста интерлейкина-1 более 1000 нг/мл - частота выявлений маркеров атопической сенсибилизации к представителям условно патогенной микробиоты носоглоточного биотопа была достоверно выше, чем в группе условно здоровых детей (таблица 3).

У детей с высокой концентрацией в назальном секрете интерлейкина-4 и рецепторного антагониста интерлейкина-1 частота встречаемости детей с высоким уровнем антител класса Е к Str. pyogenes, к Str. pneumoniae, к Str. mutans, к S. aureus, к H. influenzae была 76,5%, 29,4%, 47,1%, 23,5%, 17,7% соответственно. В группе условно здоровых детей частота детей с такими видами атопической сенсибилизации не превышала (для всех видов) 0,05%.

Наличие той или иной инфекционной атопической сенсибилизации без учета специфики определялось у 76,5% детей с рецидивирующими острыми ринофарингитами, аденоидитами и с одновременным повышением интерлейкина-4 в назальном секрете, а локальная эозинофилия (более 3% эозинофилов в мазке отпечатке) - у 99,9% таких детей; в то время в группе условно здоровых детей эти маркеры были представлены лишь 0,05% обследованных. Получены высокие уровни отношения шансов (OR) для вышеперечисленных маркеров инфекционной атопической сенсибилизации (таблица 3). Ввиду того, что данные аллергические маркеры практически не встречались в группе условно здоровых детей и выявлялись более чем у 70% детей с рецидивирующими острыми ринофарингитами, аденоидитами с одновременным повышением интерлейкина-4 и рецепторного антагониста интерлейкина-1, можно считать данный способ определения интерлейкинов новым методом диагностики инфекционно-аллергической этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего возраста.

Тем самым в предпочтительном варианте выполнения способа технически не сложная процедура забора назального секрета для исследования, не затратный по времени метод, не требующий дополнительных контрольных серий исследования.

В другом предпочтительном варианте проводится патогенетически обоснованное исследование локальной секреции набора провоспалительных и проаллергических интерлейкинов, обеспечивающих иммунорегуляторный потенциал мукозальной иммунной системы носа и глотки.

В следующем предпочтительном варианте метод исследования оказывается скрининговым, но достаточно специфичным для диагностики этиологии рецидивирующего острого ринофарингита и аденоидита у детей раннего возраста.

Пример 1. Ребенок X., 5 лет (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №4-26-93) обратился к врачу иммунологу-аллергологу с жалобами на частую острую респираторную заболеваемость более 10 раз в год. При осмотре глотки выявлены признаки острого ринофарингита (рис. 1).

Исследование интерлейкинов назального секрета выявило повышение уровней: интерферона-альфа до 36,2 пг/мл; интерлейкина-1-бэта - 144,2 пг/мл и фактора некроза опухоли альфа - 13,34 пг/мл, что более чем в 2 раза превышало нормальные значения данных аналитов.

Исследование мазка из зева методом ПЦР на вирусы Эпштейна-Барра, и цитомегаловирус показало экспрессию вируса Эпштейна-Барра (рис. 2).

На основании полученных результатов выявили, что этиология данного рецидивирующего ринофарингита связана с вирусом Эпштейна-Барра. После проведенной терапии изопринозином (2 курса) частота рецидивирования ринофарингита снизилась до 4 раз в год.

Пример 2. Ребенок З., 4 лет (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №4-26-983) обратился к врачу иммунологу-аллергологу с жалобами на частую острую респираторную заболеваемость более 8 раз в год и ощущение затекания слизи в глотку. При осмотре глотки выявлены признаки острого ринофарингита и аденоидита по признаку задней ринореи (рис. 3).

Исследование интерлейкинов назального секрета выявило повышения уровней: интерлейкина-4 до 40,06 пг/мл; а рецепторного антагониста интерлейкина-1 1083,2 пг/мл, что указывало на активацию антиген-презентирующих клеток и Т-хелперов 2 типа. Данный тип регуляции иммунных реакций развивается при аллергическом воспалении.

Исследование крови на уровень антител класса Е к антигенам представителей условно патогенной микробиоты носоглоточного биотопа, а также мазков-отпечатков, взятых со слизистой носа, показало наличие среднего уровня аллергии к Str. pyogenes, Str. mutans, а также к стафилококку и грам (-) бактериям (рис. 4).

Эти данные указывали на этиологическую роль инфекционной аллергии к стрептококкам, стафилококкам и грам (-) бактериям в формировании рецидивирующего ринофарингита и аденоидита у ребенка раннего возраста, риск формирования иммунной формы невынашивания беременности. Применение локальной специфической фаговой терапии, а также назальных топических стероидных препаратов привело к купированию рецидивов острого ринофарингита и аденоидита. За последующие после лечения полгода ребенок перенес всего один раз острый ринофарингит.

Сущность отличий изобретения заключается в следующем. В способе определения в назальном секрете уровней определенного набора провоспалительных и проаллергических цитокинов: интерлейкина-1-бэта, интерлейкина-4, рецепторного антагониста интерлейкина-1, интерферона-альфа, фактора некроза опухоли - альфа - у детей раннего и дошкольного возраста с постоянно рецидивирующими острыми ринофарингитами и аденоидитами, увеличении концентрации в назальном секрете: интерферона-альфа, фактора некроза опухоли - альфа и интерлейкина-1-бэта более чем в 2 раза по отношению к нормальным значениям указывает на вирусную этиологию (вирус Эпштейна-Бара, цитомегаловирус и др.) рецидивирующих ринофарингитов и аденоидитов. При повышении в назальном секрете: интерлейкина-4 свыше 26 нг/мл и рецепторного антагониста интерлейкина-1 свыше 1000 нг/мл - диагностируется инфекционно-аллергический процесс, обусловленный представителями условно патогенной микрофлоры глоточного биотопа.

Апробация способа проведена на базе ЗАО «Современные медицинские технологии» на 91 ребенке раннего и дошкольного возраста (3-6 лет), страдающем рецидивирующим острым ринофарингитом и аденоидитом. У 34 пациентов выявлены специфические изменения интерлейкинов назального секрета. Углубленное обследование подтвердило наличие вирусной и инфекционно-аллергической этиологии - соответственно - рецидивирующих ринофарингитов и аденоидитов, а проведенное лечение позволило существенно уменьшить число рецидивов за год.

Таблица 1 Нормы провоспалительных и проаллергических интерлейкинов в назальном секрете у детей раннего и дошкольного возраста   Нижняя Верхняя Альфа ФНО, пг/мл 0 5 ИЛ-1Ра, пг/мл 0 1000 ИЛ-1-бэта, пг/мл 4,5 53,5 ИЛ-4, пг/мл 0 24,5 Альфа ИНФ, пг/мл 0 13,5

Таблица 2 Сравнение частоты встречаемости детей с экспрессией герпетических вирусов и хламидий пневмонии в группе детей с концентрацией альфа-интерферона более 20 нг/мл, интерлейкина-1-бэта более 100 нг/мл фактора некроза опухоли - альфа более 10 нг/мл и в группе условно здоровых детей Вирусы Условно здоровые дети, n=109 Дети основной группы с высокой концентраций альфа-интерферона, n=17 OR (CI 95%) Вирус Эпштейна-Барра 2 (1,83%) 11 (64,71%) 98,08333 Хламидия пневмония/пситации 3 1,83%) 5 (29,41%) 22,29167 Вирус простого герпеса I/II 4 (1,83%) 11 (64,71%) 98,08333 Цитомегаловирус 0,05 (0,05%) 14 (82,35%) 10168,67 Наличие вируса 4 (3,67%) 16,5 (99,91%) 866,25

Таблица 3 Сравнение частоты встречаемости детей с атопической сенсибилизацией к представителям условно патогенной микробиоты носоглоточного биотопа в группе детей с концентрацией интерлейкина-4 более 48 нг/мл, рецепторного антагониста интерлейкина-1 более 1000 нг/мл и в группе условно здоровых детей Показатели атопии Условно здоровые дети, n=109 Дети основной группы с высокой концентраций интерлейкина-4, n=17 OR (CI 95%) Антитела класса Е, Str. pyogenes 0,05 (0,05%) 13 (76,47%) 7081,75 Антитела класса Е, Str. pneumoniae 0,05 (0,05%) 5 (29,41%) 907,9167 Антитела класса Е, Str. mutans 0,05 (0,05%) 8 (47,06%) 1936,889 Антитела класса Е, S. aureus 0,05 (0,05%) 4 (23,53%) 670,4615 Антитела класса Е, Н. influenzae 0,05 (0,05%) 3 (17,65%) 466,9286 Наличие атопической сенсибилизации 0,05 (0,05%) 13 (76,47%) 7081,75 Эозинофилы назального секрета более 3% 0,05 (0,05%) 16,5 (99,91%) 71907

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возраста, включающий определение в назальном секрете провоспалительных и проаллергических интерлейкинов, а именно интерлейкина-1-бэта (IL-1beta), интерлейкина-4 (IL-4), рецепторного антагониста интерлейкина-1 (IL-1RA), интерферона-альфа (INF-alpha) и фактора некроза опухоли - альфа (TNF-alpha), отличающийся тем, что увеличение содержания INF-alpha, TNF-alpha и IL-1beta более чем в 2 раза по отношению к нормальным значениям является диагностическим критерием вирусной этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов, а увеличение содержания IL-4 выше 26 нг/мл и IL-1RA выше 1000 нг/мл является диагностическим критерием для инфекционно-аллергической этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов. Осуществление изобретения обеспечивает повышение эффективности диагностики. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возраста, включающий определение в назальном секрете провоспалительных и проаллергических интерлейкинов, а именно интерлейкина-1-бэта (IL-1beta), интерлейкина-4 (IL-4), рецепторного антагониста интерлейкина-1 (IL-1RA), интерферона-альфа (INF-alpha) и фактора некроза опухоли - альфа (TNF-alpha), отличающийся тем, что увеличение содержания INF-alpha, TNF-alpha и IL-1beta более чем в 2 раза по отношению к нормальным значениям является диагностическим критерием вирусной этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов, а увеличение содержания IL-4 выше 26 нг/мл и IL-1RA выше 1000 нг/мл является диагностическим критерием для инфекционно-аллергической этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание INF-alpha, TNF-alpha, IL-1beta, IL-4 и IL-1RA определяют методом иммуноферментного анализа, проводится патогенетически обоснованное исследование локальной секреции указанных INF-alpha, TNF-alpha, IL-1beta, IL-4 и IL-1RA, и данный метод является скрининговым, но достаточно специфичным для диагностики этиологии рецидивирующего острого ринофарингита и аденоидита у детей раннего и дошкольного возраста.