ГЕН СИНТЕЗА КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ГРИБКОВ Российский патент 2006 года по МПК C12N15/09 C07K14/37 C07K16/14 A61K39/395 

Область техники

Данное изобретение относится к ДНК, кодирующим белки, принимающие участие в синтезе клеточной стенки грибков, к белкам, кодируемым ДНК, способам определения того, влияет ли определенное соединение или не влияет на процесс транспорта, который заключается в транспорте GPI-заякоренных белков к клеточной стенке, и к противогрибковым средствам, влияющим на процесс транспорта, который заключается в транспорте GPI-заякоренных белков к клеточной стенке.

Область предпосылки

В последние годы умение справляться с инфекциями, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, приобретает даже большее значение, чем когда-либо, связано с увеличением количества пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом в результате современных способов химиотерапии и т.д. Глубокий микоз, обусловленный Candida, Aspergillus, Cryptococcus и подобными возбудителями, является причиной части указанных инфекций, и его доля с каждым годом увеличивается. Тот факт, что одна за другой появляются инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, такими как многие авирулентные бактерии, свидетельствует о том, что проблема инфекционных заболеваний не будет решена до тех пор, пока существуют основные заболевания, ослабляющие иммунные функции пациентов. Несмотря на то, что новые стратегии контроля инфекционных заболеваний, включая проблему резистентных бактерий, будут одной из ключевых проблем у быстро стареющего общества, в настоящее время существует очень мало эффективных терапевтических средств.

До настоящего времени терапевтические средства против грибковых инфекций главным образом разрабатывали на основе стратегии создания новых соединений путем химической модификации известной структуры. Однако вследствие таких проблем, как появление резистентных бактерий, существует насущная необходимость в разработке новых лекарственных средств на основе новых механизмов.

Принимая во внимание указанные обстоятельства, авторы изобретения сосредоточились на новом подходе в области противогрибковых средств, в которой еще нет достаточного разнообразия терапевтических средств. А именно, авторы данного изобретения сосредоточили внимание на влиянии предотвращения проявления патогенности патогенами на начало, развитие и персистенцию инфекций. Авторы изобретения полагали, что наиболее эффективным способом, чтобы избежать возникновения и развития инфекции, было бы ингибирование адгезии на хозяине, которая является первой стадией в возникновени инфекции и последующем развитии колонизации. Кроме того, также был осуществлен новый беспрецедентный способ, а именно ингибирование экспрессии факторов адгезии самими факторами.

Для того чтобы ингибировать экспрессию факторов адгезии, авторы данного изобретения обратили свое внимание на гипотезу о том, что гликопротеиды клеточной стенки, такие как факторы адгезии, сначала заякориваются GPI (гликозилфосфатидилинозитолом) на клеточной мембране, а затем транспортируются к клеточной стенке (фиг. 1). К настоящему времени обнаружено, что 30 или более гликопротеидов клеточной стенки, включая адгезионные лиганды, транспортируются посредством GPI-заякоривания (называемые GPI-заякоренными белками). Поэтому предположили, что если ингибировать указанную стадию транспорта, то вполне вероятно можно ингибировать экспрессию в клеточной стенке факторов адгезии и основных белков, составляющих клеточную стенку (Hamada K et al, Mol. Gen. Genet., 258: 53-59, 1998). Сообщалось, что GPI-заякоренные белки присутствуют у Candida, который является патогенным грибком (Kapteyn JC et al, Eur. J. Cell Biol., 65: 402-407, 1994).

Авторы изобретения начали свое исследование, полагая, что новые противогрибковые средства, которые ингибируют синтез клеточной стенки, можно получить путем ингибирования процесса, при котором GPI-заякоренные белки, существующие в клеточной мембране грибка, транспортируются к клеточной стенке.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является разработка противогрибковых средств, оказывающих воздействие, направленное против начала, развития и персистенции инфекций, путем ингибирования экспрессии гликопротеидов клеточной стенки, ингибирования сборки клеточной стенки, а также адгезии на клетках и предотвращения проявления патогенами патогенности.

Чтобы провести скрининг соединений, которые ингибируют процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, авторы данного изобретения получили репортерную систему, в которой используется слитый белок, содержащий репортерный фермент и сигнал транспорта, существующий на С-конце одного из GPI-заякоренных белков, CWP2 (Van Der Vaat JM et al, J. Bacteriol., 177:3104-3110,1995).

Когда сконструировали ДНК, содержащую ген сигнала секреции + ген репортерного фермента + ген C-конца CWP2 (присутствует или отсутствует), и экспрессировали слитый белок в Saccharomyces cerevisiae (в дальнейшем называемый S. cerevisiae), было показано, что активность репортерного фермента выявляется в клеточной стенке в том случае, когда присутствует С-конец CWP2, и в супернатанте культуры в том случае, когда С-конец CWP2 отсутствует. Таким образом, было сделано предположение, что если процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, будет ингибирован тестируемым образцом, активность репортерного фермента в клеточной стенке будет уменьшаться или активность репортерного фермента будет выявляться в супернатанте культуры. Таким образом, был начат скрининг соединений, которые ингибируют процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, с использованием указанной репортерной системы.

На основании скрининга с использованием указанной репортерной системы обнаружили несколько соединений, которые ингибируют процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке. Типичным примером является соединение формулы (Ia)

Соединение вышеуказанной формулы (Ia) (в дальнейшем сокращенно называемое "соединение (Ia)") ингибирует рост S. cerevisiae и Candida albicans (в дальнейшем называемого C. albicans), и C. albicans, культивируемый в присутствии вышеуказанного соединения (Ia), проявляет слабую способность к адгезии на клетках. Таким образом, подтвердили, что вышеуказанное соединение (Ia) подходит для достижения исходной цели изобретения, которая заключалась в том, чтобы найти соединение, ингибирующее адгезию грибков вследствие супрессии экспрессии адгезинов грибка на основе ингибирования транспортной системы GPI-заякоренных белков к клеточной стенке. Кроме того, наблюдения с использованием трансмиссионного электронного микроскопа подтвердили, что C. albicans, культивируемый в присутствии вышеуказанного соединения (Ia), имеет нарушения в синтезе своей клеточной стенки.

Используя вышеуказанное соединение (Ia), авторы данного изобретения доказали, что можно получить противогрибковые средства, основанные на механизме, который ингибирует процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

Кроме того, чтобы установить белок-мишень, на который действует вышеуказанное соединение (Ia), авторы данного изобретения провели поиск генов, которые придают резистентность вышеуказанному соединению (Ia).

Плазмидную библиотеку генов S. cerevisiae вводили в S. cerevisiae и на основании сверхэкспрессии собирали плазмиды, которые проявляли резистентность к вышеуказанному соединению (Ia). Затем резистентный ген клонировали, определяли нуклеотидную последовательность и ген назвали GWT1 (SEQ ID NO: 1). В S. cerevisiae, сверхэкспрессирующих продукт гена GWT1, вышеуказанный репортерный фермент, который имеет С-конец GPI-заякоренного белка, транспортировался к клеточной стенке даже в присутствии вышеуказанного соединения (Ia). Кроме того, наблюдения под трансмиссионным электронным микроскопом подтвердили, что клеточная стенка нормальна даже в присутствии вышеуказанного соединения (Ia).

Более того, в том случае, когда в геномную ДНК S. cerevisiae случайным образом вводили точечные мутации и выделяли мутантные штаммы R1 и R5, проявляющие специфичную резистентность к вышеуказанному соединению (Ia), обнаружили точечные мутации, заключающиеся в изменениях 405-го кодона гена GWT1 GTC в ATC в мутантном штамме R1 и 140-го кодона GGG в AGG в мутантном штамме R5. Так как резистентность к вышеуказанному соединению (Ia) выявлялась в том случае, когда указанные мутантные гены GWT1 вводили в штамм с нарушенным геном GWT1, обнаружено, что резистентность к данному соединению объясняется только геном GWT1. Следовательно, это подтверждает, что вышеуказанное соединение (Ia) действует непосредственно на продукт гена GWT1, ингибируя функцию белка GWT1.

Подобными способами клонировали резистентные гены C. albicans (SEQ ID NO: 3 и 5), определяли нуклеотидные последовательности и назвали гены CaGWT1.

Кроме того, поиск гомологии в базе данных с использованием GWT1 выявил гомолог (SEQ ID NO: 27) Schizosaccharomyces pombe (называемого в дальнейшем S. pombe). Кроме того, ПЦР с праймерами, основанными на последовательности высоко консервативной области белков, кодируемых генами GWT1 S. cerevisiae, S. pombe и С.albicans, дала гомологи (SEQ ID NO: 39 и 41) Aspergillus fumigatus (в дальнейшем называемого А. fumigatus). Кроме того, выполнение ПЦР, основанной на последовательности, обнаруженной в результате поиска гомологии с GWT1 в базе данных, выявило гомологи (SEQ ID NO: 54 и 58) Cryptococcus neoformans (в дальнейшем называемого С. neoformans).

Более конкретно, данное изобретение относится к следующим объектам:

1) ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью в придании грибку резистентности к соединению, указанному в формуле (Ia), в том случае, когда ДНК сверхэкспрессируется в грибке, где ДНК выбрана из группы, состоящей из следующего:

(a) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(c) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(d) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59, в которой одна или более аминокислот присоединены, делетированы, замещены и/или встроены,

(e) ДНК, которая амплифицирована с использованием в качестве праймеров SEQ ID NO: 29 и 31 или SEQ ID NO: 29 и 30

2) ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью в снижении количества GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка вследствие дефекта в функции ДНК, где ДНК выбрана из группы, состоящей из

(a) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(c) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(d) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59, в которой одна или более аминокислот присоединены, делетированы, замещены и/или встроены, и

(e) ДНК, которая амплифицирована с использованием в качестве праймеров SEQ ID NO: 29 и 31 или SEQ ID NO: 29 и 30,

и где «жесткие условия» относятся, например, к гибридизации в 4 × SSC при 65°С с последующей промывкой в 0,1 × SSC в течение 1 часа при 65°С; или в другом способе «жесткие условия» представляют собой 4 × SSC при 42°С в 50% формамиде; или гибридизацию в растворе PerfectHyb™ (TOYOBO) в течение 2,5 часов при 65°С с последующей промывкой в (i) растворе 2 × SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 5 минут, (ii) растворе 2 × SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 15 минут и (iii) растворе 0,1 × SSC, 0,1% SDS при 50°С в течение 20 минут;

«дефект функции ДНК» может возникать в том случае, когда функциональный генный продукт ДНК не экспрессируется, или в том случае, когда экспрессия снижена, например, в результате встраивания ДНК, которая не соответствует кодирующему району ДНК, например, селектируемого маркера, с использованием технологии гомологичной рекомбинации;

и уменьшение количества белка, получаемого из GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка, определяют с использованием любого из следующих способов отдельно или в комбинации: (i) репортерной системы, отражающей процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, (ii) ELISA, в котором оценивается количество GPI-заякоренного белка в клеточной стенке, (iii) измерения активности GPI-заякоренного белка, такой как адгезия на клетках животных, или (iv) наблюдения гифовой, фибриллярной структуры самого наружного слоя клетки грибка с использованием трансмиссионного электронного микроскопа;

3) белку, кодируемому указанной выше, в пунктах 1 или 2, ДНК;

4) вектору для трансформации клетки, в который встроена ДНК, указанная выше, в пунктах 1 или 2;

5) ДНК, указанной выше, в пунктах 1 или 2, используемой для включения в трансформант;

6) вектору, указанному в пункте 4, используемому для включения в трансформант;

7) способу получения белка, указанного в пункте 3, который включает в себя стадии культивирования указанного выше трансформанта и сбора экспрессированного белка из трансформанта или из супернатанта его культуры;

8) антителу, которое связывается с указанным выше в пункте 3 белком;

9) противогрибковому средству, содержащему в качестве активного ингредиента антитело, указанное выше в пункте 8.

Помимо указанного, в настоящей заявке описаны следующие объекты, относящиеся к данному изобретению.

- Противогрибковое средство, содержащее в качестве активного ингредиента соединение, представленное общей формулой (I), его соль или его гидрат, где в формуле (I)

[R^1a и R^2a идентичны или отличаются друг от друга, и каждый в отдельности обозначает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, замещенную или незамещенную C_1-6алкоксигруппу или группу, представленную формулой

(где X¹ обозначает прямую связь, карбонильную группу или группу, представленную формулой -S(O)₂-;

R^5а и R^6a идентичны или отличаются друг от друга и обозначают атом водорода или замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу). Кроме того, R^1а и R^2а вместе могут образовывать конденсированное кольцо, выбранное из группы, состоящей из замещенного или незамещенного бензольного кольца, замещенного или незамещенного пиридинового кольца, замещенного или незамещенного пиррольного кольца, замещенного или незамещенного кольца тиофена, замещенного или незамещенного фуранового кольца, замещенного или незамещенного кольца пиридазина, замещенного или незамещенного кольца пиримидина, замещенного или незамещенного кольца пиразина, замещенного или незамещенного имидазольного кольца, замещенного или незамещенного оксазольного кольца, замещенного или незамещенного тиазольного кольца, замещенного или незамещенного пиразольного кольца, замещенного или незамещенного изоксазольного кольца, замещенного или незамещенного изотиазольного кольца, замещенного или незамещенного кольца циклогексана и замещенного или незамещенного кольца циклопентана;

R^3a и R^4a идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности означает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, карбоксильную группу, формильную группу, гидроксииминогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, C_1-6алкильную группу, C_1-6алкоксигруппу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, группу, представленную формулой -C(O)NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности обозначает атом водорода или C_1-6алкильную группу), формулой -CO₂R^7a (где R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S(O)_nR^7a (где n обозначает целое число 0-2 и R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S(О)₂NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b имеют такое же значение, как указано выше), группу формулы

(где X² означает прямую связь, карбонильную группу или группу формулы -S(О)₂-;

R^5b и R^6b идентичны или отличаются друг от друга и означают атом водорода, замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу или замещенную или незамещенную С_6-14арильную группу), или группу формулы

-Z¹-Z²

(где Z¹ означает прямую связь, атом кислорода, виниленовую или этиниленовую группу;

Z² означает прямую связь или C_1-6алкильную группу, замещенную или незамещенную 0-4 заместителями). R^3a и R^4a вместе могут обозначать метилендиоксигруппу или 1,2-этилендиоксигруппу, альтернативно R^3a и R^4a вместе могут означать образование конденсированного кольца, выбранного из группы, состоящей из замещенного или незамещенного бензольного кольца, замещенного или незамещенного пиридинового кольца, замещенного или незамещенного пиррольного кольца, замещенного или незамещенного кольца тиофена, замещенного или незамещенного фуранового кольца, замещенного или незамещенного кольца пиридазина, замещенного или незамещенного кольца пиримидина, замещенного или незамещенного кольца пиразина, замещенного или незамещенного имидазольного кольца, замещенного или незамещенного оксазольного кольца, замещенного или незамещенного тиазольного кольца, замещенного или незамещенного пиразольного кольца, замещенного или незамещенного изоксазольного кольца, замещенного или незамещенного изотиазольного кольца, замещенного или незамещенного кольца циклогексана и замещенного или незамещенного кольца циклопентана, за исключением случаев, когда оба R^1a и R^2a обозначают атомы водорода].

- Указанное выше противогрибковое средство, содержащее в качестве активного ингредиента соединение (Ia) формулы

- Соединение, представленное общей формулой (II), его соль или гидрат, где в формуле (II)

[Ar означает заместитель, выбранный из группы, состоящей из формул (IIIa)-(IIIf)

(где К означает атом серы, атом кислорода или группу, представленную формулой -NH-;

R^1b и R^2b идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности означает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, группу, представленную формулой

(где X³ означает прямую связь, карбонильную группу или группу, представленную формулой -S(O)₂-;

R^5c и R^6c идентичны или отличаются друг от друга и означают атом водорода или замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу), или группу, представленную формулой -X⁴-R^8a (где X⁴ означает прямую связь, атом кислорода или атом серы; R^8a означает C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, C_3-8циклоалкильную группу или C_3-8циклоалкенильную группу). Альтернативно, R^1b и R^2b вместе могут образовывать метилендиоксигруппу или 1,2-этилендиоксигруппу);

R^3b и R^4b идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности означает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, карбоксильную группу, формильную группу, гидроксииминогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, C_1-6алкильную группу, C_1-6алкоксигруппу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу или группу, представленную формулой

-z^1b-z^2b

(где Z^1b означает прямую связь, виниленовую группу или этиниленовую группу;

Z^2b означает прямую связь или C_1-6алкильную группу, замещенную или незамещенную 0-4 заместителями);

за исключением случаев, когда (1) Ar означает указанную выше формулу (IIId), где R^1b и R^2b оба являются атомами водорода, (2) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, метоксигруппой, гидроксильной группой, метильной группой, бензилоксигруппой или атомом галогена, и Ar означает вышеуказанную формулу (IIIc), где оба R^1b и R^2b означают атомы водорода или метоксигруппы, (3) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, гидроксильной группой, метоксигруппой или бензилоксигруппой, и Ar означает вышеуказанную формулу (IIIc), где оба R^1b и R^2b означают гидроксильные группы или бензилоксигруппы, или (4) Ar означает вышеуказанную формулу (IIId), где R^1b является атомом водорода, a R^2b является формильной группой, гидроксиметильной группой или метоксикарбонильной группой].

- Указанное выше соединение или его соль или гидрат, где Ar имеет формулу

(где R^1c означает атом водорода, замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу или бензильную группу), и за исключением случая, когда R^3b означает атом водорода.

- Соединение, представленное общей формулой (IIIc2), или его соль или гидрат, где в формуле (IIIc2)

[R^1b и R^2b имеют такое же значение, как указано выше, за исключением случаев, когда (1) R^1b означает группу, представленную формулой R^1c-O- (где R^1c имеет такое же значение, как указано выше), R^2b является атомом водорода и R^3b означает атом водорода, (2) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, метоксигруппой, гидроксильной группой, метильной группой, бензилоксигруппой или атомом галогена, и оба R^1b и R^2b означают атомы водорода или метоксигруппы, или (3) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, гидроксильной группой, метоксигруппой или бензилоксигруппой, и оба R^1b и R^2b означают гидроксильные группы или бензилоксигруппы].

- Противогрибковое средство, где по меньшей мере один из R^3a и R^4a означает группу, представленную формулой -C(O)NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b имеют такое же значение, как указано выше), формулой -CO₂R^7a (где R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S(O)_nR^7a (где n означает целое число 0-2 и R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S (O)₂NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b имеют такое же значение, как указано выше), формулой

(где X², R^5b и R^6b имеют такие же значения, как определено выше), или C_1-6алкоксигруппу, замещенную или незамещенную 0-4 заместителями, или R^3a и R^4a вместе означают метилендиоксигруппу или 1,2-этилендиоксигруппу.

- Указанное выше противогрибковое средство, где соединение, обладающее противогрибковым действием, представляет собой

(1) 1-бензилизохинолин,

(2) 1-(4-бромбензил)изохинолин,

(3) 1-(4-хлорбензил)изохинолин,

(4) 1-(4-фторбензил)изохинолин,

(5) 1-(4-иодбензил)изохинолин,

(6) 1-(3-метилбензил)изохинолин,

(7) 1-(4-метилбензил)изохинолин,

(8) 1-(3,4-диметилбензил)изохинолин,

(9) 1-(3-метоксибензил)изохинолин,

(10) 1-(4-метоксибензил)изохинолин,

(11) 1-(3,4-метилендиоксибензил)изохинолин,

(12) 1-(4-бензилоксибензил)изохинолин,

(13) 1-(4-цианобензил)изохинолин,

(14) 1-(4-нитробензил)изохинолин,

(15) 1-(4-аминобензил)изохинолин,

(16) 1-(4-метоксибензил)-6,7-дихлоризохинолин,

(17) 1-(4-метокси-2-нитробензил)изохинолин,

(18) 1-(4-метоксибензил)-6,7-метилендиоксиизохинолин,

(19) 1-(2-амино-4-метоксибензил)изохинолин,

(20) 1-(4-метоксибензил)-7-гидрокси-6-метоксиизохинолин,

(21) 1-(4-бензилоксибензил)-6,7-диметоксиизохинолин,

(22) 1-(4-метоксибензил)-6,7-диметоксиизохинолин,

(23) 1-(4-метокси-2-нитробензил)изохинолин,

(24) 3-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]пропилцианид,

(25) 1-[4-(2,2,3,3-тетрафторпропокси)бензил]изохинолин,

(26) 1-[4-(2-пиперидиноэтокси)бензил]изохинолин,

(27) 4-(1-изохинолилметил)фенил(2-морфолиноэтиловый)эфир,

(28) 1-[4-(2-метоксиэтокси)бензил]изохинолин,

(29) N-{2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]этил}-N,N-диметиламин,

(30) 1-[4-(фенетилокси)бензил]изохинолин,

(31) 1-{4-[(2-метилаллил)окси]бензил}изохинолин,

(32) 1-(4-изобутоксибензил)изохинолин,

(33) 1-[4-(2-феноксиэтокси)бензил]изохинолин,

(34) метил-2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]ацетат,

(35) 2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]-1-этанол,

(36) трет-бутил-N-{2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]этил}карбамат,

(37) 1-{4-[3-(тетрагидро-2Н-2-пиранилокси)пропокси]бензил}изохинолин,

(38) 2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]-1-этанамин,

(39) 1-[4-(3-пиперидинопропокси)бензил]изохинолин,

(40) 3-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]-1-пропанол,

(41) 1-[4-(2-этилбутокси)бензил]изохинолин,

(42) 4-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]бутановая кислота,

(43) 1-(4-{3-[(4-бензилпиперазино)сульфонил]пропокси}бензил)изохинолин,

(44) 1-(4-{3-[4-(4-хлорфенил)пиперазино]пропокси}бензил)изохинолин,

(45) 4-(1-изохинолилметил)анилин,

(46) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]бутанамид,

(47) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]пропанамид,

(48) N- [4-(1-изохинолилметил)фенил]-1-этансульфонамид,

(49) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-метилэтансульфонамид,

(50) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-метиламин,

(51) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-пропиламин или

(52) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-метил-N-пропиламин;

- Способ лечения грибковой инфекции, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективной дозы указанных выше противогрибковых средств.

Далее данное изобретение будет описано подробно посредством объяснения значения терминов, символов и тому подобного, приведенных в данном описании.

В данном описании для удобства структурная формула соединений может представлять определенный изомер, однако данное изобретение включает все геометрические изомеры, оптические изомеры, основанные на асимметричном атоме углерода, стереоизомеры и таутомеры, которые возникают, исходя из структуры соединений, и смеси изомеров, и это не следует толковать как ограничение представлением в виде формулы, сделанным для удобства, и это может быть любое одно соединение или смесь изомеров. Следовательно, может существовать оптически активное вещество и рацемическое вещество, имеющее асимметричный атом углерода, но в данном изобретении нет конкретных ограничений и может быть включено любое из них. Кроме того, может существовать полиморфизм кристаллов, но ограничений также нет, и кристаллическая форма может быть любой одной формой или может быть смесью и может быть либо в виде ангидрида, либо гидрата.

Кроме того, соединения согласно данному изобретению включают соединения, проявляющие противогрибковое действие после того, как они подвергаются метаболизму, а именно после окисления, восстановления, гидролиза или ковалентного связывания in vivo. Кроме того, данное изобретение включает соединения, которые определяют выход соединения согласно данному изобретению после того, как подвергаются метаболизму, а именно после окисления, восстановления и гидролиза in vivo.

"C_1-6алкильная группа" в данном описании означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 1 до 6, и конкретные примеры включают метильную группу, этильную группу, н-пропильную группу, изопропильную группу, н-бутильную группу, изобутильную группу, трет-бутильную группу, н-пентильную группу, изопентильную группу, неопентильную группу, н-гексильную группу, 1-метилпропильную группу, 1,2-диметилпропильную группу, 2-этилпропильную группу, 1-метил-2-этилпропильную группу, 1-этил-2-метилпропильную группу, 1,1,2-триметилпропильную группу, 1-метилбутильную группу, 2-метилбутильную группу, 1,1-диметилбутильную группу, 2,2-диметилбутильную группу, 2-этилбутильную группу, 1,3-диметилбутильную группу, 2-метилпентильную группу, 3-метилпентильную группу и так далее.

"C_2-6алкенильная группа" в данном описании означает алкенильную группу с прямой или разветвленной цепью, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 2 до 6, и конкретные примеры включают винильную группу, аллильную группу, 1-пропенильную группу, изопропенильную группу, 1-бутен-1-ильную группу, 1-бутен-2-ильную группу, 1-бутен-3-ильную группу, 2-бутен-1-ильную группу, 2-бутен-2-ильную группу и так далее.

"C_2-6алкинильная группа" в данном описании означает алкинильную группу с прямой или разветвленной цепью, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 2 до 6, и конкретные примеры включают этинильную группу, 1-пропинильную группу, 2-пропинильную группу, бутинильную группу, пентинильную группу, гексинильную группу и так далее.

"C_1-6алкоксигруппа" в данном описании означает оксигруппу, с которой связана "C_1-6алкильная группа", определенная выше, и конкретные примеры включают метоксигруппу, этоксигруппу, н-пропоксигруппу, изопропоксигруппу, н-бутоксигруппу, изобутоксигруппу, втор-бутоксигруппу, трет-бутоксигруппу, н-пентилоксигруппу, изопентилоксигруппу, втор-пентилоксигруппу, трет-пентилоксигруппу, неопентилоксигруппу, 1-метилбутоксигруппу, 2-метилбутоксигруппу, 1,1-диметилпропоксигруппу, 1,2-диметилпропоксигруппу, н-гексилоксигруппу, изогексилоксигруппу, 1-метилпентилоксигруппу, 2-метилпентилоксигруппу, 3-метилпентилоксигруппу, 1,1-диметилбутоксигруппу, 1,2-диметилбутоксигруппу, 2,2-диметилбутоксигруппу, 1,3-диметилбутоксигруппу, 2,3-диметилбутоксигруппу, 3,3-диметилбутоксигруппу, 1-этилбутоксигруппу, 2-этилбутоксигруппу, 1,1,2-триметилпропоксигруппу, 1,2,2-триметилпропоксигруппу, 1-этил-1-метилпропоксигруппу, 1-этил-2-метилпропоксигруппу и так далее.

"C_6-14арильная группа" в данном описании относится к ароматической кольцевой группе, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 6 до 14, и конкретные примеры включают фенильную группу, 1-нафтильную группу, 2-нафтильную группу, as-индаценильную группу, s-индаценильную группу, аценафтиленильную группу и так далее.

"Атом галогена" в данном описании означает атом фтора, атом хлора, атом брома и атом иода.

"Замещенный или незамещенный" в данном описании означает, что "замещаемый сайт может иметь произвольную комбинацию одного или более заместителей" и, в частности, заместители представляют собой, например, атом водорода, галоген, нитрогруппу, цианогруппу, гидроксильную группу, меркаптогруппу, гидроксиалкильную группу, карбоксильную группу, C_1-6алкоксикарбонильную группу, C_2-7ациламиногруппу, C_1-6алкиламиногруппу, пиридильную группу, C_1-6алкилсульфинильную группу, C_1-6алкилсульфонильную группу, C_1-6алкилсульфамоильную группу, C_1-6алкилсульфинамоильную группу, C_1-6алкилсульфенамоильную группу, тетрагидропиранильную группу, C_1-6алкилкарбамоильную группу или группу формулы -X⁴-R^8a (где X⁴ обозначает прямую связь, атом кислорода или атом серы; R^8a обозначает C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, C_6-14арильную группу, C_3-8циклоалкильную группу или C_3-8циклоалкенильную группу) и так далее.

"Может быть замещен 0-4 заместителями" имеет такое же значение, как "замещаемый сайт может иметь произвольную комбинацию 1-4 заместителей", и заместители имеют такое же значение, как определено выше.

"Соль" в данном изобретении относится к фармацевтически приемлемой соли, и нет конкретных ограничений, при условии, что соль образована в виде аддитивной соли с соединением согласно изобретению, и предпочтительным примером является соль галогенводородной кислоты, такая как гидрофторид, гидрохлорид, гидробромид и гидроиодид; соль неорганической кислоты, такая как сульфат, нитрат, перхлорат, фосфат, карбонат и бикарбонат; органический карбоксилат, такой как ацетат, оксалат, малеат, тартрат и фумарат; органический сульфонат, такой как метансульфонат, трифторметансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, толуолсульфонат и камфорсульфонат; соль аминокислоты, такая как аспартат и глутамат; соли с аминами, такими как триметиламин, триэтиламин, прокаин, пиридин и фенетилбензиламин; соли щелочных металлов, таких как натрий и калий; соли щелочноземельных металлов, таких как магний и кальций, и так далее.

Далее будет раскрыто следующее. 1. Способ получения ДНК, кодирующих белки, принимающие участие в синтезе клеточной стенки. 2. Способ определения того, влияет или нет тестируемый образец на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке. 3. Способ получения вышеуказанного соединения (Ia) согласно данному изобретению.

1. Способ получения ДНК, кодирующих белки, принимающие участие в синтезе клеточной стенки грибков.

В дальнейшем будет описан (1) способ получения ДНК, кодирующей белок для придания резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) при сверхэкспрессии у грибков; (2) способ получения ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5; (3) способ получения ДНК, кодирующей белок, который принимает участие в синтезе клеточной стенки грибка, на основании поиска гомологии, и (4) способ получения грибка, в котором сверхэкспрессируется или отсутствует белок для придания резистентности к указанному выше соединению (Ia).

(1) Способ получения ДНК, кодирующей белок для придания резистентности к указанному выше соединению (Ia) при сверхэкспрессии ДНК у грибка.

В данном описании "грибок" означает грибок, относящийся к типу Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota и Deuteromycota. Предпочтительно, гриб является патогенным грибком (Mucor, Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Malassezia, Aspergillus, Trichophyton, Microsporum, Sporothrix, Blastmyces, Coccidioides, Paracoccidioides, Penicillinium или Fusarium) и более предпочтительно представляет собой C. albicans, C. glabrata, C. neoformans или A. fumigatus. Предпочтительными штаммами также являются S. cerevisiae и S. pombe, для которых легко проводить генетический анализ.

Плазмидную библиотеку генов грибка вводят в грибок. Плазмидную библиотеку S. cerevisiae и S. pombe можно получить из ATCC (регистрационный номер ATCC: 37323) и плазмидную библиотеку C. albicans можно получить способом согласно Navaro-Garcia, F. et al, Mol. Cell. Biol., 15: 2197-2206, 1995. Полученную плазмидную библиотеку вводят в грибки способом согласно Gietz, D. et al, Nucl. Acids Res. 20: 1425, 1992. Альтернативно, можно использовать набор, такой как система трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM (Clontech).

Грибок, в который вводят плазмидную библиотеку, культивируют в присутствии вышеуказанного соединения (Ia). В частности, на агаровой среде, содержащей вышеуказанное соединение (Ia) в концентрации от 1,56 до 25 мкг/мл, предпочтительно от 1,56 до 6,25 мкг/мл и более предпочтительно 3,125 мкг/мл, инокулируют грибок, в который была введена плазмидная библиотека, культивируют в течение соответствующего периода времени при температуре 30°С-42°С в течение от 2 до 5 дней или предпочтительно при 37°С в течение 3 дней. Образованную после пролиферации колонию далее культивируют в среде, содержащей вышеуказанное соединение (Ia), и из пролиферирующих клеток грибков очищают плазмиду. Очистку плазмиды можно осуществить, например, способом согласно Methods in Enzymology, Vol. 194: 169-182 (1991).

Предпочтительно нуклеотидную последовательность полученной плазмиды определяют сразу, но при необходимости, для того чтобы определить нуклеотидную последовательность, проводят клонирование в соответствующем векторе, например pBluescript II и pUC19, подходящем для определения нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность, например, можно определить способом согласно руководству, прилагаемому к системе ABI377 (PE applied Biosystems).

В примерах данного изобретения все 27 независимо полученных колоний S. cerevisiae и 28 колоний из 30 колоний C. albicans содержали ДНК согласно данному изобретению. В указанных грибках существует только один ген, который придает резистентность к вышеуказанному соединению (Ia), и его можно получить вышеуказанным способом.

(2) Способ получения ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.

Пример способа получения ДНК, кодирующей белок, принимающий участие в синтезе клеточной стенки грибка, согласно данному изобретению включает конструирование праймера на основе информации о нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 с использованием в качестве матрицы геномной ДНК S. cerevisiae или конструирование праймера на основе информации о нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5 с использованием в качестве матрицы геномной ДНК C. albicans, затем выполнение ПЦР и клонирование амплифицированной ДНК в соответствующий вектор, такой как pBlueScript. Праймер конструируют так, как необходимо в соответствии с областью, которую надо амплифицировать, и длиной предпочтительно 15 п.н. или более, более предпочтительно 20 п.н. или более, и в некоторых случаях можно добавлять последовательности, необходимые для последующего конструирования ДНК, такие как сайты рестриктаз. Условия для ПЦР можно соответствующим образом определить в соответствии с такими факторами, как длина праймера, длина области, которую необходимо амплифицировать, и количество матричной ДНК, которую необходимо использовать. Например, ДНК, кодирующую белок, принимающий участие в синтезе клеточной стенки у грибков, можно получить, используя в качестве матрицы 200 нг геномной ДНК C. albicans и SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 в качестве праймеров в условиях 94°С в течение 4 минут → (94°С в течение 30 секунд → 68°С в течение 5 минут) x 35 циклов → 72°С в течение 4 минут.

ДНК, полученную в результате ПЦР, можно использовать в качестве зонда для получения других типов ДНК грибков, проявляющей гомологию с ДНК, кодирующей белок, принимающий участие в синтезе клеточной стенки. В частности, например, для того чтобы получить ген C. albicans, гомологичный гену, кодирующему белок, принимающий участие в синтезе клеточной стенки S. cerevisiae, из геномной библиотеки или библиотеки кДНК C. albicans, можно клонировать ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК S. cerevisiae, и используя ДНК, которая получена при ПЦР в качестве зонда. В данном описании "жесткие условия" относятся, например, к гибридизации в 4 x SSC при 65°С, затем промывке в 0,1 x SSC при 65°С в течение 1 часа. Кроме того, в другом случае жесткие условия представляют собой 4 x SSC при 42°С в 50% формамиде. Альтернативно, также возможны такие условия, как гибридизация в растворе PerfectHyb^TM (TOYOBO) при 65°С в течение 2,5 часов, затем промывка 1) в растворе 2 x SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 5 минут; 2) в растворе 2 x SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 15 минут и 3) в растворе 0,1 x SSC, 0,1% SDS при 50°С в течение 20 минут.

В примерах данного изобретения на основании Саузерн-блот-анализа показано, что у C. albicans существует только один ген, который гибридизуется с ДНК SEQ ID NO: 1, и показано клонирование данного гена. На основе вышеуказанного способа можно получить ДНК, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

(3) Способ получения ДНК, которая кодирует белок, который принимает участие в синтезе клеточной стенки грибков, на основе поиска гомологии.

В данном изобретении выявлены гомологи GWT1 S. cerevisiae, C. albicans, S. pombe, A. fumigatus и C. neoformans. Консервативная область в указанных генах считается важной для проявления функций генных продуктов GWT1 и может быть консервативной в очень высокой степени у других грибков.

Следовательно, ДНК, кодирующую белок, принимающий участие в синтезе клеточной стенки грибков, можно получить либо выполняя гибридизацию после конструирования зонда на основе аминокислотной последовательности консервативной области, либо выполняя ПЦР посредством конструирования праймеров на основании последовательности. Праймером ПЦР может быть любая последовательность при условии, что она сконструирована так, чтобы кодировать консервативную область, но предпочтительно представляет собой SEQ ID NO: 29 и 31 или предпочтительно SEQ ID NO: 29 и 30.

Кроме того, в качестве другого способа ДНК, кодирующую белок, принимающий участие в синтезе клеточной стенки грибков, можно получить, выполняя ПЦР с кДНК или геномной ДНК после обнаружения нуклеотидной последовательности, проявляющей гомологию с GWT1, из фрагментов гена, зарегистрированных в базе данных, и затем создавая праймеры на основании данной последовательности.

Примерами способов ПЦР для получения полноразмерного гена на основании полученной последовательности являются такие способы, как 3'-RACE, 5'-RACE, и обратная ПЦР, и его также можно отобрать посредством гибридизации клона, содержащего прилегающие последовательности. Полноразмерный ген можно получить посредством комбинирования указанных способов.

(4) Способ получения грибка, который сверхэкспрессирует или в котором отсутствует белок для придания резистентности к вышеуказанному соединению (Ia).

Грибок, предпочтительно S. cerevisiae, который сверхэкспрессирует белок для придания резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) согласно данному изобретению, можно получить способом встраивания экспрессирующего вектора, который экспрессирует белок, в конкретное положение в хромосоме грибка, например экспрессирующего вектора, в котором ДНК SEQ ID NO: 1 связана ниже промотора, который может эффективно экспрессировать белок в клетках грибка, предпочтительно промотора гена енолазы почкующихся дрожжей (ENO1). Способ встраивания можно выполнить, например, согласно стадиям встраивания требуемой последовательности в сайт множественного клонирования pRS304 (Sikorski RS et al, Genetics. 122(1): 19-27, 1989), конструирования вектора для интеграции и введения вектора в клетку грибка. Для знакомства с деталями можно обратиться к Methods in Enzymology. Vol. 194: 281-301 (1991).

Кроме того, сверхэкспрессирующий штамм C. albicans можно получить введением гена SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5 в экспрессирующий вектор для C. albicans, такой как pCARS1 и pRM1 (Pla J et al, Yeast 12: 1677-1702, 1996), и затем трансформацией C. albicans (Sanglard D et al, Antimicrobiol. Agents Chemother. 40: 2300-2305, 1996).

Грибки согласно данному изобретению, в которых отсутствует ген для придания резистентности к вышеуказанному соединению (Ia), предпочтительно S. cerevisiae, можно получить следующими способами, которые не следует толковать как ограничивающие.

ПЦР-амплификацию выполняют с использованием в качестве матрицы маркерного гена, предпочтительно гена his5 S. pombe, и с использованием праймеров, которые конструируют так, чтобы продукты ПЦР, которые содержат ген, имели делецию (30 п.н. или более, предпочтительно 40 п.н. или более). В случае S. cerevisiae можно получить генную последовательность SEQ ID NO: 1, расположенную на обоих концах. Продукты ПЦР можно очистить и ввести в грибки, затем культивировать в селектирующей среде, соответствующей маркерному гену, например, среде his^- в случае his5, чтобы получить делеционный штамм.

Кроме того, делеционный штамм C. albicans получают обычным способом, используя кассету hisG-URA3-hisG (Fonzi WA et al, Genetics 134: 717-728, 1993) на основании информации о нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.

2. Способ определения того, влияет или нет тестируемый образец на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

Ингибирует ли тестируемый образец или не ингибирует процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, или ингибирует ли тестируемый образец или не ингибирует экспрессию GPI-заякоренного белка на поверхности грибка, можно определить (1) способом с использованием репортерного фермента, (2) способом с использованием антитела, которое реагирует с поверхностным гликопротеидом клеточной стенки грибка, (3) способом определения адгезионной способности по отношению к клеткам животных и (4) способом исследования грибков с использованием светового микроскопа или электронного микроскопа.

Используя описанные ниже способы (1)-(4), предпочтительно способы (1)-(4) в комбинации, судят об ингибировании тестируемым образцом процесса, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, или экспрессии GPI-заякоренных белков на поверхности грибка. Кроме того, делают вывод о том, что тестируемый образец влияет на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, когда степень ингибирования снижается или ингибирование больше не наблюдается в том случае, когда белок, кодируемый ДНК согласно данному изобретению, сверхэкспрессируется у грибка.

В дальнейшем будут описаны способы (1)-(4).

(1) Способ с использованием репортерного фермента.

Процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, можно количественно оценить с помощью эксперимента с меченым атомом, а именно мечением GPI-заякоренного белка радиоактивным изотопом, затем, после отделения фракции клеточной стенки грибка, иммунопреципитацией антителом против GPI-заякоренного белка. Альтернативно, количественную оценку можно легко осуществить экспрессией С-концевой последовательности, которая, как считают, функционирует в качестве сигнала транспорта, который обычно наблюдается у GPI-заякоренных белков, в виде белка, слитого с легко измеряемым ферментом (репортерным ферментом), отделения фракции клеточных стенок грибка и затем использования репортерной системы, которая измеряет активность фермента каждой фракции (Van Berkel MAA et al, FEBS Letters, 349: 135-138, 1994). Далее будет приведено объяснение способа с использованием репортерного фермента, но данное изобретение не следует считать ограниченным указанным способом.

Сначала конструируют репортерный ген и вводят в грибок. Репортерный ген конструируют связыванием промоторной последовательности, которая функционирует в клетке грибка, за которой следуют ДНК, которые соответственно кодируют сигнальную последовательность, репортерный фермент и С-концевую последовательность GPI-заякоренного белка так, чтобы совпали рамки считывания. Примерами промоторных последовательностей являются последовательности таких промоторов, как GAL10 и ENO1. Примерами сигнальных последовательностей являются последовательности α-фактора, инвертазы, лизоцима и подобные. Примерами репортерных ферментов являются β-лактамаза, лизоцим, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза и подобные. Можно использовать белок с зеленой флуоресценцией (GFP), который можно легко детектировать, даже несмотря на то, что он не обладает ферментативной активностью. Примерами С-концевых последовательностей GPI-заякоренных белков являются С-концевая последовательность α-агглютинина, С-концевая последовательность CWP2 и подобные. Кроме того, предпочтительно встраивать соответствующий селектируемый маркер, такой как LEU2 и URA3, в вектор, содержащий сконструированный репортерный ген.

Сконструированный репортерный ген встраивают в гриб соответствующим способом, таким как способ на основе ацетата лития (Gietz D et al, Nucl. Acids Res. 20: 1425, 1992), и при необходимости культивируют способом, подходящим для селектируемого маркера, как, например, в среде Leu^- для LEU2, и в среде Ura^- для URA3, и затем отбирают грибки, в которые была введена ДНК.

Влияет ли тестируемый образец или не влияет на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, определяют следующим способом.

Грибки с введенным репортерным геном культивируют в соответствующих условиях, например при 30°С в течение 48 часов в присутствии тестируемого образца. После культивирования супернатант культуры центрифугируют и измеряют активность фермента во фракции супернатанта культуры. Оставшуюся фракцию клеток промывают, затем компоненты клеточной стенки отделяют соответствующим способом, таким как разрушение глюкана клеточной стенки глюканазой, и затем измеряют активность репортерного фермента во фракции клеточной стенки и в цитоплазматической фракции. Анализ можно просто выполнить, определяя количество репортерного фермента в клеточной фракции центрифугированием, затем без промывки клеток определением количества репортерного фермента, полученного из части супернатанта культуры, которая осталась в клеточной фракции, расчетом пропорции и вычитанием полученного значения из количества репортерного фермента в клеточной фракции.

Если для тестируемого образца подтверждается активность, направленная на увеличение активности репортерного фермента во фракции супернатанта культуры (активность на клетку), или активность, направленная на уменьшение активности репортерного фермента во фракции клеточных стенок (активность на клетку), то делают вывод, что тестируемый образец оказывает влияние на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

(2) Способ с использованием антитела, которое реагирует с поверхностным гликопротеидом клеточной стенки грибка.

Влияет ли тестируемый образец или не влияет на экспрессию GPI-заякоренного белка в поверхностном слое грибка, можно определить путем количественной оценки GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка с использованием антитела, которое реагирует с белком.

Например, что касается антитела, то рассчитывают антигенную детерминанту на основе аминокислотной последовательности GPI-заякоренного белка, например α-агглютинина, Cwp2p и Als1p (Chen MH et al, J. Biol. Chem., 270: 26168-26177, 1995; Van Der Vaat JM et al, J. Bacteriol., 177: 3104-3110, 1995; Hoyer LL et al, Mol. Microbiol., 15: 39-54, 1995), синтезируют пептид указанной области, полученный пептид связывают с антигенным веществом, таким как белок-носитель, и затем можно получить поликлональные антитела путем иммунизации кролика и подобного животного или можно получить моноклональное антитело путем иммунизации мыши и подобного животного. Кроме того, предпочтительны поликлональные антитела домашнего кролика против пептида Als1p.

В альтернативном способе можно получить моноклональное антитело против GPI-заякоренного белка путем иммунизации мыши и подобного животного грибком, предпочтительно грибком, сверхэкспрессирующим GPI-заякоренный белок, такой как α-агглютинин, Cwp2p и Als1p, и в некоторых случаях путем иммунизации частично очищенным GPI-заякоренным белком и отбором полученного в результате слияния клона с помощью ELISA, Вестерн-блот-анализа и тому подобное.

Влияет ли тестируемый образец или не влияет на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, и снижает ли количество белка, полученного из GPI-заякоренного белка в клеточной стенке, можно определить следующим способом.

Гриб культивируют в присутствии тестируемого образца в соответствующих условиях, как, например, при 30°С в течение 48 часов. Культивируемый гриб центрифугируют и клетки разрушают, предпочтительно используя стеклянные шарики. Промытые, разрушенные клетки предпочтительно подвергают экстракции с SDS при центрифугировании, затем промывают осадок. После экстракции разрушенные клетки обрабатывают ферментом, который разрушает глюкан, предпочтительно глюканазой, и супернатант клеток после центрифугирования представляет собой образец GPI-заякоренного белка.

96-луночный планшет покрывают антителом против Als1p пептида, инкубируя при 4°С в течение ночи. После промывки раствором для промывки, предпочтительно PBS, содержащим 0,05% твин 20 (PBST), проводят блокирование реагентом, который блокирует неспецифичные сайты адсорбции 96-луночного планшета, предпочтительно белком, таким как БСА, и желатином, более предпочтительно BlockAce. После следующей промывки раствором для промывки, предпочтительно PBST, в некоторых случаях после добавления соответствующим образом разведенного образца GPI-заякоренного белка, реакцию проводят в течение соответствующего периода времени, например 2 часа при комнатной температуре. После промывки раствором для промывки, предпочтительно PBST, проводят реакцию антитела против меченного ферментом C. albicans, предпочтительно HRP-меченого антитела против Candida, в течение соответствующего периода времени, например 2 часа при комнатной температуре. Способ мечения может представлять собой мечение ферментом или мечение радиоактивным изотопом. После промывки раствором для промывки, предпочтительно PBST, рассчитывают количество Als1p в образце GPI-заякоренного белка способом, который соответствует типу метки, т.е. в случае ферментной метки добавляя раствор субстрата и затем после остановки реакции измеряя оптическую плотность при 490 нм.

(3) Способ определения адгезионной способности по отношению к клеткам животных.

Влияет ли тестируемый образец или не влияет на экспрессию GPI-заякоренного белка на поверхности грибка, можно определить, измеряя активность GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка, предпочтительно измеряя адгезионную способность грибков по отношению к клеткам животных и подобным. Кроме Als1p, Hwp1p и подобных белков, принимающих участие в адгезии к клеткам животных, в качестве GPI-заякоренных белков известны α-агглютинин, принимающий участие в спаривании, Flo1p, принимающий участие в агрегации дрожжей, и тому подобные. В дальнейшем будет дано подробное объяснение способов определения, в которых используют адгезионную способность грибков по отношению к клеткам животных, но данное изобретение не следует считать ограниченным указанными способами.

Что касается грибка, то используют грибок, обладающий адгезионной способностью по отношению к клеткам, и предпочтительно грибком является C. albicans. Что касается клеток млекопитающих, то используют клетки, на которых происходит адгезия грибков, и предпочтительно эпителиальные клетки кишечника. Клетки млекопитающих культивируют и иммобилизуют соответствующим способом, таким как иммобилизация этанолом. Инокулируют тестируемый образец и грибки, которые были инкубированы в течение соответствующего периода времени, а именно 48 часов при 30°С, затем после культивирования в течение определенного периода времени, например 1 час при 30°С, удаляют супернатант культуры, промывают и наслаивают на агаровую среду, такую как среда декстроза-агар Sabouraud (Difco). После культивирования при 30°С в течение ночи подсчитывают количество колоний и рассчитывают степень адгезии.

Если в тестируемом образце наблюдается активность в снижении количества колоний, образованных при адгезии грибков с клетками, по сравнению с активностью грибков, которые не обрабатывали соединением, делают вывод, что тестируемый образец оказывает влияние на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

(4) Способ исследования грибков с использованием электронного микроскопа или светового микроскопа.

Влияет ли тестируемый образец или не влияет на экспрессию GPI-заякоренных белков на поверхности грибка, можно определить при исследовании структуры клеточной стенки грибка с использованием электронного микроскопа.

В присутствии тестируемого образца грибок, такой как C. albicans, культивируют в течение определенного периода времени, например 48 часов при 30°С, и исследуют ультратонкую морфологическую структуру с помощью трансмиссионного электронного микроскопа. При этом исследование с помощью трансмиссионного электронного микроскопа можно, например, выполнить способом согласно схеме руководства для электронного микроскопа (Medical Publishing Center). Гифовую фибриллярную структуру самого наружного слоя грибковой клетки, которая имеет высокую электронную плотность и видна на изображении под трансмиссионным электронным микроскопом, считают поверхностным слоем гликопротеидов, имеющим в качестве составных частей GPI-заякоренные белки, и на нее не влияют другие существующие противогрибковые средства. В том случае, когда гифовая фибриллярная структура самого наружного слоя грибковой клетки, которая имеет высокую электронную плотность, исчезает, оставляя тонкий слой с высокой электронной плотностью, по сравнению со слоем в необработанных клетках, делают вывод, что тестируемый образец оказывает влияние на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

В том случае, когда под трансмиссионным электронным микроскопом в дополнение к оптическому микроскопу видны изображения, на которых клетки грибков сильно набухли, а почкование (деление) ингибировано, делают вывод, что тестируемый образец оказывает влияние на клеточную стенку.

Соединения согласно данному изобретению, представленные формулой (I)

(где символы имеют такие же значения, как определено выше), можно синтезировать с использованием обычных для органической химии реакций и так, как было известно до настоящего времени. Например, соединение можно синтезировать следующими способами.

Способ получения (1)

В указанных выше формулах Х обозначает удаляемую группу, такую как группа галогена и ацильная группа. Другие символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ А1

Реакция получения соединения Рейссерта (V). Соединение можно получить на основе условий реакции, соответствующих условиям, описанным в литературе, например, Org. Synth., VI, 115(1988); Heterocycles, 36(11), 2489(1993); J. Chem. Soc. (C), 666(1969); или J. Heterocycl. Chem., 29(5), 1165(1992). В частности, используемые реагенты представляют собой, например, комбинацию бензоилхлорида и цианида калия.

Способ А2

Способ алкилирования. Соединение (VI) можно получить взаимодействием соединения (V) с замещенным производным бензоилгалогенида, замещенным производным бензилметансульфоната или подобным в присутствии основания. Конкретные примеры оснований включают гидрид натрия, гидроксид натрия.

Способ А3

Способ реакции гидролиза. Соединение (I) можно получить гидролизом соединения (VI) в присутствии основания.

Способ А представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа A1, способа A2 и способа A3.

Способ В1

Способ превращения соединения (V) в соединение (VII). Соединение (VII) можно получить взаимодействием соединения (V) с замещенным бензальдегидом в присутствии основания и катализатора фазового переноса. Примеры оснований включают гидроксид натрия и гидроксид калия. Примеры катализатора фазового переноса включают триэтилбензиламмонийхлорид.

Способ В2

Способ окисления спирта в кетон. Кетоновое производное (VIII) можно получить, используя окислитель и условия, обычно используемые для реакции окисления спирта в кетон. В частности, окислителем является, например, диоксид марганца, диоксид хрома или бензохинон.

Способ В3

Способ восстановления кетона в метилен. Метиленовое производное (I) можно получить, используя обычно применяемую комбинацию восстанавливающих агентов для реакции восстановления кетонового производного (VIII) в метиленовое производное (I). Примеры комбинации восстанавливающих агентов включают гидрат гидразина и гидроксид натрия или гидроксид калия, триэтилсилан и трифторид бора и трифторметансульфоновую кислоту.

Способ В представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа A1, способа B1, способа B2 и способа B3.

Способ С1

Способ галогенирования или ацилирования гидроксильной группы. Соединение (IX) можно получить взаимодействием галогенирующего агента или ацилирующего агента с соединением (VII). Примеры галогенирующего агента включают тионилхлорид, концентрированную хлористоводородную кислоту и трибромид фосфора. Кроме того, примеры ацилирующего агента включают галогенангидриды, такие как ацетилхлорид, и ангидриды кислот, такие как уксусный ангидрид.

Способ С2

Способ осуществления реакции восстановительного элиминирования группы галогена или ацильной группы. Соединение (I) можно получить гидроэлиминированием соединения (IX), например, с использованием катализатора.

Примеры катализатора включают палладий на угле.

Способ С представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа A1, способа B1, способа C1 и способа C2.

Способ получения (2)

Соединение согласно данному изобретению, представленное формулой (I), также можно синтезировать следующим способом.

В формуле X обозначает удаляемую группу, такую как группа галогена или ацильная группа. Другие символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ D1

Способ проведения реакции Гриньяра и последующей реакции кислотного гидролиза. Соединение (VIII) можно получить взаимодействием соединения (X) с замещенным или незамещенным фенилмагнийгалогенидом (реактивом Гриньяра) с последующим гидролизом в присутствии кислоты.

Способ D2

Метиленовое производное (I) можно получить из производного кетона (VIII) в условиях, подобных условиям способа B3.

Способ D представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа D1 и способа D2.

Способ Е1

Способ проведения реакции восстановления кетона в спирт. Соединение (VII) можно получить из соединения (VIII), используя восстанавливающий агент и условия, обычно используемые для реакции восстановления кетона в спирт. Конкретные примеры восстанавливающего агента включают борогидрид натрия и алюмогидрид лития.

Способ Е2

В условиях, подобных условиям способа С1, можно получить галогенированное или ацилированное производное (IX) из спиртового производного (VII).

Способ Е3

В условиях реакции восстановительного элиминирования, подобных условиям способа С2, можно получить соединение (I) из соединения (IX).

Способ Е представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа D1, способа E1, способа E2 и способа E3.

Способ получения (3)

Соединение согласно данному изобретению, представленное формулой (I), также можно синтезировать следующим способом.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ F1

Способ проведения реакции хлорирования. Соединение (XII) можно получить взаимодействием соединения (XI) с хлорирующим агентом. Примеры хлорирующего агента включают оксихлорид фосфора и тионилхлорид.

Способ F2

Способ проведения реакции сочетания с реактивом Гриньяра. Соединение (I) можно получить взаимодействием соединения (XII) с замещенным или незамещенным бензилмагнийгалогенидом (реактивом Гриньяра) в присутствии катализатора на основе условий реакции, соответствующих условиям, описанным в литературе, например, Arch. Pharm, 314, 156 (1981). Примеры катализатора включают [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорникель(II).

Способ F представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа F1 и способа F2.

Способ получения (4)

Соединение согласно данному изобретению, представленное формулой (I), где R^1a и R^2a вместе образуют конденсированное кольцо, такое как бензольное кольцо, пиридиновое кольцо, пиррольное кольцо, тиофеновое кольцо, фурановое кольцо, циклогексановое кольцо или циклопентановое кольцо, можно синтезировать следующим способом.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Далее в качестве примера показан способ получения, при котором образуется изохинолиновое кольцо.

Способ G1

Способ проведения реакции конденсации и последующей реакции восстановления. Соединение (XIV) можно получить реакцией конденсации между замещенным или незамещенным производным бензальдегида (XIII) и нитрометаном с последующим восстановлением нитрогруппы. Примеры реагентов, используемых для восстановления нитрогруппы, включают комбинацию палладия на угле и формиата аммония и алюмогидрид лития.

Способ G2

Реакция образования амидной связи. Соединение (XV) можно получить взаимодействием соединения (XIV) и замещенного или незамещенного фенилацетилхлорида со связывающим реагентом для реакции образования амидной связи. Примеры связывающего реагента включают комбинацию N,N'-дициклогексилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимида, комбинацию N,N'-дициклогексилкарбодиимида и N-гидроксибензотриазола и 1,1'-карбонилдиимидазол.

Способ G3

Способ реакции циклизации. Соединение (XV) можно получить на основе условий реакции, соответствующих условиям, описанным в литературе, например Organic Reaction, 6, 74(1951); J. Hetetocyclic Chem., 30, 1581 (1993). Примеры реагента для данной реакции включают оксихлорид фосфора и полифосфорную кислоту.

Способ G представляет собой способ получения соединения (I) посредством способа G1, способа G2 и способа G3.

Способ получения (5-1)

Замена заместителя R^3a или R^4a соединения (I), синтезированного вышеуказанным способом получения.

(5-1) Замена заместителя аминогруппой, амидной группой, сульфонамидной группой и т.д.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ Н1

Реакция восстановления нитрогруппы. Соединение (XVII) можно получить восстановлением соединения (XVI) способом, обычно используемым для восстановления нитрогруппы. Примерами способа восстановления нитрогруппы являются восстановление путем каталитического гидрирования палладием на угле или гидроксидом палладия и восстановление комплексом железо-хлорид аммония, железо-хлористоводородная кислота, железо-уксусная кислота и т.д.

Способ Н2

Способ проведения реакции ацилирования или сульфонилирования. Соединение (XVIII) можно получить обработкой соединения (XVII) хлорангидридом или ангидридом кислоты.

Способ Н представляет собой способ получения соединения (XVIII) посредством способа H1 и способа H2.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ I1

Способ проведения реакции восстановительного аминирования. Соединение (XX) можно получить из соединения (XIX) и замещенного или незамещенного альдегида на основании условий реакций, соответствующих условиям, описанным в литературе, например J. Am. Chem. Soc., 93, 2897(1971); Comprehensive Organic Synthese, 8, 25(1991); Tetrahedron, 40, 1783(1984), и Tetrahedron, 41, 5307(1985). Примеры реагента восстановительного аминирования включают триацетоксигидроборат натрия, цианотригидроборат натрия, боран-пиридиновый комплекс и палладий на угле/водород.

Способ I2

Способ проведения реакции ацилирования, сульфонилирования или восстановительного аминирования. Соединение (XXIa) или соединение (XXIb) можно получить из соединения (XX), используя хлорангидрид или ангидрид кислоты. Соединение (XXIc) можно получить, проводя реакцию восстановительного аминирования, подобно реакции способа I1.

Способ I представляет собой способ получения соединения (XXIa), соединения (XXIb) или соединения (XXIc) посредством способа I1 и способа I2.

Способ получения (5-2)

Замена заместителя R^3a или R^4a соединения (I), синтезированного вышеуказанным способом получения.

(5-2) Замена заместителя гидроксильной группой, алкоксигруппой и т.д.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ J1

Соединение (XXIII) можно получить из соединения (XXII) в результате реакции деметилирования на основании условий реакции, соответствующих условиям, описанным в литературе, например в Bull. Chem. Soc. Jpn., 44, 1986(1971); Org. Synth., Collect. Vol. V, 412(1073); J. Am. Chem. Soc., 78, 1380(1956), или J. Org. Chem., 42, 2761(1977). Примеры реагента, используемого для реакции деметилирования, включают 47% водный раствор бромистоводородной кислоты, трибромид бора, гидрохлорид пиридина и иодтриметилсилан.

Способ J2

Способ проведения реакции алкилирования. Соединение (XXIV) можно получить взаимодействием соединения (XXIII) с замещенным или незамещенным алкилгалогенидом, замещенным или незамещенным алкилметансульфонатом или подобными реагентами в присутствии основания.

Способ J представляет собой способ получения соединения (XXIV) посредством способа J1 и способа J2.

Способ получения (5-3)

Замена заместителя R^3a или R^4a соединения (I), синтезированного вышеуказанным способом получения.

(5-3) Замена заместителя виниленовой группой, этиниленовой группой, алкильной группой и т.д.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ К1

Способ проведения реакции трифторметансульфонилирования. Соединение (XXV) можно получить взаимодействием соединения (XXIII) с ангидридом трифторметансульфоновой кислоты в присутствии основания.

Способ К2

Способ проведения реакции связывания алкина. Соединение (XXVI) можно получить связыванием соединения (XXV) с производным алкина в присутствии палладий-фосфинового комплекса, иодида меди и основания. Примеры реагентов, которые дают палладий-фосфиновый комплекс в реакционной системе, включают комбинацию палладия на угле и трифенилфосфина, тетракистрифенилфосфинпалладия (0) и трифенилфосфина, дихлорбистрифенилфосфинпалладия (II), ацетата палладия (II) и три(о-толил)фосфина, и ацетата палладия (II) и 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцена. Примеры основания включают триэтиламин, пиперидин, пиридин и карбонат калия. В зависимости от реакции можно использовать хлорид лития.

Способ К3

Способ проведения реакции восстановления ненасыщенного углеводорода. Соединение (XXVIIa) или соединение (XXVIIb) можно получить из соединения (XXVI), например, каталитическим гидрированием с использованием катализатора. Примеры катализатора включают палладий на угле, гидроксид палладия, оксид платины и палладий на угле-карбонат кальция.

Символы в формулах имеют такие же значения, как определено выше.

Способ L1

Способ проведения реакции связывания (реакция Хека) с алкеном. Соединение (XXVIIa) можно получить из соединения (XXVIII), используя катализатор (например, палладиевый комплекс и его лиганд), на основании условий реакции, соответствующих условиям, описанным в литературе, например в J. Org. Chem., 37, 2320(1972); Org. Reactions., 27, 345(1982); Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, 833(1991); Palladium Reagents and Catalysts, 125(1995); Chem. Commun., 1287(1984); Tetrahedron Lett, 26, 2667(1985), и Tetrahedron Lett, 31, 2463(1990). Примеры комбинации катализаторов, используемых для данной реакции (палладиевый комплекс и его лиганд), включают ацетат палладия (II) и 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен; ацетат палладия (II) и три(о-толил)фосфин. Примеры третичного основания включают триэтиламин, диизопропилэтиламин и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен. X в соединении (XXVIII) обозначает удаляемую группу, такую как группа галогена и трифторметансульфонилоксигруппа.

Способ L2

Соединение (XXVIIb) можно получить из соединения (XXVIIa) в соответствии с условиями реакции восстановления ненасыщенного углеводорода, подобными условиям способа К3.

Способ L представляет собой способ получения соединения (XXVIIa) способом L1 с последующим получением соединения (XXVIIb) способом L2.

Различные изомеры соединений, представленных формулой (I), согласно данному изобретению можно очистить и выделить, используя обычный способ разделения (например, перекристаллизацию, хроматографию и так далее).

Соединения согласно данному изобретению или их соли, или их гидраты можно вводить как таковые млекопитающим (предпочтительно человеку). Соединения также можно приготовить обычным способом в виде таблеток, порошков, мелких гранул, гранул, таблеток, покрытых оболочками, капсул, сиропов, пастилок, ингаляторов, суппозиториев, инъекций, мазей, глазных мазей, глазных капель, назальных капель, ушных капель, припарок, примочек и тому подобное, затем ввести. Для приготовления фармацевтической композиции можно использовать обычно используемые для фармацевтических композиций вспомогательные средства (например, наполнители, связывающие агенты, скользящие вещества, красители, корригенты и при необходимости стабилизаторы, эмульгаторы, агенты, способствующие поглощению, поверхностно-активные вещества, регуляторы рН, антисептики, антиоксиданты и т.д.). Фармацевтическую композицию можно приготовить обычным способом, комбинируя компоненты, которые обычно используют в качестве ингредиентов для фармацевтических препаратов. Например, пероральные композиции можно получить, комбинируя соединения согласно данному изобретению или их фармацевтически приемлемые соли с наполнителями и при необходимости связывающими агентами, дезинтегрирующими агентами, скользящими веществами, красителями, корригентами и тому подобное и приготавливая смеси обычными способами в виде порошков, мелких гранул, гранул, таблеток, таблеток, покрытых оболочками, капсул и тому подобное обычными способами. Примеры указанных компонентов включают животный жир и растительное масло, такое как соевое масло, говяжий жир и синтетический глицерид; углеводороды, такие как жидкий парафин, сквален и твердый парафин; эфирные масла, такие как октилдодецилмиристат и изопропилмиристат; высшие спирты, такие как кетостеариловый спирт и бехениловый спирт; силиконовую смолу; силиконовое масло; поверхностно-активные вещества, такие как эфир полиоксиэтилена и жирной кислоты, эфир сорбитана и жирной кислоты, эфир глицерина и жирной кислоты, эфир сорбитанполиоксиэтилена и жирной кислоты, отвержденное полиоксиэтиленом касторовое масло и блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена; растворимые в воде макромолекулы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, полиакриловая кислота, карбоксивиниловый полимер, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон и метилцеллюлоза; низшие спирты, такие как этанол и изопропанол; многоатомные спирты, такие как глицерин, пропиленгликоль, дипропиленгликоль и сорбит; сахара, такие как глюкоза и сахароза; неорганический порошок, такой как диоксид кремния, алюмосиликат магния и силикат алюминия; очищенная вода и т.д. Примеры наполнителей включают лактозу, кукурузный крахмал, рафинированный белый сахар, глюкозу, маннит, сорбит, кристаллическую целлюлозу и диоксид кремния. Примеры связывающих агентов включают поливиниловый спирт, поливинилэфир, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, аравийскую камедь, трагакантовую камедь, желатин, шеллак, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, поливинилпирролидон, блок-сополимер полипропиленгликоля и полиоксиэтилена и меглумин. Примеры дезинтегрирующих агентов включают крахмал, агар, порошкообразный желатин, кристаллическую целлюлозу, карбонат кальция, гидрокарбонат натрия, цитрат кальция, декстрин, пектин и кальцийкарбоксиметилцеллюлозу. Примеры придающих скольжение веществ включают стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль, кремнезем и гидрогенизированное растительное масло. Примерами красителей являются красители, которые принято добавлять к лекарственным средствам. Примеры корригентов включают порошок какао, l-ментол, ароматическое диспергирующее средство, масло мяты, борнеол и порошок корицы. Конечно, при необходимости и возможности для таких таблеток и гранул допустимо применение сахарного покрытия или другого соответствующего покрытия. Кроме того, можно приготовить жидкие препараты, такие как сиропы и инъекционные препараты, с использованием традиционных способов путем добавления регуляторов рН, солюбилизаторов, изотонизирующих агентов и тому подобное, и при необходимости солюбилизирующих адъювантов, стабилизаторов и тому подобное к соединениям согласно данному изобретению или их фармацевтически приемлемым солям. Способ получения наружных препаратов не ограничен, и препараты можно получать обычным способом. А именно, основные материалы, используемые для приготовления композиции, можно выбрать из множества материалов, обычно используемых в лекарственных средствах, квазилекарствах, косметических средствах и подобном. В частности, основными материалами, которые можно использовать, являются животный жир и растительное масло, минеральное масло, эфирное масло, воски, высшие спирты, жирные кислоты, силиконовое масло, поверхностно-активные вещества, фосфолипиды, спирты, многоатомные спирты, растворимые в воде макромолекулы, материалы из глины и очищенная вода. При необходимости можно добавлять регуляторы рН, антиоксиданты, хелатирующие агенты, антисептические и противогрибковые средства, красящие материалы, отдушки и тому подобное, но основные материалы наружных препаратов согласно данному изобретению не следует считать ограниченными указанным. Кроме того, при необходимости можно комбинировать компоненты, такие как компоненты, которые оказывают индуцирующее действие на дифференцировку, ускорители кровяного потока, фунгициды, противовоспалительные средства, активаторы клеток, витамины, аминокислоты, увлажнители и кератолитические агенты. Указанные выше основные материалы добавляют в количестве, которое дает концентрацию, обычно используемую для наружных препаратов.

При введении соединений согласно данному изобретению или их солей, или их гидратов не существует конкретных ограничений относительно их формы, и соединения можно вводить перорально или парентерально обычно применяемым способом. Соединения можно приготовить в дозированных формах, таких как таблетки, порошок, мелкие гранулы, капсулы, сиропы, лепешки, ингаляторы, суппозитории, инъекции, мази, глазные мази, глазные капли, назальные капли, ушные капли, припарки и примочки. Дозу фармацевтических композиций согласно данному изобретению можно соответствующим образом выбрать в зависимости от степени проявления симптома, возраста, пола, массы, дозированной формы, типа соли и конкретного типа заболевания, и тому подобное.

Пациенту вводят терапевтическую дозу противогрибкового средства согласно данному изобретению. "Терапевтическая доза" относится к количеству фармацевтического агента, которое дает требуемый фармакологический результат и является эффективным для выздоровления или ослабления симптомов у пациента, которого подвергают лечению. Доза заметно отличается в зависимости от массы пациента, типа заболевания, степени развития симптомов, возраста пациента, пола, чувствительности к агенту и тому подобное. Обычно суточная доза для взрослого человека составляет примерно от 0,03 до 1000 мг, предпочтительно от 0,1 до 500 мг, более предпочтительно от 0,1 до 100 мг, и ее вводят от одного до нескольких раз в сутки или от одного до нескольких раз в несколько дней. Доза для инъекций обычно составляет примерно от 1 до 3000 мкг/кг, предпочтительно примерно от 3 до 1000 мкг/кг.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схематичную диаграмму процесса, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке. GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-заякоренный белок сначала заякоривается на плазматической мембране, а затем транспортируется к клеточной стенке.

Фиг. 2 является графиком, на котором показана активность вышеуказанного соединения (Ia) в репортерной системе S. cerevisiae. В присутствии вышеуказанного соединения (Ia), при концентрации от 0,39 до 1,56 мкг/мл, активность цефалоспориназы увеличивалась во фракции супернатанта культуры и снижалась во фракции клеточных стенок, а при концентрации 3,13 мкг/мл или выше отмечалось ингибирование роста.

Фиг. 3 представляет собой график, на котором показано действие вышеуказанного соединения (Ia) на адгезию C. albicans к клеткам животных. Даже при концентрации 1,56 мкг/мл, при которой невозможно наблюдать ингибирование роста, адгезия C. albicans к клеткам животных была ингибирована почти наполовину.

Фиг. 4 представляет собой график, на котором показано действие вышеуказанного соединения (Ia) на количество антигена Als1p C. albicans. В присутствии вышеуказанного соединения (Ia) при концентрации от 0,1 до 0,39 мкг/мл количество антигена Als1p возрастало во фракции супернатанта культуры, и количество антигена снижалось во фракции клеточных стенок.

Фиг. 5 представляет собой фотографию, на которой показан Саузерн-блот-анализ гена C. albicans с использованием в качестве зонда гена GWT1. Наблюдали единственную полосу в области 6,5 т.п.н. при использовании EcoRI, в области 4,0 т.п.н. с HindIII, в области 2,0 т.п.н. с EcoRI-HindIII и в области 2,5 т.п.н. с EcoRI-PstI, и предположили, что гомолог гена, резистентного по отношению к вышеуказанному соединению (Ia), у C. albicans существует в виде единственного гена.

Фиг. 6 представляет собой график, на котором показана активность вышеуказанного соединения (Ia) у S. cerevisiae, которые сверхэкспрессировали продукт гена GWT1. Даже при концентрации вышеуказанного соединения (Ia) (от 0,39 до 1,56 мкг/мл), при которой у S. cerevisiae штамма CW63 ("W/T" на фиг.6) увеличивается активность цефалоспориназы во фракции супернатанта культуры и снижается активность во фракции клеточных стенок, такое действие не обнаружили у S. cerevisiae штамма CW63/GWT1, и даже при концентрации вышеуказанного соединения (> 3,13 мкг/мл), при которой у S. cerevisiae штамма CW63 ингибирован рост, ингибирования роста не наблюдали у S. cerevisiae штамма CW63/GWT1 ("O/E" на фиг.6).

Фиг. 7 представляет собой диаграмму, на которой осуществлено сопоставление высоко консервативных участков в белках, кодируемых генами GWT1 S. cerevisiae, S. pombe и C. albicans.

Наилучший способ выполнения изобретения

[Пример А]

Данное изобретение далее конкретно иллюстрируется с обращением к примерам, но изобретение не следует считать ограниченным указанными примерами.

Пример А1. Конструирование репортерного гена и его введение в S. cerevisiae.

(1) Конструирование репортерного гена в тех случаях, когда репортерным ферментом является лизоцим.

Ген лизоцима, содержащий промоторную последовательность, амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду pESH, содержащую промотор ENO1 + сигнал секреции + ген лизоцима (Ichikawa K et al, Biosci. Biotech. Biochem., 57(10), 1686-1690, 1993), и в качестве праймеров олигонуклеотиды SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, и полученный продукт субклонировали в SalI-EcoRI-сайте pCR-Script SK(+) (a). Кроме того, амплифицировали ген CWP2 путем ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК S. cerevisiae и в качестве праймеров олигонуклеотиды SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, и полученный продукт субклонировали в EcoRI-HindIII-сайте pUC19 (b). Подобным образом терминатор CYC1 амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы pYES2 (INVITROGEN) и в качестве праймеров олигонуклеотиды SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, и полученный продукт субклонировали в заново введенном NotI-KpnI-сайте pUC19 (c).

Затем ген лизоцима, вырезанный SalI-EcoRI (a), и ген CWP2, вырезанный EcoRI-HindIII (b), встраивали в сайт расщепления SalI-HindIII pESH. Наконец, pRLW63T получали вырезанием гена, содержащего промотор ENO1 + сигнал секреции + ген лизоцима + ген CWP2, с использованием BamHI-HindIII, встраиванием гена в интегрирующий вектор pRS306 (Sikorski RS et al, Genetics. 122(1): 19-27, 1989) и затем встраиванием терминатора CYC1, вырезанного HindIII-KpnI (c), в сайт расщепления HindIII-KpnI.

(2) Конструирование репортерного гена в том случае, когда репортерным ферментом является цефалоспориназа.

ДНК, содержащую последовательность промотора и часть сигнала секреции, амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы вышеуказанную pESH и в качестве праймеров олигонуклеотиды SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, и полученный продукт субклонировали в сайте BamHI-NotI, заново введенном в pUC19 (d). Кроме того, амплифицировали ген цефалоспориназы путем ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК Citrobacter freundii и в качестве праймеров олигонуклеотиды SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, и продукт субклонировали в сайте NspV-XbaI, заново введенном в pUC19 (e). Подобным образом амплифицировали ген CWP2 путем ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК S. cerevisiae и в качестве праймеров олигонуклеотиды SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, и продукт субклонировали в XbaI-HindIII-сайте pUC19 (f).

После получения полноразмерного промотора ENO1 + части сигнала секреции путем встраивания BamHI-SalI-фрагмента pESH в сайт расщепления BamHI-SalI плазмиды, в которую был встроен (d), ген цефалоспориназы, вырезанный NspV-XbaI, и ген CWP2, вырезанный XbaI-HindIII, встраивали в сайт расщепления NspV-HindIII. Затем получали pRCW63T вырезанием EcoRI-HindIII, встраиванием фрагмента в вышеуказанную pRS306 и затем встраиванием терминатора CYC1 в сайт расщепления HindIII-KpnI.

(3) Введение репортерного гена в S. cerevisiae.

S. cerevisiae штамма G2-10 культивировали при встряхивании в 10 мл среды YPD при 30°С, затем клетки собирали в поздней логарифмической фазе роста (2-5 x 10⁷ клеток/мл). После промывки стерильной водой указанные выше pRLW63T и pRCW63T вводили способом на основе ацетата лития, в котором используется система трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM (Clontech) (согласно руководству для пользователей системы трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM). Использовали pRLW63T и pRCW63T, в которых ген URA3 был вырезан EcoRV и ApaI соответственно. После культивирования в среде SD(Ura^-) при 30°С в течение 3 дней выросшие колонии культивировали в среде YPD.

В тех случаях, когда подтверждали локализацию активностей лизоцима и цефалоспориназы, обе активности, главным образом, были локализованы в клеточной стенке, и было подтверждено, что С-концевая последовательность CWP2 функционирует в качестве сигнала транспорта к клеточной стенке.

Пример A2. Скрининг фармацевтических средств с помощью репортерной системы S. cerevisiae.

Так как чувствительность ферментной реакции выше в случае цефалоспориназы по сравнению с лизоцимом, для скрининга соединений использовали S. cerevisiae, в которые вводили pRCW63T (S. cerevisiae, штамм CW63).

После стационарного культивирования в жидкой среде YPD при 30°С в течение 48 часов культуру дрожжевых клеток разводили в 100 раз жидкой средой YPD (3-5 x 10⁵ клеток/мл) и аликвоты культуры объемом 75 мкл/лунка инокулировали в 96-луночный планшет с V-образным дном, содержащий 25 мкл/лунка разведенного тестируемого образца, и подвергали стационарному культивированию при 30°С в течение 48 часов. После центрифугирования планшета отбирали 25 мкл супернатанта и помещали в 96-луночный планшет с плоским дном, образец использовали в качестве фракции супернатанта культуры.

Осажденные клетки суспендировали и добавляли аликвоты раствора зимолиазы (Seikagaku Corporation), приготовленного с 2,4 М сорбитом, объемом 75 мкл/лунка, и давали возможность реагировать при 30°С в течение 1 часа. После центрифугирования планшета отбирали 10 мкл супернатанта и помещали в 96-луночный планшет с плоским дном, добавляли 15 мкл фосфатного буфера, и полученное использовали в качестве фракции клеточных стенок.

Активности цефалоспориназы в среде и во фракции клеточных стенок измеряли, добавляя к объединенному образцу 200 мкл раствора нитроцефина и после определенного периода времени останавливая реакцию буфером на основе лимонной кислоты и затем измеряя оптическую плотность при 490 нм.

Кроме того, определяли рост грибков в присутствии тестируемого образца визуальным наблюдением.

На фиг. 2 показано, что в присутствии вышеуказанного соединения (Ia) в концентрации от 0,39 до 1,56 мкг/мл активность цефалоспориназы увеличивается во фракции супернатанта культуры и активность снижается во фракции клеточных стенок. Таким образом, соединение, которое увеличивает активность цефалоспориназы во фракции супернатанта культуры и, кроме того, снижает активность цефалоспориназы во фракции клеточных стенок, считается соединением, которое ингибирует процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

Пример A3. Скрининг фармацевтических средств с использованием адгезии Candida к клеткам животных.

Аликвоты клеток IEC-18 объемом 3 мл (1 x 10⁵ клеток/мл в среде D-MEM (Nissui Pharmaceutical), содержащей 10% плодной сыворотки теленка и 2 мМ глутамина) помещали в каждую лунку 6-луночного многолуночного планшета. Планшет инкубировали в инкубаторе в атмосфере, содержащей углекислый газ, при 37°С в течение 3 дней, супернатант культуры удаляли и проводили иммобилизацию этанолом.

C. albicans, культивированные в жидкой среде с декстрозой Sabouraud, содержащей разные концентрации тестируемого образца, при 30°С в течение 48 часов, доводили до 4 x 10² клеток/мл и 1 мл инокулировали в каждую лунку планшета, в котором культивировали иммобилизованные клетки IEC-18. После культивирования при 30°С в течение 1 часа удаляли супернатант культуры, промывали PBS и затем наносили слой 2 мл агаровой среды с декстрозой Sabouraud (Difco). После культивирования при 30°С в течение ночи подсчитывали количество выросших колоний (CFU) и рассчитывали степень адгезии.

На фиг. 3 показано, что даже при концентрации вышеуказанного соединения (Ia), равной 1,56 мкг/мл, при которой невозможно наблюдать ингибирование роста, адгезия C. albicans к клеткам животных была ингибирована примерно наполовину. При сравнении с необработанными C. albicans, тестируемый образец, который снижал CFU, которые прилипали к клеткам, считали соединением, которое ингибирует адгезию C. albicans к клеткам животных.

Пример A4. Скрининг фармацевтических средств на основе количества GPI-заякоренного белка, количественно определяемого посредством ELISA.

(1) Получение антитела против пептида Als1p.

Домашнего кролика иммунизировали синтетическим пептидом SEQ ID NO: 20, который конъюгировали с KLH. Полученную антисыворотку аффинно очищали и фракцию IgG использовали в качестве антитела против пептида Als1p.

(2) Скрининг фармацевтических средств посредством ELISA с использованием антитела против пептида Als1p.

C. albicans культивировали в жидкой среде с декстрозой Sabouraud (5 мл), содержащей разные концентрации тестируемого образца, при 30°С в течение 48 часов и клетки собирали центрифугированием, промывали и затем суспендировали в 300 мкл трис-HCl-буфера. Суспендированные клетки переносили в микропробирку, содержащую стеклянные шарики, и разрушали, повторяя 10 циклов встряхивания в течение 1 минуты и охлаждения на льду в течение 1 минуты. Промытые разрушенные клетки экстрагировали 2% SDS при 95°С в течение 10 минут, центрифугировали и затем осадок 5 раз промывали фосфатным буфером. К полученному осадку добавляли 0,5 мл раствора зимолазы в концентрации 5 мкг/мл, реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа и супернатант после центрифугирования использовали в качестве образца GPI-заякоренных белков.

96-луночный планшет покрывали 50 мкл антитела против пептида Als1p (40 мкг/мл) при 4°С в течение ночи. После промывки 5 раз PBS, содержащим 0,05% твина-20 (PBST), проводили блокирование 25% BlockAce при комнатной температуре в течение 2 часов. После 3 промывок PBST проводили реакцию с 50 мкл 2-кратно серийно разведенного образца GPI-заякоренных белков при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывки 5 раз PBST проводили реакцию со 100 мкл 1000-кратно разведенного HRP-меченого анти-Candida-антитела (ViroStat) при комнатной температуре в течение 2 часов, затем после промывки 5 раз PBST добавляли 75 мкл раствора субстрата. После остановки реакции измеряли оптическую плотность при 490 нм.

На фиг. 4 показано, что в присутствии вышеуказанного соединения (Ia) в концентрации от 0,1 до 0,39 мкг/мл количество антигена Als1p увеличивается во фракции супернатанта культуры и количество антигена снижается во фракции клеточных стенок. Таким образом, соединение, которое увеличивало количество Als1p в супернатанте культуры или уменьшало количество Als1p во фракции клеточных стенок, которое количественно оценивали посредством ELISA, по сравнению с количеством Als1p в C. albicans, необработанных соединением, считали соединением, которое ингибирует процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке у C. albicans.

Пример A5. Исследование клеточной стенки C. albicans, культивируемого в присутствии тестируемого образца, с помощью электронного микроскопа.

C. albicans, который культивировали в жидкой среде с декстрозой Sabouraud (5 мл), содержащей разные концентрации тестируемого агента, при 30°С в течение 48 часов, затем центрифугировали и собирали, иммобилизовали способом иммобилизации на основе перманганата калия и исследовали его изображение с помощью трансмиссионного электронного микроскопа.

Исследовали гифовую фибриллярную структуру с высокой электронной плотностью в самом наружном слое клетки и считали эту структуру поверхностным слоем гликопротеидов, содержащим в качестве составной части GPI-заякоренный белок. На указанную гифовую фибриллярную структуру не влияли другие существующие противогрибковые агенты.

У C. albicans, культивированного в присутствии вышеуказанного соединения (Ia), гифовая фибриллярная структура самого наружного слоя клетки, имеющего высокую электронную плотность, исчезала, оставляя небольшое количество слоя с высокой электронной плотностью, по сравнению с таковым в необработанных клетках. Таким образом, в том случае, когда гифовая фибриллярная структура самого наружного слоя клетки грибка, имеющего высокую электронную плотность, исчезает, тестируемый образец считают соединением, влияющим на процесс, посредством которого GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

Пример A6. Скрининг гена резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) S. cerevisiae.

Плазмидную библиотеку генов S. cerevisiae получали из ATCC (регистрационный номер ATCC: 37323).

Штамм G2-10 S. cerevisiae культивировали при встряхивании в 10 мл среды YPD при 30°С и клетки собирали в поздней логарифмической фазе роста (1-2 x 10⁷ клеток/мл). После промывки клеток стерильной водой вводили плазмидную библиотеку генов S. cerevisiae способом на основе ацетата лития, при котором используют систему трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM (Clontech) (согласно руководству для пользователей системой трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM), и полученные клетки высевали на планшет SD(Leu^-), получая примерно 80000 колоний. Колонии собирали, разводили и высевали на планшет SD(Leu^-), содержащий вышеуказанное соединение (Ia) в концентрации 1,56 и 3,125 мкг/мл, так, чтобы было 570000 колоний на планшет. Затем получали резистентный клон, инкубируя при 37°С в течение 72 часов.

Когда отобрали 27 клонов и собрали плазмиды способом согласно Methods in Enzymology, Vol. 194: 169-182 (1991), и проанализировали вставки, все 27 содержали один и тот же фрагмент.

В результате определения нуклеотидной последовательности с использованием системы ABI377 (PE Applied Biosystems) обнаружили, что ДНК SEQ ID NO: 1 является ДНК, которая придает резистентность к вышеуказанному соединению (Ia), и назвали ее GWT1.

Пример A7. Саузерн-блот-анализ гена C. albicans - гомолога гена GWT1 S. cerevisiae.

Образец получали обработкой 25 мкг геномной ДНК C. albicans EcoRI (TaKaRa), HindIII (TaKaRa), BamHI (TOYOBO) или PstI (New England Biolabs) (включая комбинацию 2 типов ферментов) в течение 16 часов, затем концентрированием при осаждении этанолом и растворением в 25 мкл стерильной воды. 25 мкг геномной ДНК, расщепленной ферментами рестрикции, разделяли электрофорезом в 0,75% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (GeneScreen PLUS /NEN).

Зонд получали мечением 20 нг фрагмента ДНК SEQ ID NO: 1 длиной примерно 1,5 т.п.н. альфа33P-dCTP способом с использованием случайного праймера и очищали, используя колонку GeneQuant (Amersham-Pharmacia).

Гибридизацию выполняли вымачиванием мембраны в 10 мл раствора PerfectHyb^TM (TOYOBO), предварительной инкубацией при 65°С в течение 1 часа, затем добавлением указанного выше меченого зонда и инкубированием при 65°С в течение 2,5 часов. Промывку осуществляли 1) раствором 2 x SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 5 минут, 2) раствором 2 x SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 15 минут и 3) раствором 0,1 x SSC, 0,1% SDS при 50°С в течение 20 минут. Промытую мембрану покрывали Saran Wrap и подвергали контактированию с воспроизводящей платиной (FUJI) в течение 12 часов при комнатной температуре, изображение, перенесенное на воспроизводящую пластину, фиксировали, используя BAS2000 (FUJI), и изображение анализировали.

В результате наблюдали единичные полосы в области 6,5 т.п.н. в случае с EcoRI, 4,0 т.п.н. с HindIII, 2,0 т.п.н. с EcoRI-HindIII и 2,5 т.п.н. с EcoRI-PstI (фиг. 5), и предположили, что гомолог гена резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) C. albicans существует в виде единственного гена.

Пример A8. Скрининг гена резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) C. albicans.

Геномную библиотеку C. albicans получали способом согласно Navaro-Garcia F et al, Mol. Cell Biol., 15: 2197-2206, 1995. В частности, геномную ДНК C. albicans частично расщепляли Sau3AI, затем собирали фрагменты ДНК приблизительно от 3 до 5 и встраивали их в BamHI-сайт челночного вектора YEp352.

Штамм G2-10 S. cerevisiae культивировали при встряхивании в 10 мл среды YPD при 30°С и клетки собирали в поздней логарифмической фазе роста (2-5 x 10⁷ клеток/мл). После промывки клеток стерильной водой вводили геномную библиотеку C. albicans способом на основе ацетата лития, при котором используют систему трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM (Clontech) (согласно руководству для пользователей системой трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM), и полученные клетки высевали на планшет SD(Leu^-) и получали примерно 25000 колоний. Колонии собирали, разбавляли и высевали на планшет SD, содержащий вышеуказанное соединение (Ia) в концентрации 1,56 мкг/мл, так, чтобы было 500000 колоний на планшет. Затем получали резистентные клоны, инкубируя при 30°С в течение 6 часов, и затем перемещали в 37°С и инкубировали в течение 66 часов.

Когда отобрали 30 клонов и собрали плазмиды способом согласно Methods in Enzymology, Vol. 194: 169-182 (1991), и проанализировали вставки, 28 из 30 содержали один и тот же фрагмент.

В результате определения нуклеотидной последовательности с использованием системы ABI377 (PE Applied Biosystems) обнаружили, что ДНК SEQ ID NO: 3 является ДНК, которая придает резистентность к вышеуказанному соединению (Ia).

Пример A9. Клонирование гомолога гена резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) из клинического изолята C. albicans.

ПЦР-амплификацию выполняли, используя в качестве матрицы геномную ДНК, которую очищали из клинического изолята C. albicans, который хранится авторами изобретения, и в качестве праймеров SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. Фрагмент ДНК длиной примерно 1,6 т.п.н. амплифицировали из всех трех независимых образцов ПЦР, амплифицированные фрагменты очищали, субклонировали в векторе pT7-Blue (Novagen) и определяли нуклеотидную последовательность, и таким образом обнаружили последовательность ДНК SEQ ID NO: 5. Последовательность отличалась в трех положениях по сравнению с ДНК примера A7 (SEQ ID NO: 3).

Кроме того, обнаружили нуклеотидную последовательность гена C. albicans, определенную в Stanford University Sequence Center (http://sequence-www.stanford.edu), гомолог ДНК примера A7 (SEQ ID NO: 7) и последовательность отличалась по четырем положениям по сравнению с ДНК примера A7 (SEQ ID NO: 3).

Пример A10. Конструирование S. cerevisiae, сверхэкспрессирующего продукт гена GWT1.

ПЦР-амплификацию выполняли, используя в качестве матрицы плазмиду, очищенную из клона, резистентного к вышеуказанному соединению (Ia), полученного в примере A6, и в качестве праймеров SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24. Продукт ПЦР, расщепленный PvuII, встраивали в сайт расщепления SalI-HindIII pRLW63T, полученной в примере A1. Полную вставку вырезали BamHI-KpnI и встраивали в MCS (сайт множественного клонирования) pRS304 (Sikorski RS et al, Genetics. 122(1): 19-27, 1989), чтобы получить вектор для интеграции.

Штамм CW63 S. cerevisiae, имеющий в качестве репортерного гена ген цефалоспориназы, культивировали способом согласно примеру A1, TRP1 интегрирующего вектора расщепляли EcoRV и затем выполняли трансформацию способом примера A1. Штамм, сверхэкспрессирующий GWT1 (S. cerevisiae, штамм CW63/GWT1), получали культивированием в среде SD(Trp^-) при 30°С в течение 3 дней.

Кроме проявления резистентности к вышеуказанному соединению (Ia), штамм, сверхэкспрессирующий GWT1, ничем не отличался от штамма дикого типа и был чувствителен по отношению к другим противогрибковым агентам, циклогексимиду, беномилу и амфотерицину B.

Пример A11. Конструирование мутанта S. cerevisiae, у которого отсутствует ген GWT1.

Кассету His5, содержащую последовательность GWT1 на обоих концах, амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы ген his5 S. pombe (Longtine MS et al, Yeast, 14: 953-961, 1998) и в качестве праймеров SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.

Культивировали S. cerevisiae G2-10, собирали клетки способом согласно примеру A1 и трансформировали вышеуказанным продуктом ПЦР способом согласно примеру A1. GWT1-дефицитный штамм получали культивированием в среде SD(His^-) при 30°С в течение от 5 до 7 дней.

Несмотря на то, что GWT1-дефицитный штамм проявлял очень медленный рост, было сделано предположение, что вышеуказанное соединение (Ia) не влияет на рост, и продукт гена GWT1 является мишенью соединения. Кроме того, GWT1-дефицитный штамм показал следующие характеристики: он не может расти при высоких температурах; клетки набухшие и при исследовании трансмиссионным электронным микроскопом гифовая фибриллярная структура самого наружного слоя клетки грибка, имеющая высокую электронную плотность, исчезла.

Пример A12. Активность вышеуказанного соединения (Ia) в S. cerevisiae, сверхэкспрессирующих продукт гена GWT1.

Используя штамм CW63 S. cerevisiae и CW63/GWT1 S. cerevisiae с введенным геном GWT1, исследовали активность вышеуказанного соединения (Ia) способом, соответствующим способу, описанному в примере A2.

В результате даже при концентрации (от 0,39 до 1,56 мкг/мл) вышеуказанного соединения (Ia), при которой в штамме CW63 S. cerevisiae увеличивается активность цефалоспориназы во фракции супернатанта культуры и снижается активность во фракции клеточных стенок, не наблюдали влияния в штамме S. cerevisiae CW63/GWT1 и даже при концентрации (> 3,13 мкг/мл) вышеуказанного соединения (Ia), при которой ингибируется рост штамма S. cerevisiae CW63, не наблюдали ингибирования роста штамма S. cerevisiae CW63/GWT1 (фиг. 6).

Пример A13. Синтез (4-бутилфенил)-(1-изохинолил)кетона.

В атмосфере азота 1-бром-4-бутилбензол (2,29 мл, 13,0 ммоль) добавляли к смеси раствора магния (338 мг, 13,9 ммоль) и тетрагидрофурана (6,5 мл), в качестве инициатора добавляли каталитическое количество 1,2-дибромэтана и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 10 минут. Раствор охлаждали до 0°С, добавляли тетрагидрофурановый раствор 1-изохинолинкарбонитрила (1,0 г, 6,49 ммоль) и перемешивали еще в течение 1 часа при комнатной температуре и при 70°С в течение 3 часов. Затем раствор снова охлаждали до 0°С, добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту (2,56 мл) и метанол (11 мл) и затем кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. Концентрированный остаток растворяли в 5 N гидроксиде натрия и толуоле и фильтровали через целит. Толуольный слой фильтрата отделяли, промывали водой, сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая 1,72 г указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,93 (3H, т), 1,32-1,43 (2H, м), 1,58-1,66 (2H, м), 2,68 (2H, т), 7,28 (2H, д), 7,61 (1H, тд), 7,74 (1H, тд), 7,80 (1H, д), 7,87 (2H, д), 7,92 (1H, д), 8,20 (1H, д), 8,60 (1H, д).

Пример A14. Синтез {1-(4-бутилбензил)изохинолина}, вышеуказанного соединения формулы (Ia).

Соединение примера A13 (1,72 г; 5,95 ммоль), моногидрат гидразина (836 мг; 16,7 ммоль) и гидроксид калия (769 мг; 13,7 ммоль) добавляли к диэтиленгликолю (8,5 мл) и перемешивали при 80°С в течение 1 часа, при 160°С в течение 3 с половиной часов и при 200°С в течение 1 часа. После охлаждения до комнатной температуры добавляли ледяную воду и экстрагировали этилацетатом. Полученный экстракт промывали водой, затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая 914 мг вышеуказанного соединения формулы (Ia).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,36 (2H, м), 1,50-1,59 (2H, м), 2,53 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,53 (1H, тд), 7,56 (1H, д), 7,64 (1H, тд), 7,81 (1H, д), 8,18 (1H, дд,), 8,50 (1H, д).

Пример A15. Другой способ получения {1-(4-бутилбензил)изохинолина}, вышеуказанного соединения формулы (Ia).

К 60% раствору (1,8 мл) гидрида натрия (16 мг, 0,40 ммоль) в диметилформамиде по каплям в атмосфере азота при -16°С добавляли раствор (3,6 мл) 1-циано-2-бензоил-1,2-дигидроизохинолина (100 мг, 0,38 ммоль), синтезированного согласно способу, описанному в литературе, Org. Synth., VI, 115 (1988), и 4-н-бутилбензилхлорида (70 мг, 0,38 ммоль) в диметилформамиде и далее перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляли воду, затем концентрировали и к полученному остатку добавляли толуол и воду. Толуольный слой промывали водой, сушили над карбонатом калия и концентрировали. К раствору остатка в этаноле (1,6 мл) добавляли 50% водный раствор гидроксида натрия (0,63 мл) и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. После концентрирования добавляли толуол и воду. Толуольный слой промывали водой, затем сушили над карбонатом кальция и затем концентрировали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая 18 мг вышеуказанного соединения формулы (Ia).

Пример A16. Клонирование гомолога C. albicans гена GWT1 S. cerevisiae.

Геномную ДНК C. albicans (25 мкг), обработанную HindIII (TaKaRa) в течение 16 часов, разделяли способом электрофореза в 0,75% агарозном геле и фрагменты ДНК, имеющие размер в пределах примерно 3,5-4,5 т.п.н., извлекали из геля. Извлеченные фрагменты ДНК встраивали в HindIII-сайт вектора pKF3 (TaKaRa) и получали геномную библиотеку Candida.

Используя полученную библиотеку, получали дисплей примерно из 10000 колоний на планшете с LB/ампициллином, колонии снимали, используя мембрану для скрининга колоний/бляшек (NEN), и затем подвергали гибридизации. Зонд получали мечением 20 нг фрагмента ДНК SEQ ID NO: 1 длиной примерно 1,5 т.п.н. альфа-³³P-dCTP способом со случайным праймером и очисткой с использованием колонки GeneQuant (Amersham-Pharmacia).

Гибридизацию выполняли путем предварительной инкубации мембраны в растворе PerfectHyb^TM (TOYOBO) при 65°С в течение 1 часа, затем добавлением указанного выше меченого зонда и дальнейшей инкубацией при 65°С в течение 2,5 часов. Промывку проводили (i) раствором 2 x SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 5 минут, (ii) раствором 2 x SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 15 минут и (iii) раствором 0,1 x SSC, 0,1% SDS при 50°С в течение 20 минут. Промытую мембрану покрывали Saran Wrap, осуществляли контакт с рентгеновской пленкой (KONICA) в течение 24 часов при комнатной температуре и затем проявляли. Выделяли колонии E. coli, соответствующие экспонированным пятнам, и подвергали вторичному скринингу. На каждом планшете с LB/ампициллином создавали дисплей примерно из 200 выделенных колоний, снятие колоний выполняли аналогичным образом, как при первичном скрининге, после чего проводили гибридизацию. Условия гибридизации были такими же, как условия при первичном скрининге.

В результате выделили единственную колонию E. coli, которая интенсивно реагировала с зондом. Из полученной колонии собрали плазмиды и после того как определили находящуюся в них последовательность, обнаружили новую последовательность, имеющую такую же последовательность, которая была выявлена в примере A9 (SEQ ID NO: 5) (последовательность GWT1 Candida), и сделали вывод, что она представляет собой гомолог C. albicans.

Пример A17. Гомолог S. pombe гена GWT1 S. cerevisiae.

Гены S. pombe, которые проявляют гомологию с геном GWT1 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 27 и аминокислотная последовательность продукта данного гена: SEQ ID NO: 28), обнаружили при поиске в базе данных и сделали вывод, что они являются гомологами S. pombe гена GWT1.

Пример A18. Клонирование гомолога Aspergillus fumigatus гена GWT1 S. cerevisiae.

Посредством анализа генетических последовательностей авторы изобретения обнаружили две высоко консервативные области в белке, кодируемом генами GWT1 S. cerevisiae, S. pombe и C. albicans (фиг. 7). На основе предполагаемой ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность указанной консервативной области, сконструировали праймеры SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31. ПЦР-амплификацию выполняли, используя в качестве матрицы 1 мкл библиотеки, приобретенной в STRATAGENE (библиотека кДНК Aspergillus fumigatus: №937053), и используя праймеры SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 31. Кроме того, в результате проведения гнездовой ПЦР с использованием в качестве матрицы 1 мкг указанного амплифицированного образца и с использованием праймеров SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 подтвердили амплификацию единственного фрагмента длиной примерно 250 п.н. Когда определили последовательность данного фрагмента, получили новую последовательность, обладающую гомологией с геном GWT1 S. cerevisiae, показанную в SEQ ID NO: 32, и сделали вывод о том, что она является гомологом A. fumigatus.

Чтобы получить полноразмерную кДНК, сконструировали праймеры SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34 на основе последовательности амплифицированного фрагмента. Кроме того, сконструировали праймеры с внешней стороны места встраивания гена в библиотеке, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36. В результате выполнения ПЦР с использованием в качестве матрицы библиотеки кДНК A. fumigatus и набора праймеров SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 35 или набора праймеров SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 36 подтвердили амплификацию фрагмента ДНК длиной примерно 1 т.п.н. (с обоими наборами праймеров). В результате определения нуклеотидных последовательностей указанных фрагментов получили новую последовательность, которая высоко гомологична генам GWT1 S. cerevisiae, показанным в SEQ ID NO: 1. Так как последовательность в высокой степени гомологична генам GWT1 S. cerevisiae, S. pombe и C. albicans на протяжении всего гена, было строго показано, что данная последовательность является гомологом A. fumigatus.

Чтобы клонировать полный гомолог A. fumigatus, на основании полученной последовательности заново сконструировали праймер, показанный в SEQ ID NO: 37, который соответствует последовательности, расположенной выше кодона инициации, и праймер SEQ ID NO: 38, который соответствует последовательности, расположенной ниже стоп-кодона. В результате проведения 35 циклов ПЦР с использованием в качестве матриц библиотеки кДНК A. fumigatus (STRATAGENE) и геномной библиотеки A. fumigatus (STRATAGENE) и праймеров SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 выявили единственный амплифицированный фрагмент длиной примерно 1,6 т.п.н. при использовании обеих матриц. В результате определения нуклеотидной последовательности полученного фрагмента прямым секвенированием в библиотеке кДНК обнаружили нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 39, и показали, что она кодирует белок, содержащий 501 аминокислоту, показанный в SEQ ID NO: 40. Кроме того, в геномной библиотеке обнаружили нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 41 и обнаружили, что в одном положении она имеет интрон, содержащий 77 пар оснований.

Пример A19. Клонирование гомолога Cryptococcus гена GWT1 S. cerevisiae.

1) Поиск в базе данных.

В результате поиска генов, проявляющих гомологию с геном GWT1 S. cerevisiae, в базе данных обнаружена последовательность 502042C05.x1 на сервере Genome Center, Stanford University (http://baggage.stanford.edu/cgi-misc/cneoformans/). Кроме того, обнаружена последовательность b6e06cn.f1 на сервере Oklahoma University, USA (http://www.genome.ou.edu/cneo_blast. html).

2) ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК.

Праймер SEQ ID NO: 42 конструировали на основе последовательности 502042C05.x1 и праймер SEQ ID NO: 43 конструировали на основе последовательности b6e06cn.f1. В том случае, когда ПЦР-амплификацию выполняли с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Cryptococcus (Cryptococcus neoformans) и с использованием праймера SEQ ID NO: 42 и праймера SEQ ID NO: 43, выявили амплифицированный фрагмент длиной примерно 2 т.п.н. Когда определили нуклеотидную последовательность указанного фрагмента, получили новую последовательность, проявляющую гомологию с геном GWT1 S. cerevisiae, показанную в SEQ ID NO: 44.

Для того чтобы получить последовательность, расположенную выше кодона инициации гена GWT1 Cryptococcus, сконструировали праймер SEQ ID NO: 45 на основе последовательности 502042C05.x1 и праймер SEQ ID NO: 46 сконструировали на основе последовательности SEQ ID NO: 44. После проведения ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Cryptococcus и с использованием праймера SEQ ID NO: 45 и праймера SEQ ID NO: 46 выявили амплифицированный фрагмент длиной примерно 500 п.н. После определения нуклеотидной последовательности данного фрагмента получили последовательность SEQ ID NO: 47 и обнаружили, что она перекрывается с SEQ ID NO: 44.

3) 3'-RACE.

Чтобы получить 3'-концевую последовательность гена GWT1 Cryptococcus, выполняли 3'-RACE. Обратную транскрипцию проводили с помощью праймирования адаптером - праймером SEQ ID NO: 48, на основе 16 мкг общей РНК, экстрагированной из Cryptococcus, и с использованием обратной транскриптазы SuperScript II (GIBCO/BRL) и получили одноцепочечную кДНК, которая должна стать матрицей для ОТ-ПЦР, следующей далее. В результате выполнения 35 циклов ПЦР с использованием в качестве матрицы одноцепочечной кДНК и праймеров SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50 обнаружили амплифицированный фрагмент длиной примерно 1,2 т.п.н. При анализе нуклеотидной последовательности указанного фрагмента способом прямого секвенирования получена новая последовательность, показанная в SEQ ID NO: 51, проявляющая гомологию с геном GWT1 S. cerevisiae.

4) ПЦР полноразмерной геномной ДНК.

Используя праймер SEQ ID NO: 52, который сконструировали на основе SEQ ID NO: 47, и праймер SEQ ID NO: 53, который сконструировали на основе SEQ ID NO: 51, выполняли 35 циклов ПЦР на трех независимых препаратах геномной ДНК Cryptococcus в качестве матрицы. В результате во всех трех независимых пробирках выявили амплифицированный фрагмент длиной примерно 2 т.п.н. и поэтому каждый из них отдельно подвергали прямому секвенированию и определяли полные нуклеотидные последовательности указанных фрагментов. В результате три независимые последовательности полностью совпадали, и получили последовательность, содержащую полноразмерный гомолог гена GWT1 Cryptococcus, показанный в SEQ ID NO: 54.

5) Определение последовательности кДНК.

Сравнение последовательности гена GWT1 Cryptococcus, полученной из генома, показанной в SEQ ID NO: 54, с последовательностью кДНК 51, полученной посредством 3'-RACE, свидетельствовало о наличии интронов в двух положениях. Кроме того, предположили наличие еще одного интрона, так как открытая рамка считывания после кодона инициации ATG не является непрерывной. Поэтому рассчитали структуру кДНК на основе предполагаемой аминокислотной последовательности и донорно-акцепторной последовательности сплайсинга и сконструировали праймеры SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56 в положении, рассчитанном как место соединения между экзонами. В результате выполнения 35 циклов ПЦР с использованием в качестве матрицы одноцепочечной кДНК, полученной от Cryptococcus, с вышеуказанными праймерами подтвердили наличие амплифицированного фрагмента длиной примерно 1,4 т.п.н. В результате определения нуклеотидной последовательности при проведении прямого секвенирования фрагмента получили последовательность SEQ ID NO: 57 и при сравнении с SEQ ID NO: 54 показали, что последовательность кДНК гена GWT1 Cryptococcus имеет структуру SEQ ID NO: 58. Так как последовательность проявляет высокую степень гомологии в определенных областях с генами GWT1 S. cerevisiae, S. pombe, C. albicans и A. fumigatus, получили строгое свидетельство того, что указанная последовательность является гомологом Cryptococcus.

Пример A20. Генетическая мутация, которая придает резистентность к вышеуказанному соединению формулы (Ia).

Штамм S. cerevisiae LW63, имеющий в качестве репортерного гена ген лизоцима вследствие введения pRLW63T, обрабатывали этилметансульфонатом, затем при культивировании в среде SD, содержащей вышеуказанное соединение формулы (Ia) в концентрациях 1,56, 3,13 и 6,25 мкг/мл, при 37°С в течение 3 дней получили пять резистентных мутантных штаммов (R1-R5). Было обнаружено, что среди них мутантный штамм R1 и мутантный штамм R5 обладают приобретенным специфичным свойством резистентности к вышеуказанному соединению формулы (Ia) вследствие мутации единственного гена. Чтобы подтвердить, имеют ли или не имеют два указанных мутантных штамма мутации в гене GWT1, экстрагировали геномные ДНК из обоих мутантных штаммов и определяли нуклеотидную последовательность части гена GWT1. В результате в мутантном штамме R1 гуанин в положении 1213 был мутирован в аденин. Кроме того, в мутантном штамме R5 гуанин в положении 418 был мутирован в аденин. Следовательно, было выяснено, что в мутантном штамме R1 405-я аминокислота изолейцин была заменена на валин, а в мутантном штамме R5 140-я аминокислота глицин была заменена на аргинин.

Затем, чтобы проверить, вызывают ли указанные мутации или не вызывают приобретение свойства специфичной резистентности к вышеуказанному соединению формулы (Ia), выделяли мутантный ген GWT1 (R1 или R5), используя в качестве матрицы геномные ДНК, полученные из обоих мутантных штаммов, и праймеры SEQ ID NOS: 60 и 61. Одновременно выделяли промоторный участок GWT1 (SEQ ID NO: 62) и терминаторный участок (SEQ ID NO: 63), промотор гена GWT1, ORF мутантного гена GWT1 и терминатор гена GWT1 встраивали в вектор pRS316 и конструировали плазмиды, которые экспрессируют единственную копию мутантного гена GWT1 (pRS316GWT1-R1, pRS316GWT1-R5). Плазмиды вводили в диплоидный штамм (WDG1), в котором нарушена только одна копия гена GWT1. Получали споры культивированием колоний на среде для споруляции и клон, в котором нарушен ген GWT1 в хромосоме и который также несет вышеуказанную плазмиду, получали, выполняя тетрадный анализ. При культивировании клона в среде, содержащей вышеуказанное соединение формулы (Ia), наблюдали резистентность к вышеуказанному соединению формулы (Ia), подобно исходному мутантному штамму R1 и мутантному штамму R5. На основе указанного выше выяснили, что свойство специфичной резистентности к вышеуказанному соединению формулы (Ia) придает точечная мутация, сопровождаемая мутацией аминокислоты, которая происходит в гене GWT1, и строго показали, что данное соединение ингибирует функцию белка GWT1 посредством прямого связывания с белком.

[Пример B]

Соединения согласно данному изобретению, например, можно получить способом, описанным ниже в примерах. Однако примеры приведены исключительно в целях иллюстрации, и соединения согласно данному изобретению ни в коем случае не следует считать ограниченными соединениями, полученными в следующих конкретных примерах.

Пример B1

1-(Хлорметил)-4-н-бутилбензол

Тионилхлорид (2,5 мл, 34 ммоль) добавляли к раствору 4-н-бутилбензилового спирта (2,0 г, 12 ммоль) в эфире (25 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. После концентрирования смеси избыток тионилхлорида удаляли азеотропной перегонкой с бензолом, получая указанное в заголовке соединение (2,3 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без очистки.

Пример B2

1-(4-Бутилбензил)изохинолин

Раствор 1-циано-2-бензоил-1,2-дигидроизохинолина (100 мг, 0,38 ммоль), который синтезировали согласно Org. Synth., VI, 115 (1988), и 4-н-бутилбензилхлорида (70 мг, 0,38 ммоль) в диметилформамиде (3,6 мл) по каплям добавляли к 60% раствору гидрида натрия (16 мг, 0,40 ммоль) в диметилформамиде (1,8 мл) в атмосфере азота при -16°С и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляли воду, смесь концентрировали при пониженном давлении, к остатку добавляли толуол и воду. Толуольный слой промывали водой, сушили над карбонатом калия, затем концентрировали при пониженном давлении. К раствору остатка в этаноле (1,6 мл) добавляли 50% водный раствор гидроксида натрия (0,63 мл). Полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов и концентрировали, а затем добавляли толуол и воду. Толуольный слой промывали водой, сушили над карбонатом кальция, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (18 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,36 (2H, м), 1,50-1,59 (2H, м), 2,53 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,53 (1H, тд), 7,56 (1H, д), 7,64 (1H, тд), 7,81 (1H, д), 8,18 (1H, дд), 8,50 (1H, д).

Пример B3

(4-Бутилфенил)(1-изохинолил)кетон

1-Бром-4-бутилбензол (2,29 мл, 13 ммоль) и каталитическое количество 1,2-дибромэтана в качестве инициатора добавляли к смешанному раствору магния (338 мг, 14 ммоль) и тетрагидрофурана (6,5 мл) в атмосфере азота и полученную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 10 минут. Смесь охлаждали до 0°С, добавляли раствор 1-изохинолинкарбонитрила (1,0 г, 6,5 ммоль) в тетрагидрофуране и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем при 70°С в течение 3 часов. После этого смесь снова охлаждали до 0°С, добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту (2,6 мл) и метанол (11 мл) и полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. После концентрирования смеси остаток растворяли в 5 N гидроксиде натрия и толуоле и фильтровали через целит. Толуольный слой фильтрата отделяли, промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (1,7 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,93 (3H, т), 1,32-1,43 (2H, м), 1,58-1,66 (2H, м), 2,68 (2H, т), 7,28 (2H, д), 7,61 (1H, тд), 7,74 (1H, тд), 7,80 (1H, д), 7,87 (2H, д), 7,92 (1H, д), 8,20 (1H, д), 8,60 (1H, д).

Пример B4

Альтернативный способ получения 1-(4-бутилбензил)изохинолина

Соединение примера B3 (1,7 г, 6,0 ммоль), моногидрат гидразина (836 мг, 17 ммоль) и гидроксид калия (769 мг, 14 ммоль) добавляли к диэтиленгликолю (8,5 мл) и полученную смесь перемешивали при 80°С в течение 1 часа, при 160°С в течение 3,5 часов, затем при 200°С в течение 1 часа. Смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли ледяную воду и смесь экстрагировали этилацетатом. Экстракт промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (914 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,36 (2H, м), 1,50-1,59 (2H, м), 2,53 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,53 (1H, тд), 7,56 (1H, д), 7,64 (1H, тд), 7,81 (1H, д), 8,18 (1H, дд), 8,50 (1H, д).

Пример B5

1-(4-Этилбензил)изохинолин

Используя п-этилбензилхлорид, указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,18 (3H, т), 2,57 (2H, кв), 4,64 (2H, с), 7,08 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,50-7,55 (2H, м), 7,61-7,65 (1H, м), 7,80 (1H, д), 8,16-8,18 (1H, м), 8,49 (1H, д).

Пример B6

(4-Пропилфенил)метанол

Раствор борогидрида натрия (2,9 г, 76 ммоль) и концентрированной серной кислоты в эфире (полученной добавлением 2,0 мл концентрированной серной кислоты к 4,0 мл эфира) по каплям добавляли к охлажденному до 0°С раствору п-н-пропилбензойной кислоты (5,0 г, 32 ммоль) в тетрагидрофуране (20 мл), поддерживая температуру реакционной системы ниже 20°С, и затем полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. После охлаждения смеси на льду добавляли метанол и 1 N гидроксид натрия и полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (4,33 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без очистки.

Пример B7

1-(Хлорметил)-4-пропилбензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B6 таким же способом, как в примере B1. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дальнейшей очистки.

Пример B8

1-(4-Пропилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B7 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,55-1,61 (2H, м), 2,51 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,51-7,55 (2H, м), 7,61-7,65 (1H, м), 7,81 (1H, д), 8,17 (1H, дд), 8,49 (1H, д).

Пример B9

(4-Пентилфенил)метанол

Указанное в заголовке соединение получали восстановлением 4-н-амилбензойной кислоты таким же способом, как в примере B6.

Пример B10

1-(Хлорметил)-4-пентилбензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B9 таким же способом, как в примере B1. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B11

1-(4-Пентилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B10 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,86 (3H, т), 1,26-1,33 (4H, м), 1,52-1,59 (2H, м), 2,52 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,50-7,55 (2H, м), 7,61-7,65 (1H, м), 7,80 (1H, д), 8,17 (1H, дд), 8,49 (1H, д).

Пример B12

1-(Гексилфенил)метанол

Указанное в заголовке соединение получали восстановлением 4-н-гексилбензойной кислоты таким же способом, как в примере B6. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B13

1-(Хлорметил)-4-гексилбензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B12 таким же способом, как в примере B1. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B14

1-(4-Гексилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B13 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,86 (3H, т), 1,26-1,31 (6H, м), 1,51-1,58 (2H, м), 2,52 (2H, т), 4,63 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,50-7,55 (2H, м), 7,61-7,65 (1H, м), 7,80 (1H, д), 8,17 (1H, дд), 8,49 (1H, д.

Пример B15

1-(4-Изопропилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой п-изопропилбензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,19 (6H, д), 2,80-2,87 (1H, м), 4,64 (2H, с), 7,11 (2H, д), 7,21 (2H, д), 7,51-7,56 (2H, м), 7,61-7,65 (1H, м), 7,81 (1H, д), 8,19 (1H, дд), 8,50 (1H, д).

Пример B16

1-[4-(трет-Бутил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 4-трет-бутилбензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,26 (9H, с), 4,64 (2H, с), 7,22 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,52-7,56 (2H, м), 7,62-7,66 (1H, м), 7,81 (1H, д), 8,19 (1H, дд), 8,50 (1H, д).

Пример B17

(4-Изобутилфенил)метанол

Указанное в заголовке соединение получали восстановлением 4-изобутилбензойной кислоты таким же способом, как в примере B6. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B18

1-(Хлорметил)-4-изобутилбензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B17 таким же способом, как в примере B1. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B19

1-(4-Изобутилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B18 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,86 (6Н, д,), 1,75-1,83 (1Н, м), 2,39 (2Н, д), 4,66 (2Н, с), 7,02 (2Н, д), 7,18 (2Н, д), 7,52-7,58 (2Н, м), 7,63-7,67 (1Н, м), 7,82 (1Н, д), 8,18 (1Н, д), 8,50 (1Н, д).

Пример B20

1-(Хлорметил)-4-(трифторметил)бензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 4-трифторметилбензилового спирта таким же способом, как в примере B1. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B21

1-[4-(Трифторметил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В20 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,73 (2H, с), 7,39 (2H, д), 7,51 (2H, д), 7,54-7,60 (2H, м), 7,65-7,69 (1H, м), 7,84 (1H, д), 8,09-8,10 (1H, м), 8,51 (1H, д).

Пример B22

1-(Хлорметил)-4-(трифторметокси)бензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 4-трифторметоксибензилового спирта таким же способом, как в примере B1. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B23

1-[4-(Трифторметокси)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В22 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,67 (2H, с), 7,10 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,54-7,59 (2H, м), 7,64-7,68 (1H, м), 7,84 (1H, д), 8,11 (1H, дд), 8,50 (1H, д).

Пример В24

1-(Хлорметил)-2-иодбензол

Метансульфонилхлорид (2,0 мл; 29 ммоль) и триэтиламин (3,6 мл; 26 ммоль) добавляли к раствору о-иодбензилового спирта (5,0 г; 21 ммоль) в метиленхлориде (50 мл), охлажденном до 0°С, и смесь перемешивали при этой температуре в течение 19 часов. Добавляли 5% водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную в результате смесь экстрагировали метиленхлоридом. Метиленхлоридный слой сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (5,34 г).

Пример B25

1-(2-Иодбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В24 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,74 (2H, с), 6,81-6,84 (1H, м), 6,87-6,92 (1H, м), 7,11-7,15 (1H, м), 7,55-7,57 (1H, м), 7,60 (1H, д), 7,64-7,68 (1H, м), 7,83-7,86 (1H, м), 7,89-7,91 (1H, м), 8,00-8,02 (1H, м), 8,50 (1H, д).

Пример B26

1-[2-(2-Фенил-1-этинил)бензил]изохинолин

Раствор тетракис(трифенилфосфин)палладия (58 мг; 0,05 ммоль) и этинилбензола (204 мг; 2,0 ммоль) в пирролидине (1,5 мл) добавляли к раствору соединения примера В25 (345 мг; 1,07 ммоль) в пирролидине (1,5 мл) в атмосфере азота и смесь перемешивали при 80°С в течение 3 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, получая указанное в заголовке соединение (280 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,95 (2H, с), 6,98-7,06 (2H, м), 7,10-7,21 (2H, м), 7,31-7,35 (3H, м), 7,48-7,51 (3H, м), 7,57-7,65 (2H, м), 7,82 (1H, д), 8,25 (1H, д), 8,52 (1H, д).

Пример B27

1-(2-Фенилэтилбензил)изохинолин

Палладий на угле (10%, 230 мг) добавляли к раствору соединения примера В26 (280 мг; 0,88 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода (1 атм) в течение 3 часов. Катализатор удаляли фильтрованием и полученный фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, получая указанное в заголовке соединение (162 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,90-2,94 (2H, м), 3,07-3,10 (2H, м), 4,67 (2H, с), 6,80 (1H, д), 7,02-7,06 (1H, м), 7,15-7,30 (7H, м), 7,49-7,53 (1H, м), 7,58 (1H, д), 7,64-7,68 (1H, м), 7,84 (1H, д), 7,95 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B28

1-{2-[4-(Тетрагидро-2Н-2-пиранилокси)-1-бутинил]бензил}изохинолин

Раствор тетракис(трифенилфосфин)палладия (58 мг; 0,05 ммоль) и 2-(3-бутинилокси)тетрагидро-2Н-пирана (208 мг; 2,0 ммоль) в пирролидине (1,5 мл) добавляли к раствору соединения примера В25 (345 мг; 1,07 ммоль) в пирролидине (1,5 мл) в атмосфере азота и полученную смесь перемешивали в течение четырех дней при комнатной температуре и еще в течение 30 минут при 80°С. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, получая указанное в заголовке соединение (277 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,42-1,60 (4H, м), 1,64-1,68 (1H, м), 1,75-1,81 (1H, м), 2,76-2,80 (2H, м), 3,46-3,51 (1H, м), 3,60-3,66 (1H, м), 3,85-3,95 (2H, м), 4,64-4,66 (1H, м), 4,85 (2H, с), 6,95-6,98 (1H, м), 7,05-7,13 (2H, м), 7,44-7,46 (1H, м), 7,49-7,53 (1H, м), 7,56 (1H, д), 7,60-7,65 (1H, м), 7,80-7,82 (1H, м), 8,15-8,18 (1H, м), 8,49-8,51 (1H, м).

Пример B29

4-[2-(1-Изохинолилметил)фенил]-3-бутин-1-ол

После охлаждения соединения примера В28 (200 мг; 0,54 ммоль) до 0°С добавляли раствор хлористоводородной кислоты-метанола (10%, 5 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 15 минут. Добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, получая указанное в заголовке соединение (86 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,72 (2H, т), 3,53-3,60 (1H, шир.с), 3,85 (2H, т), 4,85 (2H, с), 7,12-7,15 (2H, м), 7,22-7,24 (1H, м), 7,42-7,44 (1H, м), 7,55-7,59 (2H, м), 7,63-7,67 (1H, м), 7,81 (1H, д), 8,30 (1H, м), 8,46 (1H, м).

Пример B30

4-[2-(1-Изохинолилметил)фенил]-1-бутанол

Палладий на угле (10%, 10 мг) добавляли к раствору соединения примера В29 (44 мг; 0,15 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода (1 атм) в течение 1 часа. После удаления катализатора фильтрованием фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, получая указанное в заголовке соединение (18 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,61-1,75 (4H, м), 2,33 (1H, шир.с), 2,77 (2H, т), 3,67 (2H, т), 4,70 (2H, с), 6,91 (1H, д), 7,02-7,06 (1H, м), 7,12-7,16 (1H, м), 7,19-7,21 (1H, м), 7,50-7,55 (1H, м), 7,57 (1H, д), 7,63-7,67 (1H, д), 7,83 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B31

1-Бром-2-(хлорметил)бензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой п-бромбензилового спирта таким же способом, как в примере B1.

Пример B32

1-(4-Бромбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В31 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,61 (2H, с), 7,14-7,16 (2H, м), 7,35-7,39 (2H, м), 7,52-7,58 (2H, м), 7,63-7,67 (1H, м), 7,82 (1H, д), 8,07-8,10 (1H, м), 8,49 (1H, д).

Пример B33

Этил-(Е)-3-[4-(изохинолилметил)фенил]-2-пропаноат

Трис(2-метилфенил)фосфин (20 мг; 0,067 ммоль), ацетат палладия (II) (7,5 мг; 0,034 ммоль) и триэтиламин (70 мкл; 0,50 ммоль) добавляли к раствору соединения примера В32 (100 мг; 0,34 ммоль) и винилпропионата (73 мкл; 0,67 ммоль) в диметилформамиде (1,0 мл) в атмосфере азота и полученную смесь перемешивали при 100°С в течение 4 часов. После охлаждения смеси до комнатной температуры добавляли воду и полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (74 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,32 (3H, т), 4,24 (2H, кв), 4,69 (2H, с), 6,36 (1H, д), 7,29 (2H, д), 7,42 (2H, д), 7,53-7,67 (4H, м), 7,83 (1H, д), 8,11-8,13 (1H, м), 8,50 (1H, д).

Пример B34

Этил-3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]пропаноат

Палладий на угле (10%, 20 мг) добавляли к раствору соединения примера В33 (71 мг; 0,22 ммоль) в метаноле (5 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение 5 часов. После удаления катализатора из реакционной смеси фильтрованием фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (52 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,20 (3H, т), 2,56 (2H, т), 2,88 (2H, т), 4,09 (2H, кв), 4,64 (2H, с), 7,09 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,51-7,57 (2H, м), 7,62-7,66 (1H, м), 7,82 (1H, д), 8,15 (1H, дд), 8,50 (1H, д).

Пример B35

3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-1-пропанол

Алюмогидрид лития (6 мг; 0,16 ммоль) добавляли к тетрагидрофурану (1,0 мл), охлажденному до 0°С, в атмосфере азота. Затем добавляли раствор соединения примера В34 (46 мг; 0,14 ммоль) в тетрагидрофуране (1,0 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при такой температуре в течение 3 часов. К реакционной смеси добавляли смешанный раствор метанола и воды (9:1; 1,0 мл), затем добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония, затем полученную смесь экстрагировали хлороформом. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (22 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,30-1,35 (1H, шир.с), 1,81-1,88 (2H, м), 2,64 (2H, т), 3,62-3,65 (2H, м), 4,64 (2H, с), 7,09 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,51-7,57 (2H, м), 7,62-7,66 (1H, м), 7,81 (1H, д), 8,16-8,18 (1H, м), 8,49 (1H, д).

Пример B36

1-Изохинолил(4-метоксифенил)кетон

4-Броманизол (15,3 мл; 122 ммоль) и каталитическое количество 1,2-дибромэтана в качестве инициатора добавляли к смешанному раствору магния (3059 мг; 125,8 ммоль) и тетрагидрофурана (20 мл) в атмосфере азота и полученную реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 45 минут. Смесь охлаждали до 0°С, в нее по каплям добавляли раствор 1-изохинолинкарбонитрила (10,78 г; 69,9 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали на льду, добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту (24 мл) и метанол (120 мл) и полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1,5 часов. После охлаждения на льду смесь доводили до рН 8 добавлением водного раствора гидроксида натрия, экстрагировали эфиром, промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (15, 87 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,88 (3H, с), 6,95 (2H, д), 7,61 (1H, дд), 7,74 (1H, дд), 7,76 (1H, д), 7,85 (2H, д), 8,17 (1H, дд), 8,60 (1H, д).

Пример B37

1-Изохинолил(4-метоксифенил)метанол

Борогидрид натрия (1855 мг) добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера В36 (8608 мг) в этаноле (170 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 35 минут. Затем добавляли борогидрид натрия (957 мг) и полученную реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 40 минут. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, добавляли воду и полученную смесь экстрагировали эфиром. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Полученное в заголовке соединение (7881 мг) использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 3,66 (3H, с), 6,30-6,32 (1H, шир.с), 6,81 (2H, д), 7,28 (2H, д), 7,54 (1H, дд), 7,68 (1H, дд), 7,76 (1H, д), 7,94 (1H, д), 8,37 (1H, д), 8,47 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B38

1-Изохинолил(4-метоксифенил)метилацетат

Уксусный ангидрид (20 мл) добавляли к раствору соединения примера В37 (7881 мг) в пиридине (100 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и подвергали азеотропной перегонке с толуолом. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (8,79 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,22 (3H, с), 3,76 (3H, с), 6,84 (2H, д), 7,39 (2H, д), 7,54 (1H, дд), 7,56 (1H, с), 7,60 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,19 (1H, д), 8,57 (1H, д).

Пример B39

1-(4-Метоксибензил)изохинолин

Палладий на угле (10%; 4,0 г) добавляли к раствору соединения примера В38 (8,79 г) в метаноле (150 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение 5,5 часов. Катализатор удаляли фильтрованием через целит и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (4,48 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,74 (3H, с), 4,61 (2H, с), 6,79 (2H, д), 7,21 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,16 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B40

4-(1-Изохинолилметил)фенол

Водный раствор бромистоводородной кислоты (47%, 40 мл) добавляли к соединению примера В39 (2185 мг) и полученную реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 14 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем охлаждали на льду, нейтрализовали 50% водным раствором гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный порошок промывали петролейным эфиром, получая указанное в заголовке соединение (1822 мг).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 4,48 (2H, с), 6,61 (2H, д), 7,07 (2H, д), 7,60 (1H, дд), 7,68 (1H, д), 7,71 (1H, дд), 7,92 (1H, д), 8,27 (1H, д), 8,41 (1H, д), 9,19 (1H, шир.с).

Пример B41

4-(1-Изохинолилметил)фенилтрифторметансульфонат

Ангидрид трифторметансульфоновой кислоты (0,55 мл) по каплям добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера В40 (513 мг) в пиридине (10 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут. После добавления льда реакционную смесь экстрагировали эфиром. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (546 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,69 (2H, с), 7,16 (2H, д), 7,35 (2H, д), 7,57 (1H, дд), 7,60 (1H, д), 7,68 (1H, дд), 7,85 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B42

1-[4-(2-Фенил-1-этинил)бензил]изохинолин

Фенилацетилен (53 мкл), ацетат палладия (9 мг), 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен (67 мг), иодид меди (I) (3 мг), хлорид лития (20 мг) и триэтиламин (50 мкл) добавляли к раствору соединения примера В41 (88 мг) в N,N-диметилформамиде (2,0 мл), который был дегазирован, помещали в атмосферу азота и полученную смесь перемешивали при 80°С в течение 8 часов. После охлаждения смеси до комнатной температуры добавляли воду и полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (53 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,69 (2H, с), 7,12-7,32 (3H, м), 7,25 (2H, д), 7,42 (2H, д), 7,43-7,52 (2H, м), 7,54 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,51 (1H, д).

Пример B43

1-(4-Фенетилбензил)изохинолин

Катализатор, палладий на угле, (10%, 20 мг) добавляли к раствору соединения примера В42 (45 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение 2 часов. Катализатор удаляли фильтрованием через целит и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (23 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,78-2,90 (4H, м), 4,64 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,10-7,20 (5H, м), 7,22 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,15 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B44

1-[4-(4-Фенил-1-бутинил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и 4-фенил-1-бутина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,65 (2H, т), 2,88 (2H, т), 4,68 (2H, с), 7,12-7,40 (9H, м), 7,50-7,70 (3H, м), 7,80-7,88 (1H, м), 8,00-8,10 (1H, м), 8,48-8,51 (1H, м).

Пример B45

1-[4-(4-Фенил-1-бутил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В44 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,55-1,80 (4H, м), 2,50-2,65 (4H, м), 4,68 (2H, с), 7,00-7,30 (9H, м), 7,52 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,15 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B46

1-{4-[4-(Тетрагидро-2Н-2-пиранилокси)-1-бутинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и 2-(3-бутинилокси)тетрагидро-2Н-пирана таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,48-1,90 (6H, м), 2,67 (2H, т), 3,49-3,55 (1H, м), 3,60 (1H, дд), 3,65-3,94 (2H, м), 4,66 (2H, с), 4,65-4,70 (1H, м), 7,14-7,20 (2H, м), 7,23-7,30 (2H, м), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B47

1-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-3-бутин-1-ол

Соединение примера В46 (1048 мг) растворяли в растворе 10% хлористоводородная кислота-метанол (50 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционную смесь охлаждали на льду, добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (666 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,65 (2H, т), 3,77 (2H, т), 4,65 (2H, с), 7,18 (2H, д), 7,29 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,07 (1H, д), 8,49 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B48

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-1-бутанол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В47 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,50-1,70 (4H, м), 2,57 (2H, т), 3,62 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,16 (1H, д), 8,49 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B49

1-[4-(3-Циклопентил-1-пропинил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и 3-циклопентил-1-пропина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,25-1,35 (2H, м), 1,45-1,70 (6H, м), 1,75-1,85 (2H, м), 2,05-2,13 (1H, м), 4,65 (2H, с), 7,17 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,51 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B50

1-[4-(3-Циклопентилпропил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В49 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,25-1,74 (13H, м), 2,49-2,54 (2H, м), 4,64 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,17 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B51

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-метил-3-бутин-2-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и 2-метил-3-бутин-2-ола таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 1,35 (1H, с), 1,40 (6H, с), 4,62 (2H, с), 7,20-7,30 (4H, м), 7,61 (1H, дд), 7,71 (1H, д), 7,69-7,76 (1H, м), 7,95 (1H, д), 8,26 (1H, д), 8,42 (1H, д).

Пример B52

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-метил-2-бутанол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В51 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,25 (6H, с), 1,70-1,77 (2H, м), 2,60-2,67 (2H, м), 4,64 (2H, с), 7,08 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,16 (1H, д), 8,49 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B53

1-[4-(3-Метокси-1-пропинил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и метилпропаргилового эфира таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,42 (3H, с), 4,29 (2H, с), 4,66 (2H, с), 7,21 (2H, д), 7,34 (2H, д), 7,54 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд) 7,82 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B54

1-[4-(3-Метоксипропил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В53 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,78-1,87 (2H, м), 2,06 (2H, т), 3,31 (3H, с), 3,35 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,22 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,17 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B55

1-{4-[2-(2-Пиридил)-1-этинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и 2-этинилпиридина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,71 (2H, с), 7,20-7,25 (2H, м), 7,29 (2H, д), 7,48-7,53 (1H, м), 7,51 (2H, д), 7,57 (1H, дд), 7,61 (1H, д), 7,67 (1H, дд), 7,85 (1H, д), 8,13 (1H, д), 8,53 (1H, д), 8,59-8,63 (1H, м).

Пример B56

1-{4-[2-(2-Пиридил)этил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В55 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,94-3,06 (4H, м), 4,64 (2H, с), 7,04 (1H, д), 7,09 (1H, дд), 7,09 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,53 (1H, ддд), 7,54 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,64 (1H, д), 7,81 (1H, д), 8,15 (1H, д), 8,49 (1H, д), 8,53 (1H, дд).

Пример B57

1-{4-[2-(3-Пиридил)-1-этинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В41 и 3-этинилпиридина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,69 (2H, с), 7,27 (2H, д), 7,31 (1H, дд), 7,43 (2H, д), 7,55 (1H, дд), 7,59 (1H, д), 7,66 (1H, дд), 7,82 (1H, ддд), 7,83 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,51 (1H, д), 8,60 (1H, дд), 8,77 (1H, д).

Пример B58

1-{4-[2-(3-Пиридил)этил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера В57 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,80-2,90 (4H, м), 4,65 (2H, с), 7,04 (2H, д), 7,15 (1H, дд), 7,19 (2H, д), 7,39 (1H, дд), 7,54 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,15 (1H, д), 8,40 (1H, д), 8,42 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B59

N-(2-Пропинил)ацетамид

Пиридин (16,3 мл) и уксусный ангидрид (10,4 мл) добавляли к охлажденному на льду раствору пропаргиламина (3023 мг) в метиленхлориде (30 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь выливали на лед, экстрагировали этилацетатом, последовательно промывали 1 N хлористоводородной кислотой, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (743 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 1,79 (3H, с), 3,07 (1H, т), 3,81 (2H, д), 8,25 (1H, шир.с).

Пример B60

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}ацетамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B59 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 1,79 (3H, с), 4,04 (2H, с), 4,61 (2H, с), 7,45-7,68 (4H, м), 7,68-7,75 (2H, м), 7,90-8,00 (1H, м), 8,25-8,38 (2H, м), 8,40-8,45 (1H, м).

Пример B61

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]пропил}ацетамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B60 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,95 (3H, с), 1,74-1,84 (2H, м), 2,55 (2H, т), 3,25 (2H, дт), 4,68 (2H, с), 7,10 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,20-7,28 (1H, м), 7,50-7,58 (2H, м), 7,60-7,68 (1H, м), 7,75-7,85 (1H, м), 8,10-8,16 (1H, м), 8,45-8,50 (1H, м).

Пример B62

N-(2-Пропинил)метансульфонамид

Триэтиламин (9,77 мл) добавляли к охлажденному на льду раствору пропаргиламина (3023 мг) в метиленхлориде (30 мл). После добавления по каплям метансульфонилхлорида (5,19 мл) реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при такой же температуре, нагревали до комнатной температуры и затем перемешивали в течение 2 часов. К реакционной смеси добавляли лед, полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в метаноле (120 мл), добавляли карбонат калия (11,7 г) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, нейтрализовали разбавленной хлористоводородной кислотой при охлаждении на льду и затем экстрагировали этилацетатом. Экстракт промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (6,67 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,39 (1H, т), 3,10 (3H, с), 3,99 (2H, дд), 4,60 (1H, шир.с).

Пример B63

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}метансульфонамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B62 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 2,97 (3H, с), 4,00 (2H, д), 4,63 (2H, с), 7,25-7,37 (4H, м), 7,57 (1H, т), 7,62 (1H, дд), 7,71 (1H, д), 7,73 (1H, дд), 7,94 (1H, д), 8,28 (1H, д), 8,42 (1H, д).

Пример B64

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]пропил}метансульфонамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B63 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,80-1,90 (2H, м), 2,62 (2H, т), 2,89 (3H, с), 3,11 (2H, дт), 4,25 (1H, шир.с), 4,64 (2H, с), 7,05 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,50 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,15 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B65

1-{4-[3-(Этилсульфанил)-1-пропинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и пропаргилэтилсульфида таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,30 (3H, т), 2,73 (2H, кв), 3,47 (2H, с), 4,67 (2H, с), 7,20-7,32 (4H, м), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B66

трет-Бутил N-(пропинил)карбамат

Раствор ди-трет-бутилдикарбоната (10,84 г) в тетрагидрофуране (20 мл) по каплям добавляли к охлажденному на льду раствору пропаргиламина (3040 мг) в тетрагидрофуране (20 мл), температуру смеси постепенно повышали до комнатной температуры и реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (9,34 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 1,36 (9H, с), 3,04 (1H, т), 3,62-3,70 (2H, м), 7,20-7,30 (1H, м).

Пример B67

трет-Бутил N-{3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}карбамат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B66 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,45 (9H, с), 4,06-4,13 (2H, м), 4,66 (2H, с), 7,19 (2H, д), 7,20-7,28 (1H, м), 7,29 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B68

трет-Бутил N-{3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]пропил}карбамат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B67 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,43 (9H, с), 1,70-1,81 (2H, м), 2,54-2,60 (2H, м), 3,01-3,20 (2H, м), 4,47-4,57 (1H, м), 4,65 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,21 (2H, д), 7,55 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,18 (1H, д), 8,51 (1H, д).

Пример B69

3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропин-1-амин

Трифторуксусную кислоту (0,3 мл) добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера B67 (4 мг) в метиленхлориде (0,6 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После добавления насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (4 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,60-3,68 (2H, м), 4,66 (2H, с), 7,19 (2H, д), 7,29 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,49 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона амина.

Пример B70

3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-1-пропанамин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B68 таким же способом, как в примере B69.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,20-1,30 (2H, м), 1,78-1,88 (2H, м), 2,45-2,52 (2H, м), 2,73-2,81 (2H, м), 4,55 (2H, с), 6,94 (2H, д), 7,08 (2H, д), 7,50 (1H, дд), 7,51 (1H, д), 7,61 (1H, дд), 7,76 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,38 (1H, д).

Пример B71

N-Метил-N-(2-пропинил)ацетамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой N-метил-N-(2-пропинил)амина таким же способом, как в примере B59.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,11 (2,1H, с), 2,17 (0,9H, с), 2,21 (0,7H, т), 2,31 (0,3H, т), 3,00 (0,9H, с), 3,08 (2,1H, с), 4,04 (0,6H, д), 4,23 (1,4H, д).

Полученное соединение содержало смесь 7:3 геометрических изомеров амида.

Пример B72

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}-N-метилацетамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B71 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,10 (1,8H, с), 2,11 (1,2H, с), 3,01 (1,2H, с), 3,10 (1,8H, с), 4,21 (1,2H, с), 4,41 (0,8H, с), 4,67 (2H, с), 7,18-7,23 (2H, м), 7,29-7,32 (2H, м), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Полученное соединение содержало смесь 3:2 геометрических изомеров амида.

Пример B73

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]пропил}-N1-метилацетамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B72 таким же способом, как в примере B43.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,70-1,90 (2H, м), 1,89 (1,5H, с), 2,03 (1,5H, с), 2,50-2,59 (2H, м), 2,88 (1,5H, с), 2,91 (1,5H, с), 3,20-3,25 (1H, м), 3,36-3,40 (1H, м), 4,66 (2H, с), 7,03-7,10 (2H, м), 7,18-7,30 (2H, м), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,66 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,17 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Полученные соединения содержали смесь 1:1 геометрических изомеров амида.

Пример B74

N-Метил-N-(2-пропинил)метансульфонамид

Триэтиламин (6,55 мл) добавляли к охлажденному на льду раствору N-метил-N-(2-пропинил)амина (2603 мг) в метиленхлориде (25 мл). Затем по каплям добавляли метансульфонилхлорид (3,50 мл), реакционную смесь перемешивали при той же температуре в течение 1 часа и затем дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После добавления льда реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, последовательно промывали 1 N хлористоводородной кислотой, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (4522 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,41 (1H, т), 2,93 (3H, с), 2,96 (3H, с), 4,09 (2H, д).

Пример B75

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}-N-метилметансульфонамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B74 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,95 (3H, с), 2,97 (3H, с), 4,26 (2H, с), 4,68 (2H, с), 7,24 (2H, д), 7,31 (2H, д), 7,55 (1H, дд), 7,59 (1H, д), 7,66 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B76

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]пропил}-N-метилметансульфонамид

Остаток, полученный при обработке соединения примера B75 таким же способом, как в примере B43, отделяли и очищали ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)], получая указанное в заголовке соединение.

MS m/z (ESI:MH⁺): 369,2.

Пример B77

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-4-пентин-2-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и 4-пентин-2-ола таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,27 (3H, т), 2,38-2,62 (2H, м), 3,95-4,03 (1H, м), 4,65 (2H, с), 7,19 (2H, д), 7,29 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,48 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B78

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пентанол

Остаток, полученный при обработке соединения примера B77 таким же способом, как в примере B43, отделяли и очищали ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)], получая указанное в заголовке соединение.

MS m/z (ESI:MH⁺): 306,2.

Пример B79

3-Бутилфенол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 1-бутил-3-метоксибензола таким же способом, как в примере B40.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,94 (3H, т), 1,30-1,55 (2H, м), 1,55-1,62 (2H, м), 2,56 (2H, т), 4,76 (1H, шир.с), 6,63 (1H, дд), 6,66 (1H, д), 6,75 (1H, д), 7,12 (1H, дд).

Пример B80

1-Бутил-3-(метоксиметокси)бензол

60% суспензию гидрида натрия, диспергированного в минеральном масле (102 мг), добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера B79 (318 мг) в диметилформамиде (5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь снова охлаждали на льду, добавляли хлорметилметиловый эфир (0,18 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (341 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дальнейшей очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,94 (3H, т), 1,30-1,42 (2H, м), 1,55-2,04 (2H, м), 2,58 (2H, т), 3,49 (3H, с), 5,17 (2H, с), 6,80-6,87 (3H, м), 7,18 (1H, дд).

Пример B81

4-Бутил-2-(метоксиметокси)бензальдегид

Раствор трет-бутиллития в пентане (1,51 М; 10,6 мл) по каплям добавляли к раствору соединения примера B80 (2396 мг) в петролейном эфире, охлажденном до -20°С, и полученную реакционную смесь перемешивали при температуре в пределах от -10°С до 0°С в течение 1,5 часов. Реакционную смесь охлаждали до -70°С, добавляли безводный эфир (17 мл) и диметилформамид (1,91 мл) и полученную в результате смесь перемешивали при указанной температуре в течение 3 часов, затем перемешивали еще в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали на льду, добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и смесь экстрагировали этилацетатом. Экстракт промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (1821 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,94 (3H, т), 1,32-1,42 (2H, м), 1,57-1,65 (2H, м), 2,64 (2H, т), 3,54 (3H, с), 5,29 (2H, с), 6,91 (1H, д), 7,01 (1H, с), 7,76 (1H, д), 10,44 (1H, с).

Пример B82

[4-Бутил-2-(метоксиметокси)фенил](1-изохинолил)метанол

Водный раствор гидроксида натрия (50%, 1,4 мл) добавляли к раствору 1-цианобензоил-1,2-дигидроизохинолина (815 мг), который синтезировали согласно Org. Synth., IV, 155 (1988), соединения примера B81 (869 мг) и хлорида триэтилбензиламмония (7 мг) в метиленхлориде (1,6 мл) и реакционную смесь подвергали обработке ультразвуком на водяной бане в течение 10 минут. После добавления метиленхлорида (8,3 мл) и этанола (4,4 мл) реакционную смесь дополнительно подвергали обработке ультразвуком на водяной бане в течение 85 минут. Добавляли воду и полученную в результате реакционную смесь экстрагировали метиленхлоридом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (1144 мг).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 0,86 (3H, т), 1,22-1,31 (2H, м), 1,44-1,52 (2H, м), 2,44-2,51 (2H, м), 3,16 (3H, с), 5,10 (1H, д), 5,12 (1H, д), 6,72 (1H, с), 6,75 (1H, д), 6,84 (1H, с), 7,21 (1H, д), 7,61 (1H, дд), 7,72 (1H, дд), 7,74 (1H, д), 7,95 (1H, д), 8,31 (1H, д), 8,42 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B83

[4-Бутил-2-(метоксиметокси)фенил](1-изохинолил)метилацетат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B82 таким же способом, как в примере B38.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,40 (2H, м), 1,50-1,60 (2H, м), 2,22 (3H, с), 2,54 (2H, т), 3,41 (3H, с), 5,22 (1H, д), 5,26 (1H, д), 6,77 (1H, д), 6,94 (1H, с), 7,29 (1H, д), 7,55 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,70 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,05 (1H, с), 8,35 (1H, д), 8,55 (1H, д).

Пример B84

1-[4-Бутил-2-(метоксиметокси)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B83 таким же способом, как в примере B39.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,28-1,37 (2H, м), 1,50-1,58 (2H, м), 2,53 (2H, т), 3,46 (3H, с), 4,65 (2H, с), 5,24 (2H, с), 6,66 (1H, дд), 6,89 (1H, д), 6,92 (1H, д), 7,51 (1H, дд), 7,53 (1H, д), 7,62 (1H, дд), 7,79 (1H, д), 8,23 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B85

5-Бутил-2-(1-изохинолилметил)фенол

5 N хлористоводородную кислоту (1,0 мл) добавляли к раствору соединения примера B84 (88 мг) в метаноле (1,5 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 часов. Реакционную смесь нейтрализовали 5 N водным раствором гидроксида натрия, доводили до pH 6,8 фосфатным буфером и экстрагировали этилацетатом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (44 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,23-1,37 (2H, м), 1,48-1,60 (2H, м), 2,51 (2H, т), 4,56 (2H, с), 6,65 (1H, дд), 6,82 (1H, д), 7,21 (1H, д), 7,55 (1H, д), 7,68 (1H, дд), 7,72 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,35 (1H, д), 8,44 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B86

N-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}-N,N-диметиламин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и 1-диметиламино-2-пропина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,04 (3H, с), 2,34 (3H, с), 3,47 (2H, с), 4,66 (2H, с), 7,20 (2H, д), 7,32 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B87

1-{4-[3-(Тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-пропинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и тетрагидро-2-(2-пропинилокси)-2H-пирана таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,45-1,85 (6H, м), 3,50-3,60 (1H, м), 3,84-3,90 (1H, м), 4,42 (1H, д), 4,48 (1H, д), 4,66 (2H, с), 4,87 (1H, дд), 7,15-7,21 (2H, м), 7,33-7,36 (2H, м), 7,50-7,70 (3H, м), 7,81-7,86 (1H, м), 8,07-8,10 (1H, м), 8,48-8,51 (1H, м).

Пример B88

3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B87 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,20-1,30 (1H, м), 4,46 (2H, с), 4,67 (2H, с), 7,23 (2H, д), 7,31 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B89

N,N-Диметил-4-пентинамид

Диметиламин (2 М раствор в тетрагидрофуране, 8,53 мл), триэтиламин (2,59 мл) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (3221 мг) добавляли к раствору 4-пентиновой кислоты (552 мг) в метиленхлориде (150 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Реакционную смесь последовательно промывали 1 N хлористоводородной кислотой, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния, затем концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (129 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,96-1,99 (1H, м), 2,50-2,60 (4H, м), 2,96 (3H, с), 3,02 (3H, с).

Пример B90

N,N-Диметил-5-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-4-пентинамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B89 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,59-2,64 (2H, м), 2,71-2,75 (2H, м), 2,96 (3H, с), 3,03 (3H, с), 4,66 (2H, с), 7,18 (2H, д), 7,28 (2H, д), 7,43-7,70 (3H, м), 7,90 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B91

1-Метил-2-пропинилтетрагидро-2H-2-пираниловый эфир

3,4-Дигидро-2H-пиран (7,15 мл) и п-толуолсульфонат пиридиния (2187 мг) добавляли к раствору 3-бутин-2-ола (3051 мг) в дихлорметане (150 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 29 часов.

Реакционную смесь последовательно промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (4698 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,45 (1,05H, д),1,48 (1,95H, д), 1,50-1,90 (6H, м), 2,37 (0,65H, д), 2,43 (0,35H, д), 3,50-3,60 (1,3H, м), 3,80-3,86 (0,7H, м), 4,43-4,50 (0,35H, м), 4,52-4,60 (0,65H, м), 4,77 (0,35H, т), 4,94 (0,65H, т).

Пример B92

1-{4-[3-(Тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-бутинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B91 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,40-1,80 (6H, м), 1,49 (1,05H, д), 1,52 (1,95H, д), 3,49-3,60 (1H, м), 3,80-3,88 (0,65H, м), 3,99-4,06 (0,35H, м), 4,65 (2H, с), 4,74 (1H, кв), 4,83 (0,35H, т), 4,97 (0,65H, т), 7,18-7,22 (2H, м), 7,32 (2H, д), 7,54 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B93

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-3-бутин-2-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B92 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,53 (3H, д), 2,15 (1H, шир.с), 4,68 (2H, с), 4,72 (1H, кв), 7,21 (2H, д), 7,31 (2H, д), 7,54 (1H, дд), 7,59 (1H, д), 7,66 (1H, дд), 7,84 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,51 (1H, д).

Пример B94

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-бутанол

Остаток, полученный при обработке соединения примера B93 таким же способом, как в примере B43, отделяли и очищали ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)], получая указанное в заголовке соединение.

MS m/z (ESI:MH⁺): 292,2.

Пример B95

2-Метил-4-пентин-2-ол

Комплекс ацетилид лития-этилендиамин добавляли постепенно к смешанному раствору оксида изобутилена (1889 мг) в тетрагидрофуране (13 мл) и диметилсульфоксиде (20 мл), охлажденному до 0°С, и полученную реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 5 часов. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (3316 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,33 (6H, с), 2,09 (1H, т), 2,38 (2H, т).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B96

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-метил-4-пентин-2-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B95 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 1,18 (6H, с), 2,28 (1H, с), 2,42 (2H, с), 4,62 (2H, с), 7,10-7,30 (4H, м), 7,62 (1H, дд), 7,71 (1H, д), 7,72 (1H, дд), 7,94 (1H, д), 8,27 (1H, д), 8,42 (1H, д).

Пример B97

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-метил-2-пентанол

Остаток, полученный при обработке соединения примера B96 таким же способом, как в примере B43, отделяли и очищали ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)], получая указанное в заголовке соединение.

MS m/z (ESI:MH⁺): 320,2.

Пример B98

4-Бензилокси-2-(метоксиметокси)бензальдегид

N,N-Диизопропилэтиламин (1,98 мл) и хлорметилметиловый эфир (0,76 мл) добавляли к раствору 4-бензилокси-2-гидроксибензальдегида (2071 мг) в тетрагидрофуране (30 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 19 часов. Затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (2,7 мл) и хлорметилметиловый эфир (1,04 мл) и полученную в результате смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником еще в течение 10 часов. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния, затем фильтровали через силикагель и окись алюминия. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (2470 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,52 (3H, с), 5,12 (2H, с), 5,27 (2H, с), 6,68 (1H, дд), 6,80 (1H, д), 7,33-7,45 (5H, м), 7,82 (1H, д), 10,33 (1H, с).

Пример B99

[4-(Бензилокси)-2-(метоксиметокси)фенил](1-изохинолил)метанол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B98 таким же способом, как в примере B82.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 3,16 (3H, с), 5,01 (2H, с), 5,11 (1H, д), 5,14 (1H, д), 6,59 (1H, дд), 6,66-6,70 (2H, м), 7,18 (1H, д), 7,31 (1H, д), 7,34-7,42 (4H, м), 7,61 (1H, дд), 7,71 (1H, д), 7,75 (1H, д), 7,95 (1H, д), 8,28 (1H, д), 8,43 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B100

[4-(Бензилокси)-2-(метоксиметокси)фенил](1-изохинолил)метилацетат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B99 таким же способом, как в примере B38.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,21 (3H, с), 3,42 (3H, с), 4,98 (1H, д), 5,00 (1H, д), 5,21-5,27 (2H, м), 6,54 (1H, дд), 6,81 (1H, д), 7,25 (1H, д), 7,30-7,41 (5H, м), 7,53 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,00 (1H, с), 8,29 (1H, д), 8,55 (1H, д).

Пример B101

4-(1-Изохинолилметил)-3-(метоксиметокси)фенол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B100 таким же способом, как в примере B39.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 3,36 (3H, с), 4,44 (2H, с), 5,17 (2H, с), 6,22 (1H, д), 6,52 (1H, с), 6,67 (1H, д), 7,57-7,76 (3H, м), 7,92 (1H, д), 8,22 (1H, д), 8,37 (1H, д), 9,24 (1H, шир.с).

Пример B102

4-(1-Изохинолилметил)-3-(метоксиметокси)фенилтрифторметансульфонат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B101 таким же способом, как в примере B41.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,43 (3H, с), 4,65 (2H, с), 5,24 (2H, с), 6,77 (1H, дд), 7,04 (1H, д), 7,07 (1H, д), 7,54-7,61 (2H, м), 7,67 (1H, дд), 7,84 (1H, д), 8,16 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B103

1-{2-(Метоксиметокси)-[4-(тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-бутинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B102 и 2-(3-бутинилокси)тетрагидро-2H-пирана таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,51-1,90 (6H, м), 2,68 (2H, т), 3,50 (3H, с), 3,49-3,55 (1H, м), 3,58-3,65 (1H, м), 3,84-3,94 (2H, м), 4,63-4,68 (1H, м), 4,65 (2H, с), 5,23 (2H, с), 6,76 (1H, дд), 7,04 (1H, д), 7,07 (1H, д), 7,49-7,69 (3H, м), 7,81 (1H, д), 8,14 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B104

5-(4-Гидрокси-1-бутинил)-2-(1-изохинолилметил)фенол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B103 таким же способом, как в примере B85.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,80 (1H, шир.с), 2,66 (2H, т), 3,73-3,82 (2H, м), 4,58 (2H, с), 6,87 (1H, д), 7,04 (1H, с), 7,23 (1H, д), 7,60 (1H, д), 7,69-7,78 (2H, м), 7,86 (1H, д), 8,37 (1H, д), 8,42 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона фенольной гидроксильной группы.

Пример B105

{4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-метил-3-бутинил} 1-(трет-бутил)-1,1-диметилсилиловый эфир

Трифенилфосфин (18,37 г) добавляли к охлажденному на льду раствору тетрабромида углерода (11,19 г) в метиленхлориде (60 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 1 часа. По каплям добавляли раствор 3-{[1-(трет-бутил)-1,1-диметилсилил]окси}-2-метилпропаналя, который синтезировали согласно Tetrahedron Lett., 4347 (1979), в метиленхлориде (14 мл) и полученную в результате реакционную смесь далее перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли метиленхлоридом, последовательно промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. К полученному остатку добавляли эфир, нерастворимое вещество отделяли фильтрованием и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая трет-бутил[(4,4-дибром-2-метил-3-бутенил)окси]диметилсилан (2385 мг).

Затем 2,47 М раствор н-бутиллития в гексане (3,15 мл) по каплям добавляли к раствору трет-бутил[(4,4-дибром-2-метил-3-бутенил)окси]диметилсилана (1326 мг) в тетрагидрофуране (10 мл), охлажденному до -70°С, и полученную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 1 часа. Затем добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и полученную в результате смесь нагревали до комнатной температуры. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали эфиром. Эфирный слой промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния, затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток и соединение примера B41 обрабатывали таким же способом, как в примере B42, получая указанное в заголовке соединение.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,07 (6H, с), 0,90 (9H, с), 1,18 (3H, д), 2,70-2,80 (1H, м), 3,47 (1H, дд), 3,70 (1H, дд), 4,65 (2H, с), 7,16 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,51 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,07 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B106

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-метил-3-бутин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B105 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 1,11 (3H, д), 2,60-2,70 (1H, м), 3,28 (1H, д), 3,44 (1H, д), 4,58 (2H, с), 4,85-4,90 (1H, м), 7,23 (4H, с), 7,61 (1H, дд), 7,70 (1H, д), 7,71 (1H, дд), 7,93 (1H, д), 8,25 (1H, д), 8,42 (1H, д).

Пример B107

1-{[1-(трет-Бутил)-1,1-диметилсилил]окси}-3-бутин-2-ол

Этинилмагнийбромид в тетрагидрофуране (0,5 М, 90 мл) добавляли к безводному тетрагидрофурану (20 мл), охлажденному до -78°С в атмосфере азота. По каплям добавляли раствор трет-бутилдиметилсилоксиацетальдегида (6000 мг) в тетрагидрофуране (30 мл) и полученную в результате смесь перемешивали при -78°С в течение 45 минут, нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 1 часа 40 минут, затем охлаждали на льду. После добавления насыщенного водного раствора хлорида аммония реакционную смесь экстрагировали эфиром, промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (8,55 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,08 (6H, с), 0,91 (9H, с), 2,43 (1H, д), 2,60-2,66 (1H, м), 3,65-3,70 (1H, м), 3,73-3,81 (1H, м), 4,38-4,42 (1H, м).

Пример B108

1-{[1-(трет-Бутил)-1,1-диметилсилил]окси}метил)-2-пропинилацетат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B107 таким же способом, как в примере B38.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,08 (6H, с), 0,90 (9H, с), 2,11 (3H, с), 2,44 (1H, д), 3,80-3,88 (2H, м), 5,41-5,55 (1H, м).

Пример B109

4-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-3-бутин-1,2-диол

Соединение примера B41 и соединение примера B108 обрабатывали таким же способом, как в примере B42, получая продукт связывания. Указанное в заголовке соединение получали удалением гидроксильной защитной группы продукта связывания таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 3,40-3,45 (1H, м), 3,70-3,82 (1H, м), 4,30-4,35 (1H, м), 4,63 (2H, с), 4,90 (1H, т), 5,46 (1H, д), 7,25-7,30 (4H, м), 7,62 (1H, дд), 7,71 (1H, д), 7,73 (1H, дд), 7,94 (1H, д), 8,28 (1H, д), 8,43 (1H, д).

Пример B110

1-{4-[2-(2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4-ил)-1-этинил]бензил}изохинолин

2,2-Диметоксипропан (0,36 мл), 10-камфорсульфоновую кислоту (43 мг) и молекулярные сита (4 Å) добавляли к раствору соединения примера B109 (34 мг) в диметилформамиде (2 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при 75°С в течение 9 часов. После добавления насыщенного водного раствора карбоната натрия реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (14 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,40 (3H, с), 1,50 (3H, с), 3,97 (1H, дд), 4,21 (1H, дд), 4,66 (2H, с), 4,91 (1H, дд), 7,19 (2H, д), 7,32 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,65-7,78 (2H, м), 8,08 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B111

трет-Бутил{[2-(1-этоксиэтокси)-3-бутинил]окси}диметилсилан

Этилвиниловый эфир (1,21 мл) и п-толуолсульфонат пиридиния (317 мг) добавляли к раствору 1-{[1-(трет-бутил)-1,1-диметилсилил]окси}-3-бутин-2-ола (1687 мг) в метиленхлориде (90 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Метиленхлоридный слой промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния, затем концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (1962 мг). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 0,00 (6H, с), 0,81 (9H, с), 1,01-1,07 (3H, м), 1,10-1,20 (1H, м), 1,18 (3H, д), 3,35-3,63 (4H, м), 4,18-4,27 (1H, м), 4,74 (0,5H, кв), 4,81 (0,5H, кв).

Пример B112

1-{4-[4-{[1-(трет-Бутил)-1,1-диметилсилил]окси}-3-(1-этоксиэтокси)-1-бутинил]бензил}изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B111 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 0,00 (6H, с), 0,80 (9H, с), 1,01-1,05 (3H, м), 1,19 (3H, д), 3,39-3,70 (4H, м), 4,41 (0,5H, т), 4,48 (0,5H, т), 4,59 (2H, с), 4,79 (0,5H, кв), 4,87 (0,5H, кв), 7,20-7,30 (4H, м), 7,58 (1H, дд), 7,68 (1H, д), 7,69 (1H, дд), 7,91 (1H, д), 8,24 (1H, д), 8,38 (1H, д).

Пример B113

1-{[1-(трет-Бутил)-1,1-диметилсилил]окси}-4-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-3-бутин-2-ол

п-Толуолсульфонат пиридиния (486 мг) добавляли к раствору соединения примера B112 (474 мг) в метаноле (15 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. После добавления этилацетата реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (265 мг).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 0,01 (6H, с), 0,82 (9H, с), 3,55-3,62 (2H, м), 4,30-4,39 (1H, м), 4,61 (2H, с), 5,51 (1H, д), 7,20-7,27 (4H, м), 7,50-7,63 (1H, м), 7,67-7,74 (2H, м), 7,92 (1H, д), 8,27 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B114

{2-Фтор-4-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-3-бутинил}-1-(трет-бутил)-1,1-диметилсилиловый эфир

Раствор соединения примера B113 (116 мг) в метиленхлориде (2 мл) по каплям добавляли к раствору (диэтиламино)трифторида серы (44 мкл) в метиленхлориде (2 мл), охлажденному до -78°С в атмосфере азота. После перемешивания в течение 15 минут реакционную смесь перемешивали еще в течение 8 часов при комнатной температуре. Добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, полученную в результате реакционную смесь экстрагировали метиленхлоридом. Метиленхлоридный слой промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (42 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,10 (6H, с), 0,91 (9H, с), 3,83-4,00 (2H, м), 4,67 (2H, с), 5,17 (1H, ддд), 7,22 (2H, д), 7,34 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B115

2-Фтор-4-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-3-бутин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B114 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,31 (1H, шир.с), 3,77-3,95 (2H, м), 4,67 (2H, с), 5,35 (1H, ддд), 7,22 (2H, д), 7,35 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,07 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B116

{6-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-5-гексинил}-1-(трет-бутил)-1,1-диметилсилиловый эфир

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и трет-бутил(5-гексинилокси)диметилсилана таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,04 (6H, с), 0,88 (9H, с), 1,55-1,70 (4H, м), 2,39 (2H, т), 3,64 (2H, т), 4,65 (2H, с), 7,17(2H, д), 7,27 (2H, д), 7,51 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B117

6-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-5-гексин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B116 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,60-1,80 (4H, м), 2,42 (2H, т), 3,69 (2H, т), 4,65 (2H, с), 7,17 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,49 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B118

6-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-1-гексанол

Остаток, полученный при обработке соединения примера B117 таким же способом, как в примере B43, отделяли и очищали ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)], получая указанное в заголовке соединение.

MS m/z (ESI:MH⁺): 320,2.

Пример B119

2-(4-Пентинилокси)тетрагидро-2Н-пиран

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 4-пентин-1-ола таким же способом, как в примере B91.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,50-1,90 (8H, м), 1,95 (1H, т), 2,30-2,35 (2H, м), 3,46-3,54 (2H, м), 3,80-3,90 (2H, м), 4,60 (1H, дд).

Пример B120

1-{4-[5-(Тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-пентинил]бензил}изохинолин.

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B119 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,49-1,90 (8H, м), 2,49 (2H, т), 3,47-3,54 (2H, м), 3,82-3,90 (2H, м), 4,60 (1H, дд), 4,65 (2H, с), 7,17 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример 121

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-4-пентин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B120 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,80-1,88 (2H, м), 2,51 (2H, т), 3,80 (2H, т), 4,65 (2H, с), 7,18 (2H, д), 7,29 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B122

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-4-пентинилцианид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и 5-циано-1-пентина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,85-1,98 (2H, м), 2,40-2,60 (4H, м), 4,66 (2H, с), 7,20 (2H, д), 7,28 (2H, д), 7,53 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,65 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B123

1-[4-(3-Метил-1-бутинил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и 3-метил-1-бутина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,23 (6H, д), 2,70-2,78 (1H, м), 4,65 (2H, с), 7,18 (2H, д), 7,28 (2H, д), 7,51 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,08 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B124

1-[4-(5-Метил-1-гексинил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и 5-метил-1-гексина таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (6H, д), 1,47 (2H, дт), 1,68-1,77 (1H, м), 2,37 (2H, т), 4,65 (2H, с), 7,17 (2H, д), 7,28 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B125

4-Пентинамид

1-Этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин (6775 мг) и гидрокарбонат аммония (5905 мг) добавляли к раствору 4-пентиновой кислоты (2446 мг) в хлороформе (75 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17,5 часов. Реакционную смесь фильтровали через целит и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (249 мг).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 2,21 (2H, т), 2,29-2,33 (2H, м), 2,73 (1H, т), 6,78-6,88 (1H, м), 7,28-7,38 (1H, м).

Пример B126

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-4-пентинамид

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B125 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 2,51 (2H, т), 2,85 (2H, т), 3,70 (2H, шир.с), 4,59 (2H, с), 7,05 (2H, д), 7,23 (2H, д), 7,61 (1H, дд), 7,70 (1H, д), 7,72 (1H, дд), 7,94 (1H, д), 8,30 (1H, д), 8,43 (1H, д).

Пример B127

трет-Бутил-4-пентиноат

Бензилтриэтиламмонийхлорид (5,92 г), карбонат калия (93,4 г) и трет-бутилбромид (143 мл) добавляли к раствору 4-пентиновой кислоты (2550 мг) в N,N-диметилацетамиде (230 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при 55°С в течение 24 часов. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали водой, сушили над безводным хлоридом магния и затем фильтровали через силикагель. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (2,10 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,46 (9H, с), 1,96-1,97 (1H, м), 2,45-2,47 (4H, м).

Пример B128

трет-Бутил 5-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-4-пентиноат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B41 и соединения примера B127 таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,45 (9H, с), 2,49 (2H, т), 2,64 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,21 (2H, д), 7,26 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,57 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,09 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B129

5-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-4-пентиновая кислота

Остаток, полученный при обработке соединения примера B128 таким же способом, как в примере B69, отделяли и очищали ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)], получая указанное в заголовке соединение.

MS m/z (ESI:MH⁺): 316,1.

Следующие соединения синтезировали следующим образом. А именно, указанное в заголовке соединение получали взаимодействием соединения примера B41 с различными реагентами, описанными ниже, согласно примеру B33. Различные реагенты представляют собой акриламид, N,N-диметилакриламид, трет-бутилакрилат и метилвинилсульфон. Кроме того, продукт связывания, полученный таким образом, подвергали либо восстановлению согласно примеру B39, либо удалению защитной группы сложного трет-бутилового эфира согласно примеру B40, либо обеим реакциям. Полученный в результате продукт очищали хроматографией на колонке с силикагелем или ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)].

Пример B130

(E)-3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропенамид

MS m/z (ESI:MH⁺): 289,3.

Пример B131

3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропанамид

MS m/z (ESI:MH⁺): 291,2.

Пример B132

N,N-Диметил-(E)-3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-2-пропенамид

MS m/z (ESI:MH⁺): 317,3.

Пример B133

N,N-Диметил-3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]пропанамид

MS m/z (ESI:MH⁺): 319,1.

Пример B134

трет-Бутил-(E)-3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-2-пропеноат

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,51 (9H, с), 4,68 (2H, с), 6,28 (1H, д), 7,27 (2H, д), 7,39 (2H, д), 7,49-7,60 (3H, м), 7,65 (1H, дд), 7,82 (1H, д), 8,11 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B135

(E)-3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропеновая кислота

MS m/z (ESI:MH⁺): 290,2.

Пример B136

трет-Бутил 3-[4-(1-изохинолилметил)фенил]пропаноат

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,37 (9H, с), 2,47 (2H, т), 2,83 (2H, т), 4,64 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,52 (1H, дд), 7,56 (1H, д), 7,63 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 8,14 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B137

3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]пропановая кислота

MS m/z (ESI:MH⁺): 292,1.

Пример B138

(E)-2-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-1-этенилметилсульфон

MS m/z (ESI:MH⁺): 324,1.

Пример B139

1-{4-[2-(Метилсульфонил)этил]бензил}изохинолин

MS m/z (ESI:MH⁺): 326,1.

Пример B140

2-Бензоил-6,7-диметокси-1,2-дигидро-1-изохинолинкарбонитрил

Водный раствор (2,3 мл) цианида калия (1,0 г, 16 ммоль) и бензоилхлорида (1,1 мл, 9,5 ммоль) добавляли к раствору 6,7-диметоксиизохинолина (1,0 г, 5,3 ммоль), который синтезировали согласно Tetrahedron, 37 (23), 3977 (1981), в метиленхлориде (6,0 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через целит и промывали метиленхлоридом и водой. После отделения полученного фильтрата метиленхлоридный слой последовательно промывали водой, 2 N хлористоводородной кислотой, водой и 2 N гидроксидом натрия, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (573 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,92 (3H, с), 3,94 (3H, с), 5,99 (1H, д), 6,51-6,55 (2H, м), 6,73 (1H, с), 6,85 (1H, с), 7,45-7,49 (2H, м), 7,53-7,56 (1H, м), 7,58-7,61 (2H, м).

Пример B141

1-(4-Бутилбензил)-6,7-диметоксиизохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B140 и соединения примера B1 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,51-1,58 (2H, м), 2,54 (2H, т), 3,88 (3H, с), 4,01 (3H, с), 4,57 (2H, с), 7,05 (1H, с), 7,07 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,32 (1H, с), 7,43 (1H, д), 8,37 (1H, д).

Пример B142

1-(3-Метоксифенил)-2-нитро-1-этанол

Водный раствор гидроксида натрия (1,5 г гидроксида натрия (37 ммоль), растворенных в 15 мл воды) по каплям добавляли к раствору м-анисальдегида (5,0 г, 37 ммоль) и нитрометана (4,0 мл, 73 ммоль) в метаноле (50 мл), поддерживая температуру раствора не выше 30°С. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. После охлаждения на льду добавляли водный раствор уксусной кислоты (ледяная уксусная кислота (37 ммоль), растворенная в 250 мл воды), полученную в результате реакционную смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой последовательно промывали водой и 5% водным раствором гидрокарбоната натрия, сушили над безводным сульфатом магния, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (6,09 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,83 (3H, с), 4,52 (1H, дд), 4,61 (1H, дд), 4,76-4,78 (1H, м), 5,44-5,48 (1H, м), 6,90 (1H, дд), 6,96-6,98 (2H, м), 7,25-7,34 (1H, м).

Пример B143

2-Амино-1-(3-метоксифенил)-1-этанол

Палладий на угле (10%, 0,64 г) и формиат аммония (4,8 г) добавляли к смешанному раствору соединения примера B142 (3,0 г, 15 ммоль) в тетрагидрофуране (43 мл) и метаноле (43 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Катализатор удаляли фильтрованием, фильтрат разбавляли эфиром, осадки удаляли фильтрованием и полученный фильтрат концентрировали, получая указанное в заголовке соединение (1,82 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Пример B144

2-(4-Бутилфенил)уксусная кислота

Тионилхлорид (4,7 мл, 66 ммоль) по каплям добавляли к раствору 4-н-бутилбензилового спирта (9,6 г, 59 ммоль) в эфире (120 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении и избыток тионилхлорида удаляли азеотропной перегонкой с бензолом. Остаток растворяли в диметилсульфоксиде (50 мл), к полученному раствору добавляли цианид натрия (86 г, 1,8 моль) и н-тетрабутиламмонийиодид (2,2 г, 5,9 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли воду и полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой последовательно промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая н-бутилфенилацетонитрил (8,2 г) в виде желтого масла. Затем концентрированную серную кислоту (48 мл) по каплям добавляли к воде (58 мл), полученный раствор охлаждали до 50°С, к раствору по каплям добавляли н-бутилфенилацетонитрил (8,2 г), полученный, как описано выше. Полученную в результате смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры осажденные кристаллы отфильтровывали, промывали водой и растворяли в 0,1 N водном растворе гидроксида натрия (200 мл). Добавляли Norit (5 г), полученную смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. После удаления Norit фильтрованием через целит фильтрат охлаждали до комнатной температуры и подкисляли 1 N хлористоводородной кислотой, чтобы осадить кристаллы. Осажденные кристаллы отфильтровывали, промывали водой и сушили, получая указанное в заголовке соединение (3,5 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,93 (3H, т), 1,30-1,40 (2H, м), 1,53-1,62 (2H, м), 2,59 (2H, т), 3,62 (2H, с), 7,15 (2H, д), 7,20 (2H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали OH карбоксильной группы.

Пример B145

N-[2-Гидрокси-2-(3-метоксифенил)этил]-2-(4-бутилфенил)ацетамид

Тионилхлорид (0,76 мл; 10 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B144 (1,0 г; 5,2 ммоль) в бензоле (10 мл) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 2 часов. После концентрирования избыток тионилхлорида удаляли азеотропной перегонкой с бензолом. Полученный остаток и соединение примера B143 (0,87 г; 5,2 ммоль) растворяли в эфире (5 мл), добавляли водный раствор гидроксида натрия (0,21 г гидроксида натрия, растворенные в 4,2 мл воды) и смесь энергично перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Эфирный слой отделяли и концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (600 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,94 (3H, т), 1,31-1,40 (2H, м), 1,57-1,63 (2H, м), 2,60 (2H, м), 3,30-3,37 (1H, м), 3,56 (2H, с), 3,60-3,66 (1H, м), 3,80 (3H, с), 3,81 (1H, д), 4,79-4,81 (1H, м), 6,80-6,89 (3H, м), 7,10 (2H, д), 7,16 (2H, д), 7,20-7,25 (1H, м).

Пример B146

1-(4-Бутилбензил)-6-метоксиизохинолин

Оксихлорид фосфора (1,6 мл) добавляли к раствору соединения примера B145 (600 мг, 1,7 ммоль) в ацетонитриле (15 мл) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 1 часа 30 минут. Смесь охлаждали на льду, подщелачивали 5% водным раствором гидрокарбоната натрия, экстрагировали этилацетатом, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (82 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,58 (2H, м), 2,53 (2H, т), 3,92 (3H, с), 4,57 (2H, с), 7,05-7,07 (3H, м), 7,13-7,18 (3H, м), 7,45 (1H, д), 8,06 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример 147

1-(4-Бутилбензил)-6-изохинолинол

47% раствор бромистоводородной кислоты добавляли к соединению примера B146 (82 мг) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 19 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении, добавляли воду и полученную в результате смесь нейтрализовали карбонатом натрия, чтобы осадить кристаллы. Полученные кристаллы отфильтровывали, промывали водой и затем сушили, получая указанное в заголовке соединение (74 мг).

¹Н-ЯМР (CD₃OD) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,25-1,34 (2H, м), 1,49-1,57 (2H, м), 2,52 (2H, т), 4,63 (2H, с), 7,03-7,13 (6H, м), 7,49 (1H, д), 8,10 (1H, д), 8,18 (1H, д).

Пример B148

1-(4-Бутилбензил)-6-пропоксиизохинолин

Карбонат серебра (40 мг; 0,14 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B147 (20 мг; 0,069 ммоль) и 1-иодпропана (0,4 мл; 4,1 ммоль) в толуоле (1,0 мл) и смесь перемешивали в темноте при 50°С в течение 4 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтровали через целит и промывали смешанным раствором толуола и метанола (9:1). Полученный фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (13 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,08 (3H, т), 1,30-1,33 (2H, м), 1,51-1,57 (2H, м), 1,86-1,91 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,05 (2H, т), 4,58 (2H, с), 7,05-7,07 (3H, м), 7,14-7,18 (3H, м), 7,43-7,44 (1H, м), 8,05-8,07 (1H, м), 8,40-8,41 (1H, м).

Пример B149

1-(4-Бутилбензил)-6-(2-пиперидиноэтокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере 148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,36 (2H, м), 1,46-1,57 (8H, м), 2,50-2,54 (6H, м), 2,83-2,86 (2H, м), 4,23 (2H, т), 4,56 (2H, с), 7,04-7,06 (3H, м), 7,13-7,17 (3H, м), 7,43 (1H, д), 8,04 (1H, д), 8,40 (1H, д).

Пример B150

N-({[1-(4-Бутилбензил)-6-изохинолил]окси}этил)-N,N-диметиламин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере 148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,36 (2H, м), 1,49-1,57 (2H, м), 2,37 (6H, с), 2,52 (2H, т), 2,80 (2H, т), 4,19 (2H, т), 4,57 (2H, с), 7,04-7,06 (3H, м), 7,15-7,19 (3H, м), 7,43 (1H, д), 8,05 (1H, д), 8,40 (1H, д).

Пример B151

2-Бензоил-7-метокси-1,2-дигидро-1-изохинолинкарбонитрил

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 7-метоксиизохинолина, который синтезировали согласно Tetrahedron, 27, 1253 (1971), таким же способом, как в примере B140.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,87 (3H, с), 6,03 (1H, шир.д), 6,56-6,54 (2H, м), 6,90 (1H, с), 6,95 (1H, дд), 7,17 (1H, д), 7,46-7,50 (2H, м), 7,54-7,62 (3H, м).

Пример B152

1-(4-Бутилбензил)-7-метоксиизохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B1 и соединения примера B151 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,56-1,58 (2H, м), 2,55 (2H, т), 3,82 (3H, с), 4,59 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,26-7,29 (1H, м), 7,35 (1H, д), 7,49 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,38-8,40 (1H, м).

Пример B153

1-(4-Бромбензил)-7-метоксиизохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B31 и соединения примера B151 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,84 (3H, с), 4,57 (2H, с), 7,14-7,16 (2H, м), 7,26 (1H, с), 7,29-7,32 (1H, м), 7,37-7,39 (2H, м), 7,51 (1H, д), 7,73 (1H, д), 8,39 (1H, д).

Пример B154

1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолинол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B152 таким же способом, как в примере B147.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 0,83 (3H, т), 1,21-1,26 (2H, м), 1,44-1,48 (2H, м), 4,68 (2H, с), 7,11 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,59-7,62 (2H, м), 8,10-8,17 (2H, м), 8,38 (1H, д), 10,9 (1H, шир.с).

(Два метиленовых протона бутильной группы перекрывались сигналом ДМСО, и их нельзя было наблюдать).

Пример B155

1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолилтрифторметансульфонат

4-Нитрофенолтрифлат (0,72 г; 2,7 ммоль), который синтезировали согласно J. Org. Chem., 64, 7638 (1999), и карбонат калия (1,1 г, 8,1 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B154 (1,0 г, 2,7 ммоль) в диметилформамиде (30 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После добавления воды полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой промывали 1 N гидроксидом натрия и насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (1,0 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,27-1,37 (2H, м), 1,51-1,59 (2H, м), 2,54 (2H, т), 5,10 (2H, с), 6,38 (1H, с), 6,95 (2H, д), 7,04 (2H, д), 7,44 (1H, д), 7,55 (1H, д), 7,75 (1H, д), 8,45 (1H, д).

Пример B156

1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолинкарбонитрил

Цианид цинка (215 мг, 1,8 ммоль), тетракис(трифенилфосфин)палладий (41 мг; 0,035 ммоль) и хлорид лития (120 мг, 2,8 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B155 (400 мг; 0,95 ммоль) в диметилформамиде (2 мл) в атмосфере азота и смесь перемешивали при 120°С в течение 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляли насыщенный раствор гидрокарбоната натрия и полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой промывали насыщенным раствором соли, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (71 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,35 (2H, м), 1,47-1,55 (2H, м), 2,50 (2H, т), 4,91 (2H, с), 6,97 (2H, д), 7,07 (2H, д), 7,28-7,31 (1H, м), 7,42 (1H, д), 7,51 (1H, д), 7,74 (1H, д), 8,34 (1H, д).

Пример B157

1-(4-Бутилбензил)-7-[2-(1,1,1-триметилсилил)-1-этинил]изохинолин

Ацетат палладия (11 мг; 0,047 ммоль), 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен (72 мг; 0,13 ммоль) и хлорид лития (25 мг; 0,59 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B155 (100 мг, 0,24 ммоль) и триметилсилилацетилена (65 мкл; 0,47 ммоль) в диметилформамиде (3,0 мл) и реакционную систему продували азотом. Добавляли триэтиламин (59 мкл; 0,43 ммоль) и иодид меди (2 мг; 0,018 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при 80°С в течение 21 часа, затем охлаждали до комнатной температуры. После добавления воды и этилацетата для разделения этилацетатный слой промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (7,0 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,28-0,32 (9H, м), 0,92 (3H, т), 1,32-1,38 (2H, м), 1,54-1,57 (2H, м), 2,57 (2H, т), 4,63 (2H, с), 7,10 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,52 (1H, д), 7,67-7,69 (1H, м), 7,75 (1H, д), 8,34 (1H, д), 8,51 (1H, д).

Пример B158

1-(4-Бутилбензил)-7-(1-этинил)изохинолин

Карбонат калия (13 мг; 0,094 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B157 (6 мг; 0,016 ммоль) в метаноле (1,0 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После концентрирования при пониженном давлении полученный остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (3,0 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,29-1,38 (2H, м), 1,52-1,57 (2H, м), 2,55 (2H, т), 3,19 (1H, с), 4,62 (2H, с), 7,09 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,53 (1H, д), 7,67-7,69 (1H, м), 7,77 (1H, д), 8,36 (1H, с), 8,52 (1H, д).

Пример B159

1-(4-Бутилбензил)-7-этилизохинолин

Палладий на угле (10%, 5,0 мг) добавляли к раствору соединения примера B158 (2,0 мг) в тетрагидрофуране (2,0 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота (1 атм) в течение 1 часа. Катализатор удаляли фильтрованием и фильтрат концентрировали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (0,21 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (6H, т), 1,25-1,32 (2H, м), 1,48-1,57 (2H, м), 2,53 (2H, т), 2,80 (2H, кв), 4,62 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,20 (2H, д), 7,49-7,52 (2H, м), 7,73 (1H, д), 7,95 (1H, с), 8,43 (1H, д).

Пример B160

1-(4-Бутилбензил)-7-[4-(тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-бутинил]изохинолин

Ацетат палладия (11 мг; 0,047 ммоль), 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен (72 мг; 0,13 ммоль) и хлорид лития (25 мг; 0,59 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B155 (100 мг, 0,24 ммоль) и 2-(3-бутинилокси)тетрагидро-2Н-пиран (73 мг; 0,47 ммоль) в диметилформамиде (3,0 мл) и систему продували азотом. Кроме того, добавляли триэтиламин (59 мкл; 0,43 ммоль) и иодид меди (2 мг; 0,018 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при 80°С в течение 24 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду и полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом. Этилацетатный слой промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (25 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,38 (2H, м), 1,52-1,67 (6H, м), 1,72-1,79 (1H, м), 1,79-1,88 (1H, м), 2,54 (2H, т), 2,78 (2H, т), 3,53-3,56 (1H, м), 3,66-3,72 (1H, м), 3,91-3,99 (2H, м), 4,60 (2H, с), 4,71-4,73 (1H, м), 7,08 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,50 (1H, д), 7,59-7,62 (1H, м), 7,72 (1H, д), 8,24 (1H, с), 8,48 (1H, д).

Пример B161

4-[1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолил]-3-бутин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B160 таким же способом, как в примере B29.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3Н, т), 1,27-1,39 (2Н, м), 1,51-1,57 (2Н, м), 1,83 (1Н, шир.с), 2,55 (2Н, т), 2,75 (2Н, т), 3,84-3,89 (2Н, м), 4,60 (2Н, с), 7,08 (2Н, д), 7,18 (2Н, д), 7,50 (1Н, д), 7,60-7,62 (1Н, м), 7,73 (1Н, д), 8,25 (1Н, с), 8,48 (1Н, д).

Пример B162

4-[1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолил]-1-бутанол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B161 таким же способом, как в примере B30.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,28-1,36 (2H, м), 1,50-1,59 (4H, м), 1,67-1,77 (3H, м), 2,53 (2H, т), 2,79 (2H, т), 3,63 (2H, т), 4,62 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,47-7,52 (2H, м), 7,73 (1H, д), 7,92 (1H, с), 8,43 (1H, д).

Пример B163

1-(4-Бутилбензил)-7-пропоксиизохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B154 таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,05 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,56 (2H, м), 1,76-1,84 (2H, м), 2,53 (2H, т), 3,92 (2H, т), 4,58 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,26-7,29 (1H, м), 7,34 (1H, д), 7,48 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,38 (1H, д).

Пример B164

1-(4-Бутилбензил)-7-(2-пиперидиноэтокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,43-1,58 (4H, м), 1,61-1,69 (4H, м), 2,51-2,55 (6H, м), 2,79 (2H, т), 4,11 (2H, т), 4,57 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,28-7,30 (1H, м), 7,36 (1H, д), 7,48 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,38 (1H, д).

Пример B165

N-(2-{[1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолил]окси}этил)-N,N-диметиламин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,57 (2H, м), 2,35 (6H, с), 2,53 (2H, т), 2,75 (2H, т), 4,06 (2H, т), 4,58 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,30-7,33 (1H, м), 7,36 (1H, д), 7,48 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,39 (1H, д).

Пример B166

1-(4-Бутилбензил)-7-изохинолил-(2-морфолиноэтиловый) эфир

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,58 (2H, м), 2,51-2,58 (6H, м), 2,81 (2H, т), 3,75 (4H, т), 4,11 (2H, т), 4,58 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,17 (2H, д), 7,28-7,31 (1H, м), 7,35 (1H, д), 7,49 (1H, д), 7,71 (1H, д), 8,39 (1H, д).

Пример B167

7-(Бензилокси)-1-(4-бутилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,54 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,54 (2H, с), 5,06 (2H, с), 7,05 (2H, д), 7,14 (2H, д), 7,34-7,43 (7H, м), 7,49 (1H, д), 7,72 (1H, д), 8,39 (1H, д).

Пример B168

1-(4-Бутилбензил)-7-(2-пиридилметокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,49-1,57 (2H, м), 2,52 (2H, т), 4,51 (2H, с), 5,25 (2H, с), 7,02 (2H, д), 7,14 (2H, д), 7,24-7,27 (1H, м), 7,40 (1H, дд), 7,47-7,50 (3H, м), 7,68-7,72 (1H, д), 7,74 (1H, д), 8,39 (1H, д), 8,64-8,66 (1H, м).

Пример B169

1-(4-Бутилбензил)-7-(3-пиридилметокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,58 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,57 (2H, с), 5,06 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,15 (2H, д), 7,31-7,36 (2H, м), 7,42 (1H, д), 7,51 (1H, д), 7,74-7,76 (2H, м), 8,42 (1H, д), 8,61-8,62 (1H, м), 8,69-8,70 (1H, м).

Пример B170

1-(4-Бутилбензил)-7-(4-пиридилметокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,56 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,53 (2H, с), 5,09 (2H, с), 7,04 (2H, д), 7,09 (2H, д), 7,33-7,39 (4H, м), 7,51 (1H, д), 7,76 (1H, д), 8,41 (1H, д), 8,63-8,64 (2H, м).

Пример B171

1-(4-Бутилбензил)-7-[(2-метоксибензил)окси]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,57 (2H, м), 2,53 (2H, т), 3,82 (3H, с), 4,52 (2H, с), 5,04 (2H, с), 6,88-6,91 (1H, м), 6,99-7,02 (2H, м), 7,05 (2H, д), 7,14 (2H, д), 7,32 (1H, т), 7,36 (1H, дд), 7,43 (1H, д), 7,48 (1H, д), 7,72 (1H, д), 8,39 (1H, д).

Пример B172

1-(4-Бутилбензил)-7-[(3-метоксибензил)окси]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,56 (2H, м), 2,53 (2H, т), 3,90 (3H, с), 4,53 (2H, с), 5,16 (2H, с), 6,93-6,98 (2H, м), 7,03 (2H, д), 7,15 (2H, д), 7,30-7,35 (1H, м), 7,37 (1H, дд), 7,41-7,43 (1H, м), 7,47 (1H, д), 7,51 (1H, д), 7,71 (1H, д), 8,37 (1H, д).

Пример B173

1-(4-Бутилбензил)-7-[(4-метоксибензил)окси]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,37 (2H, м), 1,51-1,57 (2H, м), 2,54 (2H, т), 3,83 (3H, с), 4,55 (2H, с), 4,99 (2H, с), 6,93 (2H, д), 7,06 (2H, д), 7,15 (2H, д), 7,32-7,36 (3H, м), 7,44 (1H, д), 7,48 (1H, д), 7,71 (1H, д), 8,38 (1H, д).

Пример B174

7-(1,3-Бензодиоксол-5-илметокси)-1-(4-бутилбензил)изохинолин.

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,37 (2H, м), 1,51-1,57 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,55 (2H, с), 4,95 (2H, с), 5,98 (2H, с), 6,82 (1H, д), 6,88 (1H, дд), 6,92 (1H, д), 7,06 (2H, д), 7,15 (2H, д), 7,33 (1H, дд), 7,42 (1H, д), 7,48 (1H, д), 7,72 (1H, д), 8,39 (1H, д).

Пример B175

1-(4-Бутилбензил)-7-[(2-нитробензил)окси]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,87 (3H, т), 1,26-1,34 (2H, м), 1,48-1,56 (2H, м), 2,51 (2H, т), 4,53 (2H, с), 5,49 (2H, с), 7,03 (2H, д), 7,14 (2H, д), 7,40 (1H, дд), 7,430-7,434 (1H, м), 7,45-7,49 (1H, м), 7,51 (1H, д), 7,64-7,68 (1H, м), 7,76 (1H, д), 7,85-7,87 (1H, м), 8,22-8,24 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B176

1-(4-Бутилбензил)-7-[(3-нитробензил)окси]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,56 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,55 (2H, с), 5,14 (2H, с), 7,05 (2H, д), 7,11 (2H, д), 7,37-7,40 (2H, м), 7,51 (1H, д), 7,55-7,59 (1H, м), 7,73-7,78 (2H, м), 8,19-8,22 (1H, м), 8,32-8,33 (1H, м), 8,42 (1H, д).

Пример B177

1-(4-Бутилбензил)-7-(фенетилокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,26-1,36 (2H, м), 1,49-1,57 (2H, м), 2,52 (2H, т), 3,10 (2H, т), 4,18 (2H, т), 4,56 (2H, с), 7,04 (2H, д), 7,16 (2H, д), 7,26-7,28 (4H, м), 7,33-7,35 (3H, м), 7,48 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,38-8,39 (1H, м).

Пример B178

1-(4-Бутилбензил)-7-(3-фенилпропокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,49-1,57 (2H, м), 2,09-2,15 (2H, м), 2,52 (2H, т), 2,82 (2H, т), 3,97 (2H, т), 4,55 (2H, с), 7,04 (2H, д), 7,16 (2H, д), 7,20-7,23 (3H, м), 7,27-7,33 (4H, м), 7,48 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,38 (1H, д).

Пример B179

1-(4-Бутилбензил)-7-(2-циклогексилэтокси)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B148.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 0,94-1,02 (2H, м), 1,17-1,36 (4H, м), 1,36-1,57 (4H, м), 1,65-1,76 (7H, м), 2,53 (2H, т), 3,98 (2H, т), 4,58 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,25-7,28 (1H, м), 7,33 (1H, д), 7,47 (1H, д), 7,69 (1H, д), 8,37 (1H, д).

Пример B180

6-Бензоил-5,6-дигидро[1,3]диоксоло[4,5-g]изохинолин-5-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение получали обработкой [1,3]диоксоло[4,5-g]изохинолина таким же способом, как в примере B140.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 5,94-5,96 (1H, м), 6,03 (1H, д), 6,04 (1H, д), 6,47-6,54 (2H, м), 6,70 (1H, с), 6,83 (1H, с), 7,45-7,49 (2H, м), 7,54-7,62 (3H, м).

Пример B181

5-(4-Бутилбензил)[1,3]диоксоло[4,5-g]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B180 и соединения примера B1 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,37 (2H, м), 1,51-1,57 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,50 (2H, с), 6,05 (2H, с), 7,05-7,07 (3H, м), 7,16 (2H, д), 7,38-7,40 (2H, м), 8,35 (1H, д).

Пример B182

2-Бензоил-6-бром-1,2-дигидро-1-изохинолинкарбонитрил

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 6-бромизохинолина, который синтезировали согласно J. Am. Chem. Soc., 183 (1942), таким же способом, как в примере B140.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 6,01 (1H, д), 6,53 (1H, шир.с), 6,70 (1H, шир.д), 7,24 (1H, д), 7,33 (1H, д), 7,47-7,51 (3H, м), 7,56 (3H, м).

Пример B183

6-Бром-1-(4-бутилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B182 и соединения примера B1 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,36 (2H, м), 1,50-1,58 (2H, м), 2,53 (2H, т), 4,60 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,15 (2H, д), 7,46 (1H, д), 7,59 (1H, кв), 7,98 (1H, д), 8,02 (1H, д), 8,51 (1H, д).

Пример B184

Смесь 2-бензоил-5-бром-1,2-дигидро-1-изохинолинкарбонитрила и 2-бензоил-7-бром-1,2-дигидро-1-изохинолинкарбонитрила

Указанные в заголовке соединения получали обработкой 5- или 7-бромизохинолина, который синтезировали согласно J. Am. Chem. Soc., 61, 183 (1939), таким же способом, как в примере B140. Полученные соединения использовали в следующей реакции без разделения и очистки.

Пример B185

7-Бром-1-(4-бутилбензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B184 и соединения примера B1 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,37 (2H, м), 1,51-1,58 (2H, м), 2,55 (2H, т), 4,58 (2H, с), 7,09 (2H, д), 7,18 (2H, д), 7,51-7,53 (1H, м), 7,69-7,70 (2H, м), 8,33-8,34 (1H, м), 8,52 (1H, д).

Пример B186

5-Бензоил-4,5-дигидротиено[3,2-c]пиридин-4-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение получали обработкой тиено[3,2-c]пиридина, синтезированного согласно J. Heterocycl. Chem., 30, 183 (1993), таким же способом, как в примере B140.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 6,05 (1H, д), 6,57 (1H, шир.д), 6,66 (1H, с), 7,07 (1H, д), 7,32 (1H, д), 7,46-7,50 (2H, м), 7,54-7,62 (3H, м).

Пример B187

4-(4-Бутилбензил)тиено[3,2-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B186 и соединения примера B1 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,27-1,37 (2H, м), 1,51-1,59 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,47 (2H, с), 7,07 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,42 (1H, д), 7,47 (1H, дд), 7,68 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B188

4-(4-Метоксибензил)тиено[3,2-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B186 и 4-метоксибензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,75 (3H, с), 4,44 (2H, с), 6,79-6,82 (2H, м), 7,19-7,22 (2H, м), 7,43 (1H, д), 7,46 (1H, дд), 7,68 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B189

4-(Тиено[3,2-c]пиридин-4-илметил)фенилтрифторметансульфонат

Раствор трибромида бора в метиленхлориде (1,0 М, 10 мл, 10 ммоль) по каплям добавляли к раствору соединения примера B188 (510 мг, 2,0 ммоль) в метиленхлориде (10 мл), охлажденному до 0°С, и полученную реакционную смесь перемешивали при такой температуре в течение 1,5 часов. Реакционную смесь делали слабощелочной добавлением насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия, экстрагировали этилацетатом, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в пиридине и полученный в результате раствор охлаждали до 0°С. После добавления к нему по каплям трифторметансульфонового ангидрида (0,34 мл; 2,1 ммоль) смесь перемешивали при указанной температуре в течение 2 часов, выливали на лед, экстрагировали этилацетатом, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, получая указанное в заголовке соединение (312 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,52 (2H, с), 7,16-7,18 (2H, м), 7,36 (2H, м), 7,43-7,44 (1H, м), 7,49 (1H, д), 7,73 (1H, д), 8,42 (1H, д).

Пример B190

4-(4-Бромбензил)тиено[3,2-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B186 и соединения примера B31 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,45 (2H, с), 7,14-7,16 (2H, м), 7,37-7,39 (2H, м), 7,41-7,43 (1H, м), 7,45 (1H, д), 7,71 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B191

4-(4-Бром-2-фторбензил)тиено[3,2-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B186 и 4-бром-2-фторбензилбромида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,46 (2H, с), 7,11 (1H, т), 7,15-7,18 (1H, м), 7,22-7,25 (1H, м), 7,47 (1H, д), 7,49 (1H, д), 7,71 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B192

4-{4-[4-(Тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-бутинил]бензил}тиено[3,2-c]пиридин.

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B189 и 2-(3-бутинилокси)тетрагидро-2H-пирана таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,40-1,90 (6H, м), 2,69 (2H, т), 3,45-3,65 (2H, м), 3,78-3,95 (2H, м), 4,48 (2H, с), 4,66-4,69 (1H, м), 7,18 (2H, д), 7,27 (2H, д), 7,41 (1H, д), 7,44 (1H, д), 7,70 (1H, д), 8,41 (1H, д).

Пример B193

4-[4-(Тиено[3,2-c]пиридин-4-илметил)фенил]-3-бутин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B192 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,67 (2H, т), 3,79 (2H, т), 4,50 (2H, с), 7,20 (2H, д), 7,32 (2H, д), 7,41 (1H, д), 7,44 (1H, д), 7,71 (1H, д), 8,42 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона гидроксильной группы.

Пример B194

6-Бензоил-6,7-дигидротиено[2,3-c]пиридин-7-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение получали обработкой тиено[2,3-c]пиридина, который синтезировали согласно J. Heterocycl. Chem., 30, 183 (1993), таким же способом, как в примере B140.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 6,07 (1H, д), 6,56 (1H, шир.д), 6,75 (1H, с), 6,97 (1H, д), 7,37 (1H, д), 7,46-7,51 (2H, м), 7,54-7,64 (3H, м).

Пример B195

7-(4-Бутилбензил)тиено[2,3-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B194 и соединения примера B1 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,37 (2H, м), 1,51-1,59 (2H, м), 2,55 (2H, т), 4,40 (2H, с), 7,09 (2H, д), 7,28 (2H, д), 7,34 (1H, д), 7,57 (1H, д), 7,62 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B196

7-(4-Метоксибензил)тиено[2,3-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B194 и 4-метоксибензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,76 (3H, с), 4,38 (2H, с), 6,81-6,83 (2H, м), 7,28-7,30 (2H, м), 7,35 (1H, д), 7,57 (1H, д), 7,62 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B197

4-(Тиено[2,3-c]пиридин-7-илметил)фенилтрифторметансульфонат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B196 таким же способом, как в примере B189.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,44 (2H, с), 7,17-7,19 (2H, м), 7,38-7,40 (1H, м), 7,44-7,46 (2H, м), 7,61 (1H, д), 7,65-7,67 (1H, м), 8,47-8,49 (1H, м).

Пример B198

7-(4-Бромбензил)тиено[2,3-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой

соединения примера B194 и соединения примера B31 таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,37 (2H, с), 7,23-7,25 (2H, м), 7,37 (1H, д), 7,39-7,41 (2H, м), 7,59 (1H, д), 7,63-7,65 (1H, м), 8,47 (1H, д).

Пример B199

7-(4-Бром-2-фторбензил)тиено[2,3-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B194 и 4-бром-2-фторбензилбромида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,40-4,41 (2H, м), 7,12-7,20 (2H, м), 7,23-7,26 (1H, м), 7,37-7,39 (1H, м), 7,59-7,62 (1H, м), 7,65-7,67 (1H, м), 8,45-8,47 (1H, м).

Пример B200

7-{4-[4-(Тетрагидро-2H-2-пиранилокси)-1-бутинил]бензил}тиено[2,3-c]пиридин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B197 и 2-(3-бутинилокси)тетрагидро-2H-пирана таким же способом, как в примере B42.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,50-1,90 (6H, м), 2,69 (2H, т), 3,49-3,54 (1H, м), 3,58-3,65 (1H, м), 3,85-3,95 (2H, м), 4,41 (2H, с), 4,68 (1H, т), 7,26-7,31 (4H, м), 7,36 (1H, д), 7,58 (1H, д), 7,63 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B201

4-[4-(Тиено[2,3-c]пиридин-7-илметил)фенил]-3-бутин-1-ол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B200 таким же способом, как в примере B47.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,99 (1H, шир.с), 2,67 (2H, т), 3,79 (2H, т), 4,42 (2H, с), 7,27-7,34 (4H, м), 7,36 (1H, д), 7,59 (1H, д), 7,64 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B202

2-Хлор-3-(метоксиметокси)пиридин

Гидрид натрия (66%; 633 мг; 17,4 ммоль) добавляли к охлажденному на льду раствору 2-хлор-3-гидроксипиридина (2,05 г; 15,8 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) в атмосфере азота и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 15 минут. Добавляли хлорметилметиловый эфир (1,32 мл; 17,4 ммоль) и полученную в результате реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 30 минут, затем при комнатной температуре еще в течение 2 часов. После добавления воды реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (2,44 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,53 (3H, с), 5,28 (2H, с), 7,19 (1H, дд), 7,49 (1H, дд), 8,06 (1H, дд).

Пример B203

2-Хлор-4-иод-3-(метоксиметокси)пиридин

Раствор соединения примера B202 (1,40 г; 8,06 ммоль) в диэтиловом эфире (8 мл) по каплям добавляли к раствору 1,51 М раствора трет-бутиллитий-н-пентана (8,01 мл; 12,1 ммоль) в диэтиловом эфире (15 мл), охлажденному до -78°С в атмосфере азота, и реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 15 минут. После добавления иода (3,07 г; 12,1 ммоль) реакционную смесь постепенно нагревали до комнатной температуры. Затем добавляли водный раствор тиосульфата натрия и слой диэтилового эфира отделяли, промывали насыщенным раствором соли и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (356 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,73 (3H, с), 5,22 (2H, с), 7,69 (1H, д), 7,80 (1H, д).

Пример B204

7-Хлорфуро[2,3-c]пиридин

Триметилсилилацетилен (28,3 мкл; 0,201 ммоль) и триэтиламин (59,8 мкл; 0,429 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B203 (36,6 мг; 0,143 ммоль), тетракис(трифенилфосфин)палладия (16,5 мг; 0,0143 ммоль) и иодида меди (I) (2,7 мг; 0,014 ммоль) в диметилформамиде (1,5 мл) и полученную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 часов. После того как смеси давали охладиться до комнатной температуры, к ней добавляли воду и полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в метаноле (5 мл), добавляли карбонат калия (100 мг; 0,724 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После добавления воды смесь экстрагировали диэтиловым эфиром, промывали насыщенным раствором соли и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (5,5 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 6,89 (1H, д), 7,51 (1H, д), 7,83 (1H, д), 8,21 (1H, д).

Пример B205

4-Бутилбензилмагнийхлорид

Смешанный раствор соединения примера B1 (1,04 г; 5,69 ммоль), магния (761 мг; 31,3 ммоль) и каталитического количества 1,2-дибромэтана в диэтиловом эфире (11 мл) инициировали кипячением с обратным холодильником. После удаления источника нагрева к реакционной смеси по каплям добавляли раствор соединения примера B1 (4,16 г; 22,8 ммоль) в диэтиловом эфире (60 мл) со скоростью, которая поддерживала слабое кипячение с обратным холодильником, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 30 минут. Затем смеси давали охладиться до комнатной температуры, получая указанное в заголовке соединение в виде 0,4 М раствора в диэтиловом эфире. Указанный раствор как таковой использовали в следующей реакции.

Пример B206

7-(4-Бутилбензил)фуро[2,3-c]пиридин

Соединение примера B205 (300 мкл; 0,1 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B204 (5,0 мг; 0,033 ммоль) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорникеля (II) (4,5 мг; 0,0065 ммоль) в тетрагидрофуране (1 мл) и смесь перемешивали при 50°С в течение 1 часа. После того как смеси давали охладиться до комнатной температуры, добавляли этилацетат. Полученную в результате смесь промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным раствором соли, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с NH-силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (2,9 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,29-1,35 (2H, м), 1,50-1,58 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,40 (2H, с), 6,78 (1H, д), 7,08 (2H, д), 7,30 (2H, д), 7,40 (1H, д), 7,72 (1H, д), 8,34 (1H, д).

Пример B207

7-(4-Бутилбензил)-1H-пирроло[2,3-c]пиридин

Соединение примера B205 (800 мкл; 0,3 ммоль) добавляли к раствору 1-хлорпирролопиридина (19,4 мг; 0,127 ммоль), который синтезировали из 2-хлор-3-аминопиридина согласно способу H07-165, 708A, и дихлор(дифенилфосфинопропан)никеля (6,9 мг; 0,013 ммоль) в тетрагидрофуране (1 мл) при охлаждении на льду и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 4 часов. После того как смеси давали охладиться до комнатной температуры, добавляли этилацетат. Полученную в результате смесь промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным раствором соли, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (7,1 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,31-1,37 (2H, м), 1,55-1,59 (2H, м), 2,58 (2H, т), 4,44 (2H, с), 6,50 (1H, д), 7,12 (2H, д), 7,18 (1H, д), 7,22 (2H, д), 7,45 (1H, д), 8,21 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона NH.

Пример B208

4-(4-Бутилбензил)-1-имидазо[4,5-c]пиридин

Соединение примера B205 (3,45 мл; 1,38 ммоль) добавляли к раствору 1-хлоримидазопиридина (88,6 мг; 0,577 ммоль), который синтезировали из 4-амино-2-хлорпиридина согласно способу, описанному в J. Heterocycl. Chem., 2, 196 (1965), и дихлор(дифенилфосфинопропан)никеля (31,3 мг; 0,0577 ммоль) в тетрагидрофуране (2 мл) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 2 часов. После того как смеси давали охладиться до комнатной температуры, добавляли этилацетат. Полученную в результате смесь фильтровали через силикагель и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (64,2 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,86 (3H, т), 1,23-1,32 (2H, м), 1,44-1,52 (2H, м), 2,47 (2H, т), 4,56 (2H, с), 7,02 (2H, д), 7,19 (2H, д), 7,34 (1H, д), 8,00 (1H, с), 8,25-8,27 (1H, м).

В спектре ЯМР не наблюдали протона NH.

Пример B209

4-Бром-1-изохинолинол

Бром (1,78 мл; 34,5 ммоль) добавляли к охлажденному на льду раствору 1-гидроксиизохинолина (5,01 г; 34,5 ммоль) в уксусной кислоте (50 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли воду, этилацетат и тетрагидрофуран и полученную в результате реакционную смесь фильтровали через фильтровальную бумагу. Органический слой промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток перекристаллизовывали из этилацетата и гексана, получая указанное в заголовке соединение (6,19 г).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ (м.д.): 7,56 (1H, с), 7,59-7,63 (1H, м), 7,76-7,78 (1H, м), 7,84-7,89 (1H, м), 8,23-8,26 (1H, м), 11,59 (1H, шир.с).

Пример B210

1,4-Дибромизохинолин

Смешанный раствор соединения примера B209 (1,40 г; 8,06 ммоль) и трибромида фосфора (6 мл) перемешивали при 150°С в течение 1 часа и затем кипятили с обратным холодильником еще в течение 1 часа. Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры, выливали в лед, затем нагревали до комнатной температуры. Добавляли этилацетат и полученную в результате смесь промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (845 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 7,76-7,80 (1H, м), 7,86-7,90 (1H, м), 8,19 (1H, д), 8,31-8,34 (1H, м), 8,48 (1H, с).

Пример B211

4-Бром-1-(4-бутилбензил)изохинолин

Соединение примера B205 (2,5 мл; 1 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B210 (200 мг; 0,697 ммоль) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорникеля (II) (75,6 мг; 0,139 ммоль) в тетрагидрофуране (2 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. После добавления этилацетата полученную в результате смесь последовательно промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (98 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,29-1,34 (2H, м), 1,51-1,60 (2H, м), 2,53 (2H, т), 4,59 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,16 (2H, д), 7,57-7,61 (1H, м), 7,73-7,77 (1H, м), 8,15-8,19 (2H, м), 8,69 (1H, с).

Пример B212

1-(4-Бутилбензил)-5,6,7,8-тетрагидроизохинолин

Соединение примера B211 (13,0 мг; 0,0367 ммоль) растворяли в смешанном растворе этилацетата и метанола (1:1, 1 мл), добавляли 10% палладий на угле (содержащий 50% воды, 13 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение 12 часов. После продувки реакционной системы азотом катализатор удаляли фильтрованием через целит. Полученный фильтрат концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (8,8 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,38 (2H, м), 1,52-1,59 (2H, м), 1,74-1,82 (4H, м), 2,55 (2H, т), 2,66 (2H, т), 2,81 (2H, т), 4,26 (2H, с), 7,07-7,15 (5H, м), 8,32 (1H, д).

Пример B213

1-[2-(Фенил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 2-фенилбензилбромидом вместо н-бутилбензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,62 (2H, с), 7,05 (1H, д), 7,16 (1H, дд), 7,22-7,50 (8H, м), 7,52 (1H, д), 7,58 (1H, дд), 7,65 (1H, д), 7,76 (1H, д), 8,47 (1H, д).

Пример B214

1-[4-Фтор-2-(трифторметил)бензил]изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 4-фтор-2-(трифторметил)бензилметансульфонатом вместо н-бутилбензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,83 (2H, с), 6,87 (1H, дд), 7,01 (1H, ддд), 7,43 (1H, дд), 7,54 (1H, дд), 7,61 (1H, д), 7,67 (1H, дд), 7,85 (1H, д), 7,96 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B215

1,3-Бензодиоксоил-4-ил-(1-изохинолил)метанол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 2,3-метилендиоксибензальдегидом таким же способом, как в примере B82.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 5,97-5,99 (1H, м), 6,09 (1H, шир.с), 6,20-6,40 (1H, м), 6,54-6,60 (2H, м), 6,65-6,70 (2H, м), 7,52 (1H, дд), 7,63 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,84 (1H, д), 8,04 (1H, д), 8,53 (1H, д).

Пример B216

1,3-Бензодиоксоил-4-ил-(1-изохинолил)метилацетат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B215 таким же способом, как в примере B38.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 2,23 (3H, с), 5,98-6,02 (2H, м), 6,74-6,79 (1H, м), 6,90-6,93 (1H, м), 7,15-7,19 (1H, м), 7,23-7,28 (1H, м), 7,58 (1H, дд), 7,60 (1H, д), 7,66 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,28 (1H, д), 8,57 (1H, д).

Пример B217

1-(1,3-Бензодиоксоил-4-илметил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B216 таким же способом, как в примере B39.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,62 (2H, с), 6,02 (2H, с), 6,64-6,70 (3H, м), 7,57 (1H, дд), 7,58 (1H, д), 7,66 (1H, дд), 7,83 (1H, д), 8,23 (1H, д), 8,50 (1H, д).

Пример B218

1-(1-Нафтилметил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой 1-(хлорметил)нафталином вместо н-бутилбензилхлорида таким же способом, как в примере B2.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 5,13 (2H, с), 6,96 (1H, д), 7,29 (1H, д), 7,45-7,67 (5H, м), 7,72 (1H, д), 7,84-7,90 (2H, м), 8,08 (1H, д), 8,26 (1H, д), 8,52 (1H, д).

Пример B219

3-Бромфенилбутират

н-Бутирилхлорид (7,25 мл) добавляли к охлажденному на льду раствору 3-бромфенола (10,0 г) в пиридине (50 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 3 часов, затем при комнатной температуре еще в течение 3,5 часов. После добавления льда реакционную смесь экстрагировали этилацетатом, промывали 1 N хлористоводородной кислотой и водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (12,77 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,04 (3H, т), 1,72-1,82 (2H, м), 2,54 (2H, т), 7,04 (1H, дд), 7,22-7,29 (2H, м), 7,36 (1H, д).

Пример B220

1-(4-Бром-2-гидроксифенил)-1-бутанон

Хлорид алюминия (10,51 г) добавляли к раствору соединения примера B219 (12,77 г) в хлорбензоле (70 мл) в атмосфере азота и полученную реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 9 часов. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры к ней добавляли лед. Полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом, промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния и затем концентрировали при пониженном давлении. Полученное таким образом соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,53-1,65 (2H, м), 3,00 (2H, т), 7,02 (1H, дд), 7,19 (1H, д), 7,78 (1H, д), 12,50 (1H, с).

Пример B221

1-(4-Бром-2-метоксифенил)-1-бутанон

Карбонат калия (9,07 г) и метилиодид (3,92 мл) добавляли к раствору соединения примера B220 (13,30 г) в ацетоне (75 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 4 часов. Реакционную смесь фильтровали через целит, добавляли эфир, чтобы удалить нерастворимые вещества фильтрованием, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (9,52 г).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,95 (3H, т), 1,64-1,74 (2H, м), 2,91 (2H, т), 3,90 (3H, с), 7,10 (1H, д), 7,14 (1H, дд), 7,54 (1H, д).

Пример B222

4-Бром-1-бутил-2-метоксибензол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B221 таким же способом, как в примере B3.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,92 (3H, т),1,29-1,39 (2H, м), 1,48-1,56 (2H, м), 2,54 (2H, т), 3,81 (3H, с), 6,95 (1H, с), 6,96-7,02 (2H, м).

Пример B223

(4-Бутил-3-метоксифенил)(1-изохинолил)кетон

Смесь, содержащую указанное в заголовке соединение, получали обработкой соединения примера B222 таким же способом, как в примере B36. Полученную смесь использовали в следующей реакции без разделения и очистки.

Пример B224

(4-Бутил-3-метоксифенил)(1-изохинолил)метанол

Смесь, содержащую указанное в заголовке соединение, получали обработкой соединения примера B223 таким же способом, как в примере B37.

Полученную смесь использовали в следующей реакции без разделения и очистки.

Пример B225

(4-Бутил-3-метоксифенил)(1-изохинолил)метилацетат

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B224 таким же способом, как в примере B38.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,24-1,38 (2H, м), 1,46-1,60 (2H, м), 2,24 (3H, с), 2,54 (2H, т), 3,76 (3H, с), 6,97 (1H, с), 6,98 (1H, д), 7,06 (1H, д), 7,53-7,67 (4H, м), 7,83 (1H, д), 8,26 (1H, д), 8,58 (1H, д).

Пример B226

1-(4-Бутил-3-метоксибензил)изохинолин

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B225 таким же способом, как в примере B39.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,27-1,38 (2H, т), 1,45-1,54 (2H, т), 2,52 (2H, т), 3,72 (3H, с), 4,63 (2H, с), 6,78 (1H, д), 6,79 (1H, с), 6,99 (1H, д), 7,53 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 7,64 (1H, дд), 7,80 (1H, д), 8,19 (1H, д), 8,49 (1H, д).

Пример B227

2-Бутил-5-(1-изохинолилметил)фенол

Указанное в заголовке соединение получали обработкой соединения примера B226 таким же способом, как в примере B40.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,30-1,40 (2H, м), 1,52-1,65 (2H, м), 2,55 (2H, т), 4,55 (2H, с), 6,46 (1H, шир.с), 6,85 (1H, д), 7,03 (1H, д), 7,32-7,40 (1H, м), 7,55 (1H, дд), 7,68 (1H, дд), 7,81 (1H, д), 7,94-8,05 (1H, м), 8,14 (1H, д).

В спектре ЯМР не наблюдали протона фенольной гидроксильной группы.

Пример B228

2-Бром-3-(метоксиметокси)пиридин

Указанное в заголовке соединение синтезировали таким же способом, как в примере B202, используя 2-бром-3-гидроксипиридин.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,53 (3H, с), 5,29 (2H, с), 7,19-7,23 (1H, м), 7,42-7,45 (1H, м), 8,04-8,06 (1H, м).

Пример B229

2-(4-Бутилбензил)-3-(метоксиметокси)пиридин

Соединение примера B205 (7 мл, 3 ммоль) добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера B228 (524 мг; 2,40 ммоль) и дихлор(дифенилфосфинопропан)никеля (65,0 мг; 0,120 ммоль) в тетрагидрофуране (10 мл) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 5 часов. После того как смеси давали охладиться до комнатной температуры, добавляли этилацетат. Полученную в результате смесь последовательно промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток фильтровали через NH-силикагель. После концентрирования при пониженном давлении остаток растворяли в метаноле (15 мл), добавляли триэтиламин (500 мкл; 3,59 ммоль) и 10% палладий на угле (содержащий 50% воды, 50 мг) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение 3 часов. После продувки системы азотом катализатор удаляли фильтрованием через целит и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (280 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89 (3H, т), 1,28-1,34 (2H, м), 1,52-1,58 (2H, м), 2,53 (2H, т), 3,33 (3H, с), 4,16 (2H, с), 5,16 (2H, с), 7,04-7,10 (3H, м), 7,20 (2H, д), 7,33-7,35 (1H, м), 8,19-8,20 (1H, м).

Пример B230

2-(4-Бутилбензил)-3-пиридинол

Трифторуксусную кислоту (1 мл) добавляли к раствору соединения примера B229 (256 мг; 0,849 ммоль) в метиленхлориде (5 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После добавления насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия и этилацетата реакционную смесь промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (182 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,28-1,37 (2H, м), 1,51-1,58 (2H, м), 2,54 (2H, т), 4,20 (2H, с), 7,02-7,08 (4H, м), 7,22 (2H, д), 8,08-8,09 (1H, м).

В спектре ЯМР не наблюдали протона фенольной гидроксильной группы.

Пример B231

2-(4-Бутилбензил)-3-метоксипиридин

Карбонат калия (33,0 мг; 0,239 ммоль) и метилиодид (14,9 мкл; 0,239 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B230 (19,2 мг; 0,0796 ммоль) в ацетоне (1 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. После добавления этилацетата реакционную смесь промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (1,47 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,32-1,34 (2H, м), 1,53-1,57 (2H, м), 2,54 (2H, т), 3,82 (3H, с), 4,14 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,10-7,11 (2H, м), 7,21 (2H, д), 8,12-8,14 (1H, м).

Пример B232

2-(4-Бутилбензил)-3-хлорпиридин

Соединение примера B205 (12 мл, 5 ммоль) добавляли к охлажденному на льду смешанному раствору 2,3-дихлорпиридина (525 мг; 3,55 ммоль) и дихлор(дифенилфосфинопропан)никеля (96,2 мг; 0,178 ммоль) в тетрагидрофуране (4 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После добавления этилацетата реакционную смесь последовательно промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (199 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,29-1,38 (2H, м), 1,52-1,60 (2H, м), 2,56 (2H, т), 4,28 (2H, с), 7,08-7,13 (3H, м), 7,21 (2H, д), 7,64 (1H, дд), 8,46 (1H, дд).

Пример B233

2-(4-Бутилбензил)-3-этилпиридин

Этилмагнийхлорид (0,97 М, 102 мкл, 0,993 ммоль) добавляли к смешанному раствору соединения примера B232 (12,9 мг; 0,0496 ммоль) и дихлор(дифенилфосфиноферроцен)никеля (3,4 мг; 0,0050 ммоль) в тетрагидрофуране (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 часа, затем кипятили с обратным холодильником еще в течение 2 часов. После того как смеси давали возможность достичь комнатной температуры, добавляли этилацетат. Реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным раствором соли, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (3,29 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90-0,93 (6H, м), 1,30-1,37 (2H, м), 1,54-1,59 (2H, м), 2,55-2,59 (4H, м), 4,12 (2H, с), 7,05-7,18 (5H, м), 7,55-7,59 (1H, м), 8,53-8,55 (1H, м).

Пример B234

трет-Бутил N-(2-бром-3-пиридил)карбамат

N-Бромсукцинимид (7,51 г; 42,2 ммоль) добавляли к охлажденному на льду смешанному раствору 3-аминопиридина (3,97 г; 42,2 ммоль) в диметилформамиде (25 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 30 минут. После добавления этилацетата реакционную смесь промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Раствор остатка в метиленхлориде (20 мл) охлаждали на льду, затем к раствору добавляли триэтиламин (3,74 мл; 26,8 ммоль), каталитическое количество диметиламинопиридина и ди-трет-бутилдикарбонат (3,08 мл; 13,4 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После концентрирования при пониженном давлении остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (344 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,55 (9H, с), 7,03 (1H, шир.с), 7,25 (1H, дд), 8,03 (1H, дд), 8,46 (1H, д).

Пример B235

2-Бром-3-(N-трет-бутоксикарбонил-N-метил)аминопиридин

Метилиодид (157 мкл; 2,52 ммоль) и 66% гидрид натрия (91,6 мг; 2,52 ммоль) добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера B234 (344 мг; 1,26 ммоль) в диметилформамиде (5 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 40 минут. После добавления этилацетата реакционную смесь промывали насыщенным раствором соли и фильтровали через силикагель. Органический слой концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (356 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 1,36 (9H, с), 3,17 (3H, с), 7,30 (1H, дд), 7,55 (1H, д), 8,30 (1H, дд).

Пример B236

N-[2-(4-Бутилбензил)-3-пиридил]-N-метиламин

К метиленхлоридному раствору (2 мл) соединения, которое получали введением 4-бутилбензильной группы в соединение примера B235 (62,8 мг; 0,219 ммоль) таким же способом, как в примере B211, добавляли трифторуксусную кислоту (2 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и затем по каплям добавляли к водному раствору гидрокарбоната натрия. После добавления этилацетата смесь промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (29,7 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,29-1,38 (2H, м), 1,53-1,60 (2H, м), 2,56 (2H, т), 2,72 (3H, с), 3,63 (1H, шир.с), 4,09 (2H, с), 6,86 (1H, д), 7,08-7,12 (5H, м), 7,98 (1H, дд).

Пример B237

N-[2-(4-Бутилбензил)-3-пиридил]-N,N-диметиламин

Уксусную кислоту (12,1 мкл; 0,211 ммоль), 37% формалин (15,8 мкл; 0,211 ммоль) и триацетоксиборогидрид натрия (44,7 мг; 0,211 ммоль) добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера B236 (26,8 мг; 0,105 ммоль) в метиленхлориде (2 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. После добавления этилацетата смесь промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (23,3 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,30-1,36 (2H, м), 1,52-1,59 (2H, м), 2,55 (2H, т), 2,67 (6H, с), 4,24 (2H, с), 7,06 (2H, д), 7,10 (1H, дд), 7,18 (2H, д), 7,40 (1H, дд), 8,27 (1H, дд).

Пример B238

2-(4-Бутилбензил)-4-метоксипиридин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B211, используя 2-хлор-4-метоксипиридин.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,91 (3H, т), 1,31-1,37 (2H, м), 1,53-1,59 (2H, м), 2,57 (2H, т), 3,78 (3H, с), 4,06 (2H, с), 6,61-6,65 (2H, м), 7,11 (2H, д), 7,17 (2H, д), 8,36 (1H, д).

Пример B239

2-(4-Бутилбензил)-4-хлорпиридин

Оксихлорид фосфора (57,0 мкл; 0,612 ммоль) добавляли к охлажденному на льду раствору соединения примера B238 (52,0 мг; 0,204 ммоль) в диметилформамиде (1 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при 100°С в течение 8 часов. Реакционной смеси давали охладиться, выливали на лед и нагревали до комнатной температуры. После добавления этилацетата смесь промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором соли, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (2,29 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,92 (3H, т), 1,31-1,38 (2H, м), 1,53-1,61 (2H, м), 2,59 (2H, т), 4,10 (2H, с), 7,12-,18 (6H, м), 8,44 (1H, д).

Пример B240

2-Хлор-3-метоксипиридин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B231, используя 2-хлор-3-гидроксипиридин.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,93 (3H, с), 7,21-7,22 (2H, м), 7,99-8,01 (1H, м).

Пример B241

2-Хлор-3,4-диметоксипиридин

Раствор диизопропиламина (84,0 мкл; 0,599 ммоль) и соединения примера B240 (860 мг; 5,99 ммоль) в тетрагидрофуране (4 мл) добавляли к раствору в тетрагидрофуране (11 мл) 1,06 М раствора фениллития в смеси циклопентан-диэтиловый эфир, охлажденному до -78°С в атмосфере азота. Полученную реакционную смесь перемешивали при -40°С в течение 1 часа, затем при -18°С еще в течение 20 минут. Реакционную смесь снова охлаждали до -78°С, к ней по каплям добавляли триметоксиборат (2,04 мл; 18,0 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при 0°С в течение 20 минут. При указанной температуре добавляли водный раствор аммиака (29%, 30 мл), хлорид аммония (4,5 г) и водный раствор пероксида водорода (30%, 12 мл) в указанном порядке и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли насыщенный тиосульфат натрия, уксусную кислоту и этилацетат и смесь промывали насыщенным раствором соли. Этилацетатный слой, полученный после фильтрования через силикагель, концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывали таким же способом, как в примере B231, получая указанное в заголовке соединение (31,3 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,89 (3H, с), 3,94 (3H, с), 6,82 (1H, д), 8,05 (1H, д).

Пример B242

2-(4-Бутилбензил)-3,4-диметоксипиридин

Указанное в заголовке соединение получали таким же способом, как в примере B206, используя соединение примера B241.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,90 (3H, т), 1,26-1,35 (2H, м), 1,53-1,57 (2H, м), 2,54 (2H, т), 3,70 (3H, с), 3,89 (3H, с), 4,12 (2H, с), 6,72 (1H, д), 7,06 (2H, д), 7,21 (2H, д), 8,20 (1H, д).

Пример B243

2,4-Ди-(4-бутилбензил)-3-метоксипиридин

Раствор соединения примера B240 (436 мг; 3,04 ммоль) в диэтиловом эфире (2 мл) добавляли к раствору в диэтиловом эфире (5 мл) 1,43 М раствора трет-бутиллития в н-пентане (2,76 мл; 3,95 ммоль), охлажденному до -78°С в атмосфере азота, и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 30 минут. Затем добавляли раствор тетраметилэтилендиамина (688 мкл; 4,56 ммоль) и гексахлорэтана (719 мг; 3,04 ммоль) в диэтиловом эфире (3 мл) и реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 1 часа. После постепенного нагревания до комнатной температуры добавляли этилацетат и смесь промывали насыщенным раствором соли. Этилацетатный слой, полученный после фильтрования через силикагель, концентрировали при пониженном давлении. Полученный в результате остаток обрабатывали таким же способом, как в примере B206, получая указанное в заголовке соединение (10,1 мг).

¹ Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 0,89-0,94 (6H, м), 1,31-1,37 (4H, м), 1,52-1,62 (4H, м), 2,53-2,59 (4H, м), 3,74 (3H, с), 4,07 (2H, с), 4,13 (2H, с), 6,84 (1H, д), 6,98 (1H, д), 7,04-7,22 (8H, м).

Пример B244

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(метоксиметокси)пиридин

Раствор соединения примера B228 (422 мг; 1,94 ммоль) в тетрагидрофуране (3 мл) добавляли к раствору в тетрагидрофуране (3 мл) 2,47 М раствора н-бутиллития в н-гексане (862 мкл; 2,13 ммоль), охлажденному до -78°С в атмосфере азота, и полученную реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 1 часа. После добавления бромида меди (I) (139 мг; 0,968 ммоль) реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 1 часа и снова охлаждали до -78°С. Затем добавляли 4-бром-2-фторбензилбромид (259 мг; 0,968 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при 0°С в течение 1 часа. Затем добавляли тетраметилэтилендиамин (584 мкл; 3,88 ммоль) и полученную в результате реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 1 часа. После добавления к реакционной смеси диэтилового эфира и водного раствора аммиака органический слой промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (81,0 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,38 (3H, с), 4,17 (2H, с), 5,18 (2H, с), 7,04 (1H, т), 7,11-7,22 (3H, м), 7,38 (1H, дд), 8,19 (1H, дд).

Пример B245

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-пиридинол

Трифторуксусную кислоту (1 мл) добавляли к соединению примера B244 (134 мг; 0,411 ммоль) в метиленхлориде (4 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После нейтрализации смеси насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия добавляли этилацетат. Этилацетатный слой промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (97,5 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 4,17 (2H, с), 7,10-7,24 (5H, м), 8,15 (1H, т).

В спектре ЯМР не наблюдали протона фенольной гидроксильной группы.

Пример B246

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-метоксипиридин

Карбонат калия (38,7 мг; 0,280 ммоль) и метилиодид (10,5 мкл; 0,168 ммоль) добавляли к раствору соединения примера B245 (15,8 мг; 0,0560 ммоль) в диметилформамиде (1 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После добавления этилацетата реакционную смесь промывали насыщенным раствором соли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая указанное в заголовке соединение (14,0 мг).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.): 3,82 (3H, с), 4,15 (2H, с), 7,03 (1H, т), 7,12-7,22 (4H, м), 8,13 (1H, дд).

Следующие соединения примера B синтезировали таким же способом, как в примере B246, и очистку выполняли посредством ЖХ-МС [элюент: раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты : водный раствор, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты, от 1:99 до 100:0/20-минутный цикл, скорость потока: 20 мл/мин, колонка: YMC Combiprep ODS-AM, 20 мм (диаметр) x 50 мм (длина)].

Пример B247

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-этоксипиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 310,0.

Пример B248

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-пропоксипиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 324,0.

Пример B249

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-бутоксипиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 338,1.

Пример B250

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(пентилокси)пиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 352,1.

Пример B251

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(гексилокси)пиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 366,0.

Пример B252

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(2-фторэтокси)пиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 328,0.

Пример B253

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(3-фторпропокси)пиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 342,0.

Пример B254

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-изопропоксипиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 324,0.

Пример B255

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(2,2,2-трифторэтокси)пиридин

MS m/z (ESI: MH⁺): 364,0.

Пример B256

2-(4-Бром-2-фторбензил)-3-(3,3,3-трифторпропокси)пиридин

MS m/z (ESI: MH+): 378,0.

Пример B257

Соединения оценивали, используя репортерную систему S. cerevisiae согласно примеру A2. Считали, что наименьшая концентрация, при которой активность цефалоспориназы во фракции клеточных стенок становится равной 50% или менее, по сравнению с активностью, полученной в том случае, когда обработку соединением не проводили, является значением IC₅₀. Влияние приведенных в качестве примеров соединений показано в таблице.

СоединениеIC₅₀
(мкг/мл)1-(4-Бутилбензил)изохинолин (пример B2)0,39N1-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]-2-пропинил}ацетамид (пример B60)6,25N1-{3-[4-(1-Изохинолилметил)фенил]пропил}-N1-метилацетамид (пример B73)505-Бутил-2-(1-изохинолилметил)фенол (пример B85)0,204-(4-Бутилбензил)тиено[3,2-c]пиридин (пример B187)0,787-(4-Бутилбензил)тиено[2,3-c]пиридин (пример B195)0,392-(4-Бутилбензил)-3-метоксипиридин (пример B231)0,782-(4-Бутилбензил)-3,4-диметоксипиридин (пример B242)0,78

Промышленная применимость

В данном изобретении выявлены гены, кодирующие белки, принимающие участие в процессе транспорта GPI-заякоренных белков к клеточной стенке. Кроме того, в данном изобретении заявлен способ скрининга соединений, которые ингибируют активность указанных белков, а также заявлены репрезентативные соединения, обладающие ингибирующей активностью.

С использованием новых соединений в данном изобретении показано, что можно получить противогрибковые средства, обладающие новым механизмом ингибирования процесса транспорта GPI-заякоренных белков к клеточной стенке.

Изобретение относится к биотехнологии. Конструируют ДНК, кодирующую белок, способствующий резистентности грибка к определенной группе соединений. В другом варианте конструируют имеющую дефект в функционировании ДНК, кодирующую белок, способствующий снижению количества GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка. С помощью кодируемого белка получают антитело к нему, которое может быть использовано в качестве активного ингредиента противогрибкового средства. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

1. ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью, в придании грибку резистентности к соединению, показанному в формуле (Ia), в том случае, когда ДНК сверхэкспрессируется в грибке, при этом ДНК выбрана из группы, состоящей из

(a) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(c) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(d) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59, в которой одна или более аминокислот присоединены, делетированы, замещены и/или вставлены,

(e) ДНК, которая амплифицирована с использованием в качестве праймеров SEQ ID NO: 29 и 31 или SEQ ID NO: 29 и 30

(a) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(c) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(d) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59, в которой одна или более аминокислот присоединены, делетированы, замещены и/или вставлены, и

(e) ДНК, которая амплифицирована с использованием в качестве праймеров SEQ ID NO: 29 и 31 или SEQ ID NO: 29 и 30.

Приоритет по пунктам и признакам: