СПОСОБ ТРАНСДУКЦИИ Bacillus anthracis И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БАЦИЛЛ Российский патент 2006 года по МПК C12N7/00 C12N1/21 C12N15/63 

Изобретение относится к микробиологии и генетике бактерий, в частности к способам трансдукции возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл.

На территории Российской Федерации, в странах ближнего и дальнего зарубежья находится значительное количество неблагополучных по сибирской язве регионов (1). В России ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой и, соответственно, выявляются очаги с различной эпидемиологической и эпизоотологической активностью (2). Особую актуальность возбудитель сибирской язвы приобрел после использования спор В. anthracis в качестве орудия биологического терроризма (3).

До настоящего времени не уделялось должного внимания изменчивости сибиреязвенного микроба, что затрудняло его индикацию и идентификацию. Особо остро этот вопрос стоит в контексте возможных изменений генетических свойств В. anthracis, когда спонтанные генетические процессы у В. anthracis и у близкородственных бацилл происходят в природных условиях (4).

Бактериофаги и плазмиды - классические векторы, осуществляющие горизонтальное распространение генов среди бактерий (5). Бактериофаги способны вносить в клетки бактерий генетический материал, изменяющий свойства хозяина и стабильно сохраняющийся в геноме в тех случаях, когда эти изменения для него полезны. Такой перенос генов от одних бактерий к другим с помощью бактериофага и есть трансдукция. Плазмидная трансдукция, т.е. процедура введения плазмид в новых хозяев, являющаяся ценным инструментом в изучении многих микроорганизмов, среди бациллярных видов впервые показана у Bacillus pumilis (6).

Разработка межвидовой трансдукции плазмид и хромосомных генов между В. anthracis, B.cereus и В. thuringiensis наиболее полно описана американскими экспериментаторами (7). Как свидетельствуют результаты опытов этих авторов, частота плазмидной трансдукции в значительной степени зависит от множественности инфекции (MOI), т.е. от соотношения в трансдуцирующей системе фаг - рецепиентная клетка.

При большой множественности фага, адсорбировавшегося на реципиентных клетках, происходит гибель клеток в трансдуцирующей системе и достичь удовлетворительного выхода трансдуктантов невозможно (Фиг.1).

В своих экспериментах (8, 9) мы убедились в этой закономерности.

Трансдукция, в которой соотношение фаг - клетка была меньше 1, давала наиболее высокую частоту трансдукции.

Трансдукция рВС16 из В. anthracis к В. thuringiensis оказалась наиболее убедительной демонстрацией этого эффекта. При использовании фага БФ (рВС16) необходимо было предотвратить чрезмерную гибель клеток реципиентного штамма в трансдуцирующей системе. Это достигалось использованием очень низкой множественности инфицирования (1:100), или добавлением антифаговой сыворотки (АФС) в трансдуцирующую систему для нейтрализации не трансдуцирующих корпускул фага. В последнем случае могла быть использована множественность инфицирования 1:1, при которой частота трансдукции максимальна.

Однако, получение АФС с удовлетворительной нейтрализующей активностью фага в трансдуцирующей системе - проблема трудоемкая, длительная и дорогостоящая. Вначале необходимо получить препараты фага с концентрацией 10¹⁰-10¹¹ пятнообразующих единиц в 1 мл (10). Каждым препаратом фага следует иммунизировать, по крайней мере, трех кроликов, потому что при применении одного и того же метода иммунизации и антигена (фага) на разных животных получаются различные конечные титры антител (разница иногда бывает десятикратной). Кроме того, необходимо иметь гарантию на случай гибели животных от заболеваний или случайных причин. Длительность иммунизации кроликов для получения высокотитражных АФС - 1,5-2,5 месяца.

Решено найти замену АФС в трансдуцирующей системе другим фагнейтрализующим компонентом.

Таким компонентом мог бы служить додецилсульфат натрия (SDS), обладающий антифаговыми свойствами к холерным фагам (11).

Нами определена пороговая нейтрализующая активность бациллярных трансдуцирующих фагов - ею оказалась концентрация SDS 0,175%, определена нейтрализующая емкость пороговой дозы SDS - n×10⁸ фаг частиц в миллилитре (ф.ч./мл). Такие фагнейтрализующие параметры SDS могли быть вполне подходящими для системы трансдукции, но оказалось, что реципиентные клетки бацилл (В.anthracis, В.cereus, В. thuringiensis) в вегетативном состоянии более чувствительны к детергенту, чем их бактериофаги. Этот же факт описан и на фагах кишечной палочки (10).

Бактериальная клетка - хозяин не играет, видимо, какой-либо активной (т.е. связанной с ее метаболизмом) роли при адсорбции большинства штаммов фага (11). Об этом говорит тот факт, что фаговые частицы необратимо прикрепляются не только к убитым нагреванием или отравленным цианидом бактериям, но даже к обломкам лизированных или разрушенных клеток. Следовательно, в оболочке бактериальных клеток должны быть какие-то специфические рецепторные участки, способные вступать в спонтанную необратимую химическую реакцию с органами адсорбции, имеющиеся у фаговых частиц. Выяснением природы этих рецепторных участков занялся Бернет еще в 1954 г. В экстрактах чувствительных бактерий к фагу им обнаружены активные рецепторы, способные присоединить фаговые частицы и нейтрализовать их. Бернет назвал эти рецепторы в экстракте клеток - агенты, подавляющие фаг (phage -inhibiting agents) или АПФ (13).

Если у грамположительных бактерий (бацилл) с помощью лизоцима полностью удалить клеточную оболочку, то такие протопласты не адсорбируют фаги, к которым чувствительны интактные клетки (14). Следовательно, у бактерий рецепторные участки, служащие для прикрепления фагов, находятся в клеточной стенке (фиг.2).

По современным представлениям (16, 17) поверхностный слой (S - слой) бактерий (бацилл) состоит из белковых или гликопротеиновых субъединиц, организованных в гексагональные или тетрагональные структуры по всей поверхности клетки. Возможно, они функционируют в качестве фаговых рецепторов (16).

У бацилл S - слой полностью покрывают поверхность, образуя упорядоченные решетки (18). Мозаичное расположение белковых кристаллических структур, являющихся рецепторами бактериофагов и бактериоцинов, наглядно показано на Фиг.3

Впервые в 1988 г. J.Ezzell и Т.Abshire (19) экстрагировали с помощью SDS белок клеточных стенок В. anthracis, который назвали ЕА1 (extractable antigen 1). Была продемонстрирована иммуногенность препарата ЕА1, установлена хромосомная детерминация синтеза этого белка, однако его локализация и функция в то время не были изучены. Только в 1995 году J.Farchaus et al. (20) из культуральных фильтратов клеток В. anthracis выделил ЕА1, определил его ультраструктуру и локализацию на клеточной поверхности. Была доказана принадлежность ЕА1 к S - слою сибиреязвенного микроба и его ближайших родственников. В последующих исследованиях было установлено, что у В. anthracis и его ближайших родственников S - слой клеток представлен двумя белками ЕА1 и Sap (surface array protein). Из работ J.Ezzell, T.Abshire (19) и J.Farchaus et al. (20) нами использованы методические приемы получения белков - антигенов поверхностных структур клеток бацилл или экстрактов S - слоя, которые мы расценивали как препараты рецепторов к фагам бацилл.

Несколько усовершенствовав метод (19) SDS экстрагирования структур клеточных стенок В. anthracis, нами получены препараты рецепторов к бациллярным фагам следующим образом: штаммы В. anthracis или B. thuringiensis, или B. cereus, которые мы использовали в качестве реципиентов в трансдуцирующей системе, выращивали в бульоне BHI (DIFCO) в течение 20 часов в шейкере при 75 кач./мин и температуре 35°С. Затем бульонные культуры реципиентов центрифугировали в течение 20 мин, при 10000 об/мин и 4°С, супернатант удаляли. Клеточную массу ресуспендировали до содержания 0,1 г/мл в экстрагирующем SDS буфере, содержащем 5 мМ Трис HCl; 5 мМ 2 меркаптоэтанола и 0,25% SDS (pH-8,9). Далее прогревали клеточную взвесь при 70°С в течение 30 мин, охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Супернатант, содержащий экстрагированный белок (рецепторы к фагу), подвергали диализу в течение суток при температуре 4°С с периодической сменой буферного 0,1М Трис - HCl раствора (pH 8,0).

На конечном этапе экстракт клеточных стенок бацилл, а фактически препарат рецепторов к фагу, смешивали (1:1) с фаговым буфером: 0,01 М Трис - HCl (1,21 г); 0,1 М NaCl (5,85 г); 0,001 MgSO₄·7H₂O (0.25 г) - на 1 л дистиллированной воды (pH 7,5). Проверили нейтрализующую активность препаратов рецепторов реципиентных клеток, используемых в трансдуцирующей системе. При обработке 1000 фаговых частиц в миллилитре (ф.ч./мл) одним мл рецепторов различных бацилл в течение 20 мин при температуре 33-35°С происходит нейтрализация фага на 96,5-99,99%. Особенно наглядно нейтрализация фага рецепторами бацилл проявляется в электронно-микроскопических контролях (фиг.4).

Однако, препараты рецепторов клеток к фагам, полученным методом SDS - экстракции из различных бацилл, не всегда обладали удовлетворительной нейтрализующей емкостью при обработке высоких (10⁷-10⁸ ф.ч./мл) концентраций фага, используемых в трансдуцирующей системе.

Наиболее близким аналогом (основным прототипом) является работа (7), содержание которой изложено на стр.1.

Целью изобретения является поиск менее дорогого, простого в изготовлении компонента, заменяющего в трансдуцирующей системе антифаговую сыворотку.

Для увеличения нейтрализующей емкости препаратов рецепторов клеток бацилл значительно изменена методика их получения.

Препарат рецепторов из реципиентных клеток В. anthracis или B.thuringiensis, или В. cereus, выращивают в течение 20 часов при температуре 35°С на поверхности агара Хоттингера в чашках Петри. Бактериальную массу бацилл выросших газонов обрабатывают парами хлороформа, для этого в крышку чашки Петри с посевом наливают 3-5 мл хлороформа и помещают чашки в перевернутом виде в эксикатор на 1-2 часа при комнатной температуре. Затем бактериальную массу смывают 20 мл бульона BHI (DIFCO) с поверхности агара. Взвеси бациллярных клеток помещают в термостатированный шейкер на 30 мин при температуре 35°С. Этот прием применяют для того, чтобы не убитые хлороформом споры бацилл во взвесях проросли и превратились в вегетативные клетки. После подращивания взвеси бацилл прогревают в водяной бане при 85°С в течение 20 мин взвеси убитых бациллярных клеток центрифугируют в течение 20 мин при 10000 об/мин и температуре 4°С, супернатант удаляют, а к осадку добавляют 3 мл фагового буфера: 0,01 М Трис - HCl (1,21 г); 0,1 М NaCl (5,85 г); 0,001 MgSO₄·7H₂O (0.25 г) - на 1 л дистиллированной воды (pH 7,5). Клеточную массу каждой пробы обрабатывают ультразвуком (ULTRASCHALL - HOMOGENISATOR LABSONIC 1510) при 100 w дважды по 3 минуты, доводя до сметанообразной консистенции. Дезинтегрированные с помощью ультразвука клетки бацилл используют как препарат рецепторов клеток, нейтрализующих фаг.

Пример №1. Для сравнительной характеристики нейтрализующей активности АФС и клеточных рецепторов В. anthracis СТИ (к.р./В.а. СТИ) по отношению к фагу Бф, полученному на донорной культуре В. anthracis Davies (pBC16)S(8), к каждой пробе фага Бф/D (по 1 мл) с концентрациями 10⁷ и 10³ ф.ч./мл добавляют по 1 мл АФС в разведении 1:10 и по 1 мл к.р./В.а. СТИ. В качестве контроля к пробам фага с концентрациями 10⁷ и 10³ ф.ч./мл добавляли по 1 мл фагового буфера. Все пробы опытных и контрольных смесей инкубировали при 35°С в течение 30 мин в шейкере при 75 качаний в минуту. Затем по методу Грациа определяли в каждой пробе количество не нейтрализованного фага на индикаторной культуре В. anthracis Davies S. В результате и АФС (1:10) и к.p./В.а. СТИ обладали нейтрализующей активностью: 100% по отношению к фагу с концентрацией 10³ ф.ч./мл и 99,96-100% (соответственно) по отношению к фагу 10⁷ ф.ч./мл.

Рецепторы интактных клеток бацилл, встроенных в клеточную стенку, всегда моновалентны (фиг.5), а "вылущенные" рецепторы с клеточной поверхности бацилл - поливалентны по отношению к фагу (фиг.6).

Мы воспользовались поливалентностью рецепторов клеток, сорбировавших фаг, для увеличения емкости препаратов рецепторов, использованных в трансдуцирующей системе.

Пример №2 Способ внутривидовой и межвидовой трансдукции с АФС и рецепторами клеток реципиентов.

Материал: 1) В. anthracis Davies (pBC16)S, Tc^R - донор рВС16 (Tc^R).

2) В. anthracis СТИ R, Тс^S - реципиент.

3) B. thuringiensis Pasteuer Тс^S - реципиент.

4) Фаг Бф/Д (рВС16) с концентрацией 1,2·10⁹ ф.ч./мл.

5) Препарат рецепторов реципиентных клеток В. anthracis СТИ R, Tc^S - (к.р./В.а. СТИ).

6) Препарат рецепторов реципиентных клеток B. thuringiensis Pasteuer Tc^S - (к.p./B.t.P).

7) АФС к фагу Бф с нейтрализующей активностью 99,96% в разведении 1:10 10⁷ ф.ч./мл.

8) фаговый буфер (рН-7,5).

Методика: По 1 мл реципиентных культур 2) и 3), выращенных в бульоне BHI (DIFCO) при 35°С в течение 3 часов, смешали с 1 мл фага Бф/Д (рВС16) с концентрациями 1,2·10⁹, 1,2·10⁸, 1,2·10⁷, ф.ч./мл, а контроль - 1 мл реципиентной культуры 2) и 3) с 1 мл фагового буфера. Смеси инкубировали 20 мин при 33°С в шейкере при 100 кач./мин. Затем во все опытные и контрольные пробы внесли по 1 мл АФС 1:10 или по 1 мл препарата 5) или 6) соответствующего рецептора и вновь инкубировали при 33°С. Через 30 мин внесли в каждую пробу еще по 1 мл АФС 1:10 или соответствующего рецептора и высеяли по 0,2 мл из каждой опытной и контрольной пробы на селективные (с Tc 20 мкг/мл) среды Хоттингера (по 3 чашки на пробу). Выросшие Tc^R колонии - трансдуктанты, учитывали через 48-72 часа инкубации посевов при 35°С (см. Таблицу).

Как свидетельствует результат эксперимента (Таблица), при внутривидовой и межвидовой трансдукции частота выхода трансдуктантов в опытах не зависит от применяемых в трансдуцирующей системе компонентов (АФС или препарата клеточных рецепторов), нейтрализующих фаг. Частота трансдукции зависит только от концентрации фага при использовании того или иного реципиента, т.е. от состояния в трансдуцирующей системе фаг - реципиентная клетка.

Таким образом, найден полноценный способ замены дорогого, трудоемкого и длительного при получении компонента (АФС) трансдуцирующей системы на более дешевый, простой при изготовлении компонент (препарат рецепторов клеток реципиента), который эффективно нейтрализует фаг, предотвращая чрезмерную гибель клеток реципиентного штамма в трансдуцирующей системе.

ТаблицаРезультат внутривидовой и межвидовой трансдукцииТрансдуцирующие смесиКонцентрация фага Бф/Д (pBC16)№чашкиКоличество Тс^R колонийТрансдуцирующие смесиКонцентрация фага Бф/Д (pBC16)№чашкиКоличество Tc^R колонийB. anthracis СТИ R, Tc^S + Бф/Д (pBC16) + к.р./В.а. СТИ1,2·10⁹1151B. anthracis СТИ R, Tc^S + Бф/Д (pBC16) + АФС 1:101,2·10⁹11322972983823861,2·10⁸1641,2·10⁸1622692583523471,2·10⁷181,2·10⁷16212283433B. anthracis СТИ R, Tc^S + фаговый буфер + к.р./В.а. СТИ10В. anthracis СТИ R, Tc^S + фаговый буфер + АФС1020203030B. thuringiensis Pasteuer Tc^S + Бф/Д (pBC16)+к.р./В.а. СТИ1,2·10⁹123B. thuringiensis Pasteuer Tc^S + Бф/Д (pBC16) + АФС 1:101,2·10⁹1232182183213241,2·10⁸1501,2·10⁸1412412333533421,2·10⁷131,2·10⁷11026273432В. thuringiensis Pasteuer Те^S + фаговый буфер + к.р./В.а. СТИ10В. thuringiensis Pasteuer Те^S + фаговый буфер + АФС1020203030

ЛИТЕРАТУРА

1. Микробиологическая диагностика сибирской язвы / Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В. и др., - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 224 с.

2. Черкасский Б.Л. Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999, - №2 - С.48-52.

3. Jngleshy Т., O′Toole Т., Henderson D. et al. Anthrax as a biological weapon // JAMA - 2002. - V.287. - P.2236-2252.

4. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Спонтанные генетические процессы у Bacillus anthracis и у близкородственных бацилл. // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2003. - С.79-86.

5. Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: Роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий. // Молекулярная генетика микробиол. и вирусол. - 2003. - №4 - С.3-10.

6. Bramucci M.G., and Lovett P.S., Low - frequency. PBS1 - mediated plasmid transduction in Bacillus pumilis. // J. Bacteriol. - 1976, - V.127 - P.829-831.

7. Ruhfel R.E., Robillard N.J., Thome C.B. Interspecies Transduction of Plasmids among Bacillus anthracis, B. cereus and B. thuringiensis // J. Bacteriol. - 1984, - V.157, - №3, - P.708-711.

8. Буланцев А.П., Липницкий А.В., Барков А.М., Шелохович А.И. Возможности генетического обмена между родственными бациллами с помощью трансдукции. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции. - Волгоград. - 1992. - С.56.

9. Bulantsev A.L., Lipnitsky A.V., Barcov A.M. Genetic exchenge between bacilli by transduction. // The 2nd international workshop on the molecular biology of Bacillus cereus. Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis - Taos, New Mexico, USA. August 11-13, 1999. - Р.31.

10. Адамс М. Бактериофаги // Изд. Ин. литература, - M.I 961, - С.52-53; 94-98; 406-410.

11. Курочкин Н.Я., Адамов А.К., Агапова З.М. Антифаговые свойства сред, содержащих додецилсульфат натрия. // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 1977, вып.53, - С.44-47.

12. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий. // Изд. "Мир", - М., 1965. - С.104-117.

13. Burnet F.M. The phage - inactivating agent of bacterial extracts. // J.Pathol. Bacteriol., - 1934. V.38. - P.285.

14. Weihull C. The isolation of protoplasts from Bacillus megaterium by controlled treatment with lisozyme. // J.Bacteriol. - 1953, - V.55 - P.688.

15. Буланцев А.Л. Влияние бактериофага на электрофоретическую подвижность некоторых видов бактерий семейства Enterobacteriaceae. // Диссер. канд. мед. наук. - Ростов н/Д, - 1970, - 170 с.

16. Sleytr U.B., Sara M., Kupcu Z., Messner P. Ultrafiltration membranes with uniform porese from crystalline bacterial cell wall layers: Application of S - layers of selected strains ofBaccillus stearothermofilus and Desulfotomaculum nigrificans. // Arch. Microbiol. - 1986, - V.146, - P.19-24.

17. Бациллы (Генетика и биотехнология) / под редакцией Харвурда К. // M., "Мир" - 1992. - С.317-318.

18. Sara M., Sleytr U.B., S - Layer Proteins // J. Bacteriol. - 2000 - V.182 - №4 - Р.859-868.

19. Ezzell J., Abshire Т., Immunological Analysis of Cell - Associated Antigens of Bacillus anthracis. // Infect. immun. - 1988. - V.55. - №2. - P.349-356.

20. Fachaus J., Ribot W., Downs M., Ezzell J. Purification and Characterization of the Major Surface Array Protein from the Aviruent Bacillus anthracis Delta Sterne - 1. // J. Bacteriol. - 1995 - V.177 - №9 - Р.2481-2489.

Изобретение относится к микробиологии и генетике бактерий, в частности, к способам трансдукции возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл. Способ трансдукции Bacillus anthracis и близкородственных бацилл включает в себя инкубацию смеси бактериофага с клетками реципиента в определенном соотношении, затем после первой генерации бактериофага через 20 мин в трансдуцирующую систему добавляют препарат рецепторов реципиентных клеток и высевают трансдуцирующую смесь на селективные среды. Описан метод получения рецепторов из реципиентных клеток В. anthracis, B.thuringiensis, B.cereus. Использование способа позволяет полноценно заменить антифаговую сыворотку (АФС) в трансдуцирующей системе на более дешевый, простой при изготовлении компонент - препарат рецепторов клеток реципиента, который эффективно нейтрализует фаг и предотвращает чрезмерную гибель клеток реципиентного штамма в трансдуцирующей системе. 6 ил., 1 табл.

Способ трансдукции Bacillus anthracis и близкородственных бацилл, включающий инкубацию бактериофага и реципиентных клеток, добавление в полученную трансдуцирующую смесь препарата, предотвращающего гибель реципиентных клеток, отличающийся тем, что для инкубации используют по 1 мл бактериофага и реципиентных клеток, инкубацию проводят при температуре 33°С в течение 20 мин, после инкубации к трансдуцирующей смеси добавляют 1 мл препарата рецепторов реципиентных клеток, способного нейтрализовать бактериофаг и представляющего собой дезинтегрированные ультразвуком убитые клетки из проросших спор Bacillus anthracis или близкородственных бацилл из проросших спор, и по 0,2 мл полученной смеси высевают на селективные среды, посевы инкубируют при температуре 35°С в течение 48-72 ч учитывают выросшие трансдуктанты.