СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТОК КРОВИ С ТВЕРДОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ МАТЕРИАЛОВ Российский патент 2006 года по МПК G01N21/76 C12M3/04 C12M3/06 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к способам оценки биосовместимости твердой поверхности материалов по жизнедеятельности контактирующих с ними клеток.

Известен способ оценки взаимодействия нейтрофилов крови с твердой поверхностью материала по выделению ими активных форм кислорода (АФК), регистрируемых с помощью флуоресценции веществ, реагирующих с АФК (Nathan C.F. Neutrophil activation on biological surfaces. Massive secretion of hydrogen peroxide in response to products of macrophages and lymphocytes // J. Clin.Invest. - 1987. - V.80. - P.1550-1560). Способ является трудоемким, недостаточно точным, т.к. измерения производятся путем оценки флуоресценции среды каждые несколько минут. Лейкоциты подвергаются предварительному выделению, а во время измерения их окружает среда, отличная от нативной in vivo.

При другом подходе (прототип) используют хемилюминесценцию (ХЛ): кровь инкубируют с исследуемым материалом, после чего ХЛ методом оценивают ее способность производить АФК в ответ на стандартный стимул (зимозан или форболмиристат-ацетат) (Eriksson, C. and Nygren, H. Polymorphonuclear leukocytes in coagulating whole blood recognize hydrophilic and hydrophobic titanium surfaces by different adhesion receptors and show different patterns of receptor expression. // J.Lab.Clin.Med. - 2001. - V.137. - P.296-302). Однако сам процесс взаимодействия с поверхностью остается при этом недоступным наблюдению. Кроме того, механизмы реагирования клеток на стандартный стимул и исследуемый материал могут различаться, что не позволяет делать однозначных выводов о воздействии материала.

Технический результат изобретения заключается в уменьшении трудоемкости, приближении состояния клеток к естественному, увеличении точности регистрации, уменьшении используемого количества крови и обеспечении возможности наблюдения за ходом процесса взаимодействия клеток с поверхностью исследуемого материала.

Этот результат достигается тем, что в предложенном способе образец цельной крови размещается между полупроницаемой (целлофановой) мембраной и исследуемой твердой поверхностью (причем, исследуемая поверхность находится сверху). Под целлофановой мембраной находится физиологический раствор (раствор Хэнкса), находящийся под небольшим избыточным давлением (45 см водного столба), с добавлением активатора хемилюминесценции (ХЛ). Использование прозрачной полупроницаемой мембраны позволяет подпитывать клетки питательными веществами, предотвращать их высыхание, изменением формы мембраны - перемешивать образец, подводить к клеткам активатор ХЛ, через прозрачный корпус ячейки регистрировать ХЛ при выделении клетками АФК в процессе взаимодействия клеток с поверхностью материала.

Принципиальная схема ячейки представлена на фиг.1. Порция крови 2 находится между диализной мембраной 3 и исследуемой поверхностью 1. Физиологический раствор 4, находящийся под мембраной, поддерживает постоянство состава образца, подпитывает его водой и питанием для клеток - глюкозой. Капля крови имеет форму мениска, удерживающегося между выпуклой стороной мембраны и исследуемой поверхностью за счет капиллярных сил. Избыточное давление под мембраной, создаваемое столбом жидкости 11 на выходе из ячейки, поддерживает постоянство формы мембраны. Уровень расположения нижней поверхности твердого образца определяется регуляторами уровня 7. При постоянстве формы мембраны и уровня положения образца площадь соприкосновения крови и твердого образца оказывается довольно постоянной, лишь слабо зависящей от угла смачивания поверхности или от объема образца. Пульсация давления в подмембранной жидкости меняет форму мембраны и позволяет осуществлять перемешивание крови. Грелка 5, прижимающая твердый образец к мембране, одновременно его термостатирует. Изготовление корпуса 8 ячейки из оптически прозрачного материала (оргстекла) позволяет исследовать процессы, происходящие в крови, оптическими методами, в том числе и ХЛ.

Типичная процедура подготовки и измерения заключается в следующем:

Увлажненную диализную мембрану закрепляют с помощью уплотняющего кольца 6 на цилиндрическом выступе корпуса ячейки. Пространство под мембраной промывают дистиллированной водой и заполняют раствором Хэнкса, используя перистальтический насос 9. Трубку выхода раствора из ячейки располагают на высоте 45 см. 10 мкл гепаринизированной крови, полученной после прокола пальца, помещают на полупроницаемую мембрану, под которой находится раствор Хэнкса с добавлением активатора ХЛ (люцигенин, люминол). Каплю крови покрывают пластиной исследуемого материала, к которой прилегает предварительно охлажденная до температуры +15-20°C грелка. Включение на 1 минуту перистальтического насоса с пережатым входным шлангом 10 приводит к пульсирующим изменениям давления, изменениям выпуклости мембраны и, как результат, перемешиванию крови и равномерному смачиванию поверхностей в пределах расплющенной капли. Еще через 4 минуты включают нагрев грелки до +37°С. Развивается ХЛ, регистрируемая с помощью фотоумножителя 12, особенности которой характеризуют реакцию клеток на исследуемую поверхность. Типичные кривые регистрации ХЛ при взаимодействии крови с поверхностями пластин из оргстекла и нержавеющей стали изображены на фиг.2.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, к способу хемилюминесцентной оценки реакции клеток крови на исследуемую твердую поверхность материала, включающему инкубирование цельной крови при +37°С между исследуемой поверхностью и прозрачной полупроницаемой мембраной, которая позволяет подводить к исследуемому образцу крови воду, питательные вещества и активаторы хемилюминесценции, а также, благодаря своей прозрачности, позволяет наблюдать и регистрировать ход процесса. Изобретение обеспечивает уменьшение трудоемкости, приближение к естественному состоянию клеток, увеличению точности регистрации, возможность наблюдения за ходом взаимодействия клеток с поверхностью материала. 2 ил.

Способ изучения взаимодействия клеток крови с твердыми поверхностями материалов, характеризующийся тем, что образец крови размещают между исследуемой поверхностью и прозрачной полупроницаемой мембраной, через которую к исследуемому образцу крови подводят воду, питательные вещества и активатор хемилюминесценции, перемешивают образец крови изменением формы мембраны, нагревают до 37°С, регистрируют ход процесса с помощью фотоумножителя построением кривых хемилюминесценции.