СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОЗИТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N15/00 C07H21/04 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области биотехнологии и нанотехнологии, а именно к способам создания надмолекулярных композитов, характеризующихся упорядоченным расположением входящих в них биополимеров.

В частности, изобретение предназначено для создания надмолекулярных композитов, представляющих из себя упорядочение расположенные молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Задача упорядоченного расположения молекул ДНК определяется необходимостью создания на их основе наноустройств или наноматериалов с заранее заданными свойствами. Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования на производствах, решающих задачи создания функциональных надмолекулярных структур в сфере биоинженерии, молекулярной электроники и биотехнологии.

Уровень техники.

Существующие способы формирования сложных пространственных образований, "строительными блоками" в которых являются молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, основаны на ее особенных физико-химических свойствах.

Наиболее распространенным подходом к решению этой задачи является использование полианионных свойств ДНК, что позволяет достичь взаимного сближения подобных молекул за счет нейтрализации сил кулоновского отталкивания между ними. Последнее достигается путем применения различных поликатионов, в частности хитозана [1], имеющего в своем составе N-ацетиламиногруппы и за счет этого вступающего с ДНК в устойчивое электростатическое взаимодействие. Соответственно формирующаяся лиотропная жидкокристаллическая дисперсия представляет из себя комплекс двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты с хитозаном в водно-солевом растворе физиологической ионной силы, которая может использоваться в качестве интегрального биодатчика для определения биологически активных соединений.

Развитием этого подхода явилось создание полифункционального жидкокристаллического композита, в котором дисперсия двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты формируется внутри трехмерного полимера бис-метакрилата полиэтиленгликоля [2]. По совокупности своих признаков данный способ наиболее близок к заявляемому, в связи с чем может рассматриваться в качестве "способа-прототипа".

Третья группа методов, сохраняя принцип электростатического взаимодействия между полианионом ДНК и вводимыми в раствор катионами, дополнительно решает задачу изоляции нуклеиновой кислоты от водного окружения за счет использования принципиально иных - гидрофобных взаимодействий. Для этого катионным молекулам (например, катионогенным поверхностно-активным веществам) путем димеризации или олигомеризации дополнительно сообщаются свойства липидов [3]. Возникающие в результате этого особые молекулы - так называемые "катионные амфифилы" оказываются способными формировать вокруг молекул ДНК изолирующие гидрофобные оболочки, что существенно облегчает процессы трансфекции.

В другом случае катионный липид (например, бис(гуанидиний)-тренхолестерин [4]) в комбинации с нейтральным колипидом используется для формирования стабильных композиций "липид:ДНК", используемых в качестве лекарственной формы при генной терапии.

В то же время описанные выше способы позволяют создавать надмолекулярные композиты только неупорядоченных размеров и формы, но не позволяют располагать в них высокополимерные молекулы ДНК в виде взаимно ориентированных (параллельных) наноструктур.

Альтернативные подходы, ведущие к устранению данного недостатка, в доступной нам литературе не описаны. Таким образом, заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.

Сущность изобретения.

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является получение надмолекулярных композитов из ДНК и формообразующего амфифильного вещества, в составе которых достигается упорядоченное (параллельное) расположение нитей ДНК.

Дополнительной задачей, решаемой при осуществлении заявляемого способа, является длительное сохранение нативной структуры и физико-химических свойств ДНК в составе образующегося надмолекулярного композита.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее:

- в водных растворах линейной высокополимерной ДНК в присутствии формообразующего амфифильного вещества общей формулы

происходит взаимодействие, ведущее к формированию упорядоченных надмолекулярных композитов, представляющих из себя взаимно ориентированные параллельно расположенные молекулы ДНК, окруженные оболочкой из использованного амфифильного вещества.

Соответственно при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления представляются следующим образом:

- на первом этапе готовятся исходные растворы веществ, использующихся для создания надмолекулярного композита, а именно - линейных молекул ДНК и формообразующего амфифильного вещества общей формулы

,

используемого в молярном соотношении с ДНК (по нуклеотидам) от 1:1 до 10:1 и концентрации от 4×10^-3 М до 5×10^-3 М;

- на втором этапе производится смешивание исходных растворах в равных объемах и полученная смесь инкубируется в отсутствии встряхивания или вибрации при температурах, близких к температурам фазового перехода амфифильного формообразующего вещества, а именно при 4-6°С (сущностью этапа является растянутое во времени поэтапное "созревание" надмолекулярных структур);

- на завершающем (третьем) этапе о формировании надмолекулярных композитов судят по образованию в растворе визуально различимых игольчатых образований, характер организации которых может быть проконтролирован с использованием соответствующих физико-химических и оптических методов.

Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей:

1) впервые установлено, что формообразующее амфифильное вещество формулы

,

в котором в отличие от известных катионных амфифилов, гидрофобные свойства преобладают над полярными, способно к взаимодействию с полимерными молекулами ДНК;

2) продемонстрировано, что подобное взаимодействие возникает при концентрации формообразующего амфифильного вещества от 4×10^-3 М до 5×10^-3 М;

3) показано, что образование упорядоченных надмолекулярных структур эффективно происходит при молярном соотношении формообразующего амфифильного вещества и ДНК (по нуклеотидам) от 1:1 до 10:1;

4) выявлено, что подобное взаимодействие растянуто во времени и характеризуется строго выраженной стадийностью, заключающейся в первоначальном образовании на полимерных молекулах ДНК нерегулярно расположенных мицелл используемого формообразующего амфифильного вещества, последующей агрегации ДНК и постепенном формировании из них взаимно ориентированных (параллельных) наноструктур;

5) установлено, что эффективный выход надмолекулярных композитов может быть увеличен при проведении их "созревания" при температурах, близких к температуре фазового перехода формообразующего амфифильного вещества, а именно при 4-6°С;

7) показано длительно сохранение физико-химических свойств ДНК в составе надмолекулярных композитов, что объясняется изоляцией полимерных молекул нуклеиновой кислоты от водного окружения и обеспечиваемого этим предупреждения процессов их спонтанного гидролиза.

В целом, резюмируя приведенные выше материалы, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию "изобретательский уровень".

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Возможность осуществления изобретения базируется на впервые обнаруженном факте взаимодействия формообразующего амфифильного вещества формулы

с ДНК, происходящего в водном растворе и ведущего к агрегации ДНК в виде упорядоченных надмолекулярных композитов.

Учитывая то, что формообразующего амфифильного вещества формулы

гидрофобные (неполярные) свойства преобладают над гидрофильными (полярными), его нельзя отнести к упоминавшимся при описании аналогов изобретения "катионным амфифилам". Это же требует иного объяснения механизмов взаимодействия использованного нами формообразующего амфифильного вещества с двухцепочечными молекулами ДНК, предположительно определяемых уже не электростатическими, а гидрофобными взаимодействиями (по типу "ДНК-липидных" взаимодействий).

Приведенные соображения объясняют невысокую скорость и выраженную стадийность формирования надмолекулярных композитов, образование которых может быть отслежено с использованием атомно-силовой или сканирующей электронной микроскопии.

На ранних сроках (на 1-3 неделе инкубации) в присутствии использованного формообразующего амфифильного вещества фиксируется образование на нитях ДНК сферических мицеллоподобных структур диаметром около 200 нм, расположенных по длине данного биополимера на расстоянии от 250 до 500 нм между собой (фиг.1а).

Предположительным механизмом подобного процесса является взаимодействие алкильных радикалов формообразующего амфифильного вещества с гидрофобными участками ДНК. При этом в силу неравномерного распределения подобных участков по длине данного линейного биополимера в некоторых из них происходит преимущественное накопление молекул формообразующего амфифильного вещества, локальное превышение содержания которого результируется в образовании на ДНК видимых в АСМ мицеллоподобных наноструктур (фиг.1б). В этой связи следует также указать, что способность к мицеллообразованию вообще является свойством, изначально присущим использованному нами формообразующему амфифильному веществу общей формулы

,

что ведет к формированию подобных структур в водных растворах при превышении пороговых критических концентраций мицеллообразования (ККМ), равных 5×10^-3 М. Однако в данном случае речь идет о существенных особенностях этого процесса, идущего в диапазоне концентраций формообразующего амфифильного вещества от 4×10^-3 М до 5×10^-3 М и происходящего не в растворе, а в отдельных участках линейной молекулы ДНК, которые становятся своеобразными "ядрами конденсации" для молекул формообразующего амфифильного вещества.

Дальнейшее увеличение времени инкубации смесей ДНК + формообразующее амфифильное вещество до 3-6 недель сопровождалось формированием утолщенных разветвленных тяжистых структур, как по своей длине, так и по ширине превышающих размеры исходных ДНК-фрагментов и в точках пересечения объединяемых описанными выше мицеллоподобными наноструктурами (фиг.2а). При этом последние имели тенденцию к увеличению до 1 мкм в диаметре, а также приобретали отличную от сферической "неправильную" форму, сопровождая по ходу участки ветвления нитей ДНК.

Предполагаемый механизм регистрируемых явлений в этом случае заключается в начинающемся взаимодействии молекул ДНК, аранжированных формообразующим амфифильным веществом, что приводит к формированию упорядоченных тяжистых структур, состоящих из множества параллельно расположенных нитей ДНК (фиг.2б).

Окончательным итогом является ситуация, когда все первоначально присутствующие в растворе линейные молекулы ДНК оказываются "упакованными" в ограниченное количество протяженных надмолекулярных кабельных образований (фиг.3а), представляющих собой надмолекулярные композиты, в которых молекулы нуклеиновой кислоты ориентированы параллельно друг другу и окружены единой оболочкой из молекул использованного формообразующего амфифильного вещества (фиг.3б). При этом микроскопия концевых участков данных структур позволяет зафиксировать картину выхода нитей ДНК из единого надмолекулярного образования с сохранением за каждой из них своей индивидуальности.

Таким образом, положительный результат, полученный при использовании заявляемого способа, выступает в виде формирования упорядоченных надмолекулярных структур "кабельного" типа, состоящих из параллельно расположенных молекул ДНК, окруженных оболочкой из использованного формообразующего амфифильного вещества.

Дополнительный положительный результат, также достигаемый при использовании заявляемого способа, заключается в длительном сохранении ДНК в составе образующихся надмолекулярных композитов, что обеспечивается изоляцией этих молекул от водного окружения внутри единой оболочки из молекул используемого формообразующего амфифильного вещества и обусловленного этим предотвращением процесса спонтанного гидролиза связей в сахарофосфатном остове ДНК.

Пример 1.

Для создания надмолекулярных композитов готовили водный раствор из препарата высокополимерной ДНК (мол. вес 6000 кДа) молок лосося (производитель - ISN Biomedicals, США) в концентрации 5×10^-3 М (по нуклеотидам) и формообразующего амфифильного вещества химической формулы

(мол. вес 196) в концентрации 5×10^-3 М.

Приготовленный раствор инкубировали при температуре 4°C в течение 5 недель. За это время в смеси ДНК с формообразующим амфифильным веществом химической формулы

происходило постепенное формирование линейных надмолекулярных структур, постепенно увеличивающихся в размерах и к окончанию срока инкубации легко различимых визуально. При этом полученные надмолекулярные композиты имели размеры от нескольких десятков до сотен микрон в ширину и от нескольких миллиметров до 3-4 сантиметров в длину.

Для изучения тонкой морфологии полученных надмолекулярных композитов образцы наносили на свежий скол слюды, высушивали на воздухе и исследовали в атомно-силовом микроскопе (СММ-2000, Россия). Растровую электронную микроскопию образцов проводили на кремниевых подложках в электронном микроскопе JSM-20 (JEOL, Япония).

Проведенное изучение надмолекулярных композитов позволило охарактеризовать их как протяженные "кабельные" структуры толщиной от нескольких десятков до сотен микрон, состоящие из ряда параллельно ориентированных нитей ДНК, объединенных единым "чехлом" из формообразующего амфифильного вещества (фиг.4).

Дальнейшее динамическое изучение полученного надмолекулярного композита позволило констатировать длительное (до 6 месяцев и более) сохранение спектральных характеристик и электрофоретической подвижности входящих в его состав полимерных молекул ДНК на фоне постепенной деградации контрольных образцов той же ДНК в водном растворе.

Источники информации

1. Патент RU 2169770, 27.06.2001. Жидкокристаллическая дисперсия на основе комплекса (нуклеиновая кислота - хитозан) как интегральный биодатчик и способ ее создания.

2. Патент RU 2224781, 27.02.2004. Полифункциональный жидкокристаллический композит на основе двухцепочечной нуклеиновой кислоты и способ его получения.

3. Патент RU 2000117462, 27.07.2002. Частицы для трансфекции.

4. Патент RU 2213578, 10.10.2003. Стабилизация композиций "липид:ДНК" в процессе распыления.

Изобретение относится к области биотехнологии и нанотехнологии. Способ заключается во взаимодействии двухцепочечных молекул ДНК с амфифильным формообразующим веществом общей формулы

и последующем инкубировании полученной смеси при температуре, близкой к температуре фазового перехода амфифильного формообразующего вещества. Молярное соотношение между формообразующим амфифильным веществом и ДНК (по нуклеотидам) составляет 1:1. Преимуществом изобретения является создание высокоупорядоченных надмолекулярных композитов, а также длительное сохранение нативной структуры и физико-химических свойств ДНК. Изобретение может быть использовано в сфере биоинженерии и молекулярной электроники. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ получения надмолекулярных композитов из линейных молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты путем смешивания двухцепочечных молекул ДНК с амфифильным формообразующим веществом в водном растворе и последующего инкубирования полученной смеси, отличающийся тем, что в качестве амфифильного формообразующего вещества используют вещество с химической формулой