СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ БИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ И АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/295 C12N7/00 A61P31/12 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Вирусная диарея и аденовирусная инфекция крупного рогатого скота - остро протекающие, контагиозные вирусные болезни, главным образом телят, характеризующиеся поражением органов респираторно-кишечного тракта. Болезни регистрируются во всех странах мира, в том числе и в России. Вирусы вызывают заболевания у крупного рогатого скота, поражая от 40 - 60% животных и обуславливая в 20-30% случаев вспышки респираторно-кишечных болезней. Как правило, данные вирусы вызывают заболевания в ассоциации в 80-85% случаях, при этом смертность телят достигает 27-30% (1).

Исходя из этого, профилактика данных инфекций в хозяйствах Российской Федерации является актуальной задачей и решение ее позволит снизить экономический ущерб, причиняемый данными вирусами животноводству Российской Федерации.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающий антигены аденовируса КРС штамм В-10, который инактивировали димером этиленимином (ДЭИ) в конечной концентрации 0,1% и в качестве адъюванта использовали аэросил (2)

Известен также способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи, включающий антигены вируса диареи КРС штаммы Оригон, С-24 V, Нью-Йорк, которые инактивировали формалином, и в качестве адъюванта была использована гидроокись алюминия (3).

В задачу наших исследований входило разработать способ получения безвредной вакцины на основе синергической ассоциации вируса вирусной диареи и аденовируса для специфической профилактики смешенной инфекции крупного рогатого скота, обеспечивающей создание в организме животных длительный, напряженный иммунитет против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Это достигается благодаря тому, что аденовирус первого серотипа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД ₅₀/ мл инактивируют формалином до конечной концентрации 0,2-0,3% и концентрируют в 5 раз полиэтиленгликолем 6000 в конечной концентрации 10%, дополнительно вводят штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД ₅₀/мл, инактивацию проводят формалином 0,2-0,3% концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 часа при рН 7,2-7,4, далее полученные антигены концентрируют 8% полиэтиленгликолем - 6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl, затем антигены смешивают 1:1 и добавляют официнальный адъювант ГОА до 1,5-2,0% конечной концентрации в готовой вакцине.

Пример 1. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с минимальными значениями параметров.

Приготовление нативной суспензии аденовируса, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

Аденовирус крупного рогатого скота (штамм первого серотипа В-10) размножают в монослойной перевиваемой культуре клеток почек теленка Taurus-1 (Т-1), выращенной в матрасах объемом 1,5 литра, на ростовой синтетической среде ИГЛА, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики. Культуру выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации 300-400 тыс. клеток на 1 мл среды. Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду ИГЛА в количестве 200-250 мл, в которую предварительно вносят вирус с инфекционным титром 6-7,0 lg ТЦД ₅₀/ мл из расчета 10 мл на 500 мл среды. Матрасы инкубируют при температуре 37°С, ЦПД наступает в течение 2-3-х дней после заражения. Цитопатическое действие характеризуется округлением клеток в виде гроздьев винограда и отделением их от стекла, с последующей полной дегенерацией. Сбор культуральной жидкости производят в период выраженного цитопатического эффекта. Титр вируса должен составлять не ниже 6,0 lg ТЦД ₅₀/мл.

Освобождение вируса из клеток осуществляют путем трехкратного замораживания и оттаивания, полученную вирусную суспензию осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 минут.

Вирус КРС вирусной диареи штамма «Оригон» размножают в монослойной перевиваемой культуре клеток КСТ, выращенной на матрасах объемом 1,5 литра, на ростовой синтетической среде 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики. Культуру выращивают в течение 2-3 суток при посевной концентрации 100-200 тыс. клеток на 1 мл среды. Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду 199 в количестве 200-250 мл, в которую предварительно вносят вирус с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД ₅₀/мл из расчета 1,5 мл на 500 мл среды. Матрасы инкубируют при температуре 37°С, ЦПД наступает в течение 1-2 дня. Цитопатическое действие характеризуется округлением клеток и отделением их от стекла, с полной последующей дегенерацией. Сбор культуральной жидкости проводят в период выраженного цитопатического эффекта. Инфекционный титр вируса должен составлять не ниже 7,0 lg ТЦД ₅₀/мл.

Далее освобождают вирус из клеток путем трехкратного замораживания и оттаивания, полученную вирусную суспензию осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 минут.

Инактивация вирусов

Вируссодержащие суспензии инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2%, при температуре 37°С в течение 72 часов с постоянным перемешиванием при рН 7,2.

Контроль полноты инактивации вирусов проводят на соответствующих культурах клеток, в трех последовательных пассажах. Вирусы считают инактивированными при отсутствии ЦПД в трех пассажах.

Далее инактивированные аденовирус штамма (Bovine-10) и вирус вирусной диареи штамма «Оригон» концентрируют в 5 раз исходного объема полиэтиленгликолем 6000 в конечной концентрации 10% и 8% соответственно в растворе 0,5 М NaCI. Затем полученные антигены смешивают в равных объемах 1:1 и добавляют официнальный адъювант ГОА до 1,5% конечной концентрации в готовой вакцине. После этого проверяют на бактериальную и грибковую контаминацию, делая посевы каждой серии вакцины на питательные среды МПБ, МПА, МППВ под вазелиновым маслом и агар Сабуро по две пробирки. Посевы со средами выдерживают в термостате при температуре 37°С, а с агаром Сабуро - при температуре 20-22°С в течение 15 суток.

Для проведения на безвредность отбирают 10 белых мышей живой массой 17-18 г, вводят вакцину в дозе 0,2 см³ подкожно. Вакцину считают безвредной, если мыши в течение 10 суток после введения вакцины остаются живыми и клинически здоровыми.

Антигенную активность вакцины контролируют на пяти кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 0,4 см³ двукратно с интервалом 14-15 дней. Через 21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку для определения уровня специфических антител против аденовируса и вируса вирусной диареи. Титры антител должны быть не ниже 1:128 к вирусу ВД и 1:256 к аденовирусу КРС в реакции нейтрализации (проективный уровень антител).

Результаты контроля экспериментальных серий инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота показали, что все серии биопрепарата были стерильными, безвредными и антигенно активными (титры антител составили 1:1024-1:4096). Срок хранения не менее 12 месяцев (см. таблицу).

Пример 2. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с минимальными значениями параметров (см.табл.).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 7,5 lg ТЦД ₅₀/ мл, формалин в конечной концентрации 0,25%, инактивацию проводят при температуре 37,5°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в концентрации 9,0% в растворе 0,5 М NaCI, содержание ГОА 2,0% в готовой вакцине. Титр антител 1:64-1:128.

Пример 3. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с максимальными значениями параметров (см. табл.).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 8,0 lg ТЦД ₅₀/мл, формалин в конечной концентрации 0,3%, инактивацию проводят при температуре 38°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в конечной концентрации 10,0% в растворе 0,6 М NaCI, содержание ГОА 2,5% в готовой вакцине. Титр антител 1: 1024-1:4096.

Пример 4. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота со значениями параметров ниже минимальных (см. табл.).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 6,0 lg ТЦД ₅₀/мл, формалин в конечной концентрации 0,1%, инактивацию проводят при температуре 36°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в конечной концентрации 7,0% в растворе 0,4 М NaCl, содержание ГОА 1,5% в готовой вакцине.

Антигенную активность вакцины контролируют на пяти кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 0.4 мл двукратно с интервалом 14-15 дней. Через 21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку для определения уровня специфических антител против аденовируса и вируса вирусной диареи. Титры антител 1:16 к вирусу ВД КРС и 1:64 к аденовирусу КРС в реакции нейтрализации (непротективный уровень антител).

Пример 5. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота со значениями параметров выше максимальных (табл.1).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 8,5 lg ТЦД ₅₀/мл, формалин в конечной концентрации 0,35%, инактивацию проводят при температуре 39°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в концентрации 11,0% в растворе 0,7 М NaCl, содержание ГОА 3,5% в готовой вакцине.

Антигенную активность вакцины контролируют на пяти кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 0.4 см³ двукратно с интервалом 14-15 дней. Через 21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку для определения уровня специфических антител против аденовируса и вируса вирусной диареи. Титры антител 1:32-1:64 к вирусу ВД КРС и 1:64-1:128 к аденовирусу КРС в реакции нейтрализации (непротективный уровень антител).

Предложенный способ обеспечивает получение безвредной вакцины, создающей в организме длительный и напряженный иммунитет одновременно против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Вакцина, полученная предложенным способом, апробирована нами с положительным результатом с 2004-2007 гг. на кафедре ветеринарной вирусологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина и хозяйстве «ООО Аграрное» Орехово-Зуевского района.

Вакцина, полученная предложенным способом, позволит снизить экономический ущерб, причиняемый данными вирусами животноводству Российской Федерации, и найдет применение в неблагополучных хозяйствах.

ТАБЛИЦА Технологические показатели параметров изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Технологические показатели Изготовление вакцины С минимальными значениями параметров С оптимальными значениями параметров С максимальными значениями Со значениями параметров ниже миниальных выше максимальных Штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 7 lg ТЦД ₅₀/мл 7,5 lg ТЦД ₅₀/мл 8 lg ТЦД ₅₀/мл 6 lg ТЦД ₅₀/мл 8,5 lg ТЦД ₅₀/мл Инактивацию проводят формалином концентрации 0,2% 0, 25% 0,3% 0,1% 0,35% при температуре 37°С 37,5°С 38°С 36°С 38°С Полученный антиген штамма «Оригон» концентрируют полиэтиленгликолем в растворе 0,5-0,6 М NaCl 8%
0,5 М 8,5%
0,5 5 М 9%
0,6 М 7,5%
0,4 М 9,5%
0,7 М адъювант ГОА в концентрации до 2% до 2,5% до 3% до 1,5% до 3,5% Стабильность вакцины при хранении Не менее 12 месяцев Не менее 12
месяцев Не менее 12 месяцев Менее 12 месяцев Не менее 12 месяцев Антигенная активность вакцины Титр антител
1:64-1:128 Титр антител
1:1024-1:4096 Титр антител
1:1024-1:4096 Титр антител
1:16-1:32 Титр антител
1:32-1:128 Безвредность безвредная безвредная безвредная безвредная безвредная Стерильность стерильная стерильная стерильная стерильная стерильная Иммуногенность 85-90% 85-90% 85-90% 60% 74%

Источники информации

1. Автореф. дисс. к.в.н. Курбанбекова З.Д. Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана. М. - 2007 гг. - с.9.

2. Дисс. к.б.н. Литвинов О.Б. Экспериментальные исследования по разработке инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. М. - 1984 гг. - с.39.

3. Книга. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных. М. - ВНИТИБП. - 1998 гг. - с.139.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ включает культивирование штамма В-10 аденовируса в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 6-7 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена. Дополнительно осуществляют культивирование штамма Оригон вируса вирусной диареи в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 7-8 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена. После чего полученные антигены аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота инактивируют формалином до 0,2-0,3% конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 часов при рН 7,2-7,4. Концентрируют в 5 раз полиэтиленгликолем - 6000 в конечной концентрации 10% и 8% соответственно в растворе 0,5-0,6 М хлорида натрия. Смешивают в равных объемах. Добавляют официнальный адъювант гидроокись алюминия до 1,5-2,5% конечной концентрации в готовой вакцине. Способ обеспечивает получение безвредной вакцины, создающей в организме длительный и напряженный иммунитет одновременно против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. 1 табл.

Способ изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающий культивирование штамма В-10 аденовируса в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 6-7 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют культивирование штамма Оригон вируса вирусной диареи в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 7-8 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена, после чего полученные антигены аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота инактивируют формалином до 0,2-0,3% конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 ч при рН 7,2-7,4 и концентрируют в 5 раз полиэтиленгликолем-6000 в конечной концентрации 10% и 8% соответственно в растворе 0,5-0,6 М хлорида натрия, смешивают в равных объемах, добавляют официнальный адъювант гидроокись алюминия до 1,5-2,5% конечной концентрации в готовой вакцине.