СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ И ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/7088 A61K45/08 B82B3/00 A61P7/06 A61P37/04 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную и кроветворную системы.

Для поддержания иммунитета при острых воспалительных заболеваниях (например, пневмония) нагрузка только на костный мозг увеличивается в сотни раз. И самым напряженным, продолжительным и затратным моментом в поддержании числа и активности иммунокомпетентных клеток является синтез нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. Дефицит олигонуклеотидов - фрагментов нуклеиновых кислот - приводит к хроническому течению различных болезней, снижению иммунитета и уменьшению способности организма к саморегуляции и восстановлению поврежденных структур, что значительно снижает качество жизни человека. При проведении лучевой или цитостатической терапии страдают, прежде всего, функции быстро обновляющихся клеточных структур, к которым относится и костный мозг. Именно в костном мозге происходит образование ключевых клеток, отвечающих за иммунитет и защиту внутренней среды - лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов. Поэтому подавление функций костного мозга, истощение его резервов сказывается на всем организме. Терапевтическое применение стимуляторов иммунной и кроветворной систем во многом ограничено вследствие их побочных эффектов [1, 2]. Кроме того, ряд препаратов представляет собой белок и поэтому они применяются исключительно парентерально (в виде инъекций), что также имеет свои негативные последствия.

Ближайшим аналогом к предлагаемому средству по достигаемому результату является натриевая соль дезоксирибонуклеиновой кислоты (дезоксинат), получаемой из молок осетровых рыб и частично деполимеризованной с помощью ультразвука до молекулярной массы 2,7-4,0×10⁵ Дальтон. По данным литературы дезоксинат оказывает лечебное действие при острой лучевой болезни II-III степени тяжести и при гипо- и апластических состояниях системы крови, вызванных лучевой или полихимиотерапией [3]. Предполагается, что вследствие поступления дезоксината в поврежденную цитостатиками или ионизирующим излучением кроветворную ткань происходит усиление синтеза нуклеиновых кислот, что приводит к увеличению темпов деления гемопоэтических клеток-предшественников и, как следствие, ускоренному восстановлению клеточности ростков кроветворения.

Применение препарата ограничено вследствие развития осложнений, свойственных парентеральному пути введения. При использовании дезоксината отмечается болезненность на месте инъекции, у больных может повышаться температура тела, возможны аллергические и анафилактические реакции [3, 4].

Задачей изобретения является расширение арсенала иммуно- и гемостимулирующих средств.

Поставленную задачу решают путем применением иммобилизированных олигонуклеотидов в качестве иммуностимулирующего и гемостимулирующего средства для перорального введения.

Препарат иммобилизированных олигонуклеотидов представляет собой короткие фрагменты ДНК, высокоочищенные протеолитическими ферментами, молекулярной массой в пределах 500-700 кДа, полученных из сырья - «Экстракт молок лососевых - кислота дезоксирибонуклеиновая низкомолекулярная». Иммобилизацию олигонуклеотидов осуществляют путем облучения 10% водного раствора полиэтиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 1,5 кДа потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад и внесения в облученный раствор олигонуклеотидов ДНК молок лососевых рыб до конечной концентрации 10 мг в 1 мл, смесь перемешивают 10 минут до получения опалесцирующего раствора. Предварительно облученный полиэтиленоксид образует мицеллы, содержащие конденсированную ДНК, что позволяет защитить молекулу ДНК от деструкции в желудочно-кишечном тракте и облегчает проницаемость мицеллы через стенку кишечника. Повышенная биодоступность такого препарата предполагает возможность его применения путем приема внутрь.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что иммобилизированные на ПЭО олигонуклеотиды (им-ОГН) впервые предложены для применения в качестве иммуно- и гемостимулирующего средства для перорального введения.

Поэтому лекарственное средство, предлагаемое нами для перорального приема, может являться препаратом выбора при наличии у больного противопоказаний для применения других лекарственных препаратов и не имеет адекватных аналогов. Преимущества данного препарата очевидны. Во-первых, использование нанотехнологий радиационного синтеза и гамма излучения для иммобилизации молекул лекарственного средства на носителях низкой молекулярной массы препятствует их деградации в гастроинтестинальном отделе пищеварительного тракта и создает условия для транспорта через ячейки слизистой кишечника в кровоток. Во-вторых, применение уникальной технологии позволяет создавать водорастворимые конъюгаты полимеров и белковых фармакологических препаратов размерами 20-100 нм, обладающих повышенной биодоступностью при энтеральном приеме и сохраненной фармакологической активностью и терапевтической эффективностью [5].

Применение иммобилизированных на ПЭО олигонуклеотидов стало возможным благодаря обнаружению у них иммуностимулирующих свойств, а именно стимуляции фагоцитарных реакций in vivo и in vitro, повышении продукции интерферона-гамма (ИФН-γ) in vitro, усилении цитотоксической активности естественных киллеров (ЕК), повышении спонтанной пролиферативной активности лимфоидных клеток экспериментальных животных и индекса стимуляции В-лимфоцитов, повышении продукции оксида азота, а также гемостимулирующих свойств при введении per os.

Применение иммобилизированных на ПЭО олигонуклеотидов для перорального введения в качестве иммуно- и гемостимулирующего средства в литературе не описано. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Иммобилизированные олигонуклеотиды можно использовать у больных с иммунной недостаточностью, ассоциированной с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, при гипо- и апластических состояниях системы крови на фоне лучевой терапии и лечения цитостатиками.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Иммуностимулирующие свойства иммобилизированных на ПЭО олигонуклеотидов были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.

Для установления иммуностимулирующей активности иммобилизированных на ПЭО олигонуклеотидов было изучено их влияние на фагоцитоз нейтрофилов in vivo и in vitro, выработку ИФН-γ in vitro, на активность ЕК, пролиферативную активность лимфоидных клеток при пероральном способе применения исследуемого препарата, выработку оксида азота перитонеальными макрофагами лабораторных животных при добавлении им-ОГН in vitro.

Изучение иммунотропной активности иммобилизированных на ПЭО олигонуклеотидов проводилось согласно «Методическим указаниям по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ» [6].

В исследовании были использованы 175 мышей-самцов линии CBA/CaLac и 22 мыши-самца линии BALB/C массой 18-20 г в возрасте 1,5-2 мес, полученные из питомника НИИ фармакологии СО РАМН. Мыши линии BALB/C использовали в качестве источника перитонеальных макрофагов. Животные были конвенциональные 1-й категории (сертификат ГУ Научного центра биомедицинских технологий РАМН №188-05). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. №755).

Мышам иммобилизированные олигонуклеотиды вводили перорально курсом в течение 10-ти либо 14-ти суток один раз в день в дозе 10 мг/кг, 100 мг/кг и 250 мг/кг в объеме 0,2 мл стерильного физиологического раствора, контрольные животные получали в эквивалентном объеме растворитель (физиологический раствор). В качестве фона использовали интактных животных соответствующего пола и возраста.

В опытах in vitro им-ОГН добавляли в культуру нейтрофилов и мононуклеарных клеток здоровых доноров (в количестве 40 человек в возрасте 24-38 лет) в дозах 0,07 мкг/мл, 0,7 мкг/мл и 7 мкг/мл, а в культуру перитонеальных макрофагов мышей в дозах, на порядок различающихся, от 0,00034 мкг/мл до 33,775 мкг/мл.

Цитостатическую миелосупрессию моделировали однократным, внутрибрюшинным введением животным раствора фторпиримидинового антиметаболита 5-фторурацила в 1/3 максимально переносимой дозы (МПД) (76 мг/кг).

Забивали животных декапитацией под эфирным наркозом, либо передозировкой хлороформа.

Фагоцитарная активность перитонеальных нейтрофилов оценивалась через 24 ч после окончания 14-дневного курса введения иммобилизированных олигонуклеотидов по способности фагоцитов поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209. На мазках содержимого перитонеальной полости учитывали процент нейтрофилов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [6].

Для оценки влияния препарата на фагоцитоз in vitro брали кровь у здоровых доноров из кубитальной вены в пробирку с гепарином из расчета 25 ЕД на 1 мл исследуемой крови и смешивали с 0,8 мл 3% раствора желатины приготовленного на среде 199. Готовили клеточную суспензию, содержащую 2 млн нейтрофилов в 1 мл. Параллельно готовили взвесь Staph. aureus, штамм 209 в концентрации 20 млн/мл. При постановке реакции смешивали в 96-луночных круглодонных планшетах 90 мкл клеточной суспензии и 90 мкл стафилококка (соотношение 1:10) и планшеты инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Для изучения влияния им-ОГН на фагоцитоз к смеси добавляли по 20 мкл исследуемого препарата в концентрациях 0,07 мкг/мл, 0,7 мкг/мл и 7 мкг/мл. После инкубации планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин, из осадка готовили мазки на предметном стекле, фиксировали этанолом 30 мин и окрашивали азур II-эозином в течение 30-40 мин. На мазках учитывали процент нейтрофилов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [6].

Оценку влияния препарата на выработку ИФН-γ проводили на культуре мононуклеаров (МНК) периферической крови здоровых доноров [6]. Для этого исследуемый препарат добавляли в культуры мононуклеаров в концентрациях 0,07 мкг/мл, 0,7 мкг/мл и 7 мкг/мл в объеме 50 мкл. ИФН-γ в суточных супернатантах культур мононуклеаров определяли с помощью иммуноферментного метода, используя соответствующий набор производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Изучение влияния курсового 14-суточного введения им-ОГН на функциональную активность ЕК определяли в цитотоксической реакции по их способности лизировать клетки миелобластоидной линии К-562, используя колорометрический метод [7].

Для оценки влияния курсового 14-суточного введения им-ОГН на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов экспериментальных животных использовали реакцию бласттрансформации, которая в известной степени является интегральным методом определения их функциональной активности [6]. Этот метод основан на способности некоторых лектинов вызывать поликлональную активацию и пролиферацию лимфоцитов, которая оценивалась колориметрически [8]. Для активации Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА); для активации В-лимфоцитов - липополисахарид (ЛПС). В качестве источника лимфоидных клеток использовали спленоциты экспериментальных животных.

Для определения влияния исследуемого препарата на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных мышей им-ОГН добавляли в культуру макрофагов в дозах, на порядок различающихся, от 0,00034 мкг/мл до 33,775 мкг/мл. Макрофаги культивировали в плоскодонных 96-луночных планшетах в концентрации 2×10⁵ клеток на лунку 48 ч, после чего собирали из лунок надосадок и замеряли в нем количество нитритов при помощи реактива Грейса с использованием спектрофотометра «Titertek Multis-can MCC» («Titertek», Финляндия) при длине волны 540 нм [9].

В качестве лиганда TLR-9 использовали CpG-олигонуклеотид ODN1826 («InvivoGen», США). В качестве блокатора TLR-9 использовали ингибиторный олигонуклеотид ODN2088 («InvivoGen», США).

Гемостимулирующие свойства им-ОГН изучали на модели цитостатической миелосупресии, вызванной введением 5-фторурацила (5-ФУ). Препарат иммобилизированных олигонуклеотидов вводился мышам per os ежедневно с 1 по 10-й день исследования в дозе 250 мг/кг.

На 3, 5, 7, 9, 11 и 13 день эксперимента у мышей с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) в ветеринарном режиме оценивали состояние периферического звена системы эритрона (содержание гемоглобина, количество эритроцитов, гематокрит, среднюю корпускулярную концентрацию гемоглобина). Далее общепринятыми методами изучали содержание ретикулоцитов, различных форм лейкоцитов в периферической крови [10]. После умерщвления методом краниоцервикальной дислокации под эфирным наркозом оценивалось общее количество миелокариоцитов и абсолютное содержание клеточных элементов отдельных ростков гемопоэза в костном мозге [11].

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента, при отклонении вариационных рядов от нормального распределения применяли метод непараметрической статистики Вилкоксо-на-Манна-Уитни.

Результаты, подтверждающие иммуностимулирующие свойства иммобилизированных на ПЭО олигонуклеотидов при пероральном способе применения.

Пример 1. Изучение фагоцитарной активности перитонеальных нейтрофилов оценивалась через 24 ч после окончания 14-дневного курса введения иммобилизированных олигонуклеотидов в дозе 10 мг/кг (группа 3), в дозе 100 мг/кг (группа 4) или растворителя (группа 2) по способности фагоцитов поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209. Курсовое введение им-ОГН в дозе 10 мг/кг приводило к достоверному повышению относительного количества фагоцитирующих нейтрофилов экспериментальных животных как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, а также с группой мышей, получавших исследуемый препарат в дозе 100 мг/кг (табл.1). При этом число поглощенных бактерий (ФЧ) в группе животных с применением им-ОГН в дозе 10 мг/кг было статистически значимо выше относительно значений контрольной группы. Курсовое введение им-ОГН в дозе 100 мг/кг не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа нейтрофилов экспериментальных животных по сравнению

Таблица 1
Оценка влияния курсового введения иммобилизированных олигонуклеотидов на фагоцитарную активность перитонеальных нейтрофилов мышей линии CBA/CaLac Исследуемые показатели Группы экспериментальных животных Группа 1
Фон
(n=7) Группа 2
Контроль
(n=7) Группа 3
им-ОГН
(10 мг/кг)
(n=7) Группа 4
им-ОГН
(100 мг/кг)
(n=7) ФИ, % 12,0±0,36 14,0±0,73* 24,14±2,06*
_2-3Р<0,001 16,57±1,41*
_3-4Р<0,05 ФЧ 2,97±0,14 2,60±0,16 3,69±0,31
_2-3Р<0,01 2,96±0,15 Примечание: * - различия между опытными группами и фоном, между контрольной группой и фоном достоверны (р<0,05), n - количество животных в группе.

с контрольной группой, лишь относительно фона наблюдалось статистически значимое увеличение относительного числа фагоцитирующих нейтрофилов.

Пример 2. Оценка влияния иммобилизированных олигонуклеотидов на фагоцитоз нейтрофилов in vitro. При добавлении им-ОГН к нейтрофилам периферической крови здоровых доноров в различных концентрациях (0,07 мкг/мл, 0,7 мкг/мл и 7 мкг/мл) наблюдалось достоверное повышение фагоцитарного числа относительно значения контрольной группы при внесении в культуру нейтрофилов дозы иммобилизированных олигонуклеотидов 0,7 мкг/мл (табл.2). Также необходимо отметить, что при добавлении им-ОГН к нейтрофилам в различных дозах показатели фагоцитарной активности превышали контрольные значения, хотя и статистически незначимо, при этом по мере увеличения концентрации добавляемых им-ОГН фагоцитарный индекс снижался, а фагоцитарное число - повышалось.

Таблица 2
Оценка влияния иммобилизированных олигонуклеотидов в дозах 0,07 мкг/мл, 0,7 мкг/мл и 7 мкг/мл при их добавлении in vitro на фагоцитоз нейтрофилов периферической крови доноров Исследуемые показатели Экспериментальные группы Группа 1 Контроль
(n=10) Группа 2
им-ОГН
(0,07 мкг/мл)
(n=10) Группа 3
им-ОГН
(0,7 мкг/мл)
(n=10) Группа 4
им-ОГН (7 мкг/мл)
(n=10) ФИ, % 26,90±2,65 35,50±3,53 33,80±3,34 32,10±3,06 ФЧ 3,86±0,36 4,73±0,41 4,91±0,26
_1-3Р<0,05 5,09±0,50 Примечание: n - количество доноров в группе.

Пример 3. Оценка влияния иммобилизированных олигонуклеотидов на синтез ИФН-γ мононуклеарами периферической крови. При добавлении им-ОГН статистически значимое усиление продукции ИФН-γ наблюдалось при дозе вносимого препарата 0,7 мкг/мл (табл.3). Спонтанная выработка исследуемого цитокина в этой группе была достоверно выше как по сравнению с

Таблица 3
Оценка влияния иммобилизированных олигонуклеотидов в дозах 0,07 мкг/мл, 0,7 мкг/мл и 7 мкг/мл при их добавлении in vitro в культуру мононуклеаров на синтез ИФН-γ Экспериментальные группы Концентрация цитокина (пг/мл) Группа 1 Контроль (без добавления препаратов) (n=10) 9,64±1,17 Группа 2 им-ОГН (0,07 мкг/мл) (n=10) 10,31±1,14 Группа 3 им-ОГН (0,7 мкг/мл) (n=10) 21,29±5,21
_1-3Р<0,05
_2-3Р<0,05 Группа 4 им-ОГН (7 мкг/мл) (n=10) 9,52±1,46 Примечание: n - количество доноров в группе.

контролем, так и с группой, в которой им-ОГН добавлялись в дозе 0,07 мкг/мл.

Пример 4. Изучение влияния иммобилизированных олигонуклеотидов на функциональную активность естественных киллеров мышей. После 14-дневного курсового введения им-ОГН в дозе 10 мг/кг функциональная активность естественных киллерных клеток мышей повышалась как по сравнению с фоном, так и с группой контроля при всех изученных соотношениях мишеней к эффекторам, но статистически незначимо (табл.4). При этом применение им-ОГН курсом в дозе 100 мг/кг достоверно усиливало

Таблица 4
Оценка влияния курсового введения иммобилизированных олигонуклеотидов в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг на естественную киллерную активность (ЕКА) мышей линии CBA/CaLac Исследуемые показатели Экспериментальные группы Группа 1
Фон (n=7) Группа 2 Контроль (n=7) Группа 3
им-ОГН
(10 мг/кг) (n=7) Группа 4
им-ОГН
(100 мг/кг) (n=7) ЕКА (%) соотношение мишеней: эффекторов 1:10 35,70±2,66 32,67±1,44 38,90±3,32 38,86±2,43
_2-4p<0,05 ЕКА (%) соотношение мишеней: эффекторов 1:25 35,24±2,26 34,20±1,23 39,61±2,54 39,36±1,55
_2-4p<0,05 ЕКА (%) соотношение мишеней: эффекторов 1:50 37,49±1,50 37,60±1,42 42,68±2,78 49,32±4,47
_1-4p<0,05
_2-4p<0,05 Примечание: n - количество животных в группе.

цитотоксическую активность ЕК экспериментальных животных по сравнению с контролем при всех изученных соотношениях мишеней к эффекторам, а при соотношении мишеней к эффекторам 1:50 функциональная активность естественных киллеров статистически значимо возрастала и по сравнению с фоном.

Пример 5. Исследование влияния иммобилизированных олигонуклеотидов на пролиферативную активность лимфоцитов. После 14-дневного курсового введения им-ОГН в дозе 10 мг/кг наблюдалось достоверное повышение спонтанной пролиферативной активности лимфоидных клеток экспериментальных животных как по сравнению с фоном, так и с группой контроля (табл.5). При этом индекс стимуляции (ИС) Т-лимфоцитов статистически

Таблица 5
Оценка влияния курсового введения иммобилизированных олигонуклеотидов в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг на пролиферативную активность лимфоцитов мышей линии CBA/CaLac Исследуемые показатели Группы экспериментальных животных Группа 1
Фон (n=7) Группа 2 Контроль (n=7) Группа 3
им-ОГН
(10 мг/кг) (n=7) Группа 4
им-ОГН
(100 мг/кг) (n=7) Спонтанная пролиферация (ед.опт.плот.) 0,196±0,016 0,217±0,005 0,238±0,007
_1-3р<0,05
_2-3p<0,05 0,206±0,006
_3-4р<0,01 ИС (ФГА) 1,11±0,08 1,06±0,02 1,12±0,03 1,23±0,16 ИС (ЛПС) 1,94±0,22 1,53±0,15 2,09±0,07
_2-3р<0,01 1,99±0,14
_2-4p<0,05 Примечание: n - количество животных в группе.

значимо не изменялся как в группе с применением им-ОГН в дозе 10 мг/кг, так и в дозе 100 мг/кг. Однако индекс стимуляции В-лимфоцитов в обеих опытных группах с курсовым введением им-ОГН в дозе 10 мг/кг и 100 мг/кг был достоверно выше соответствующего показателя контрольной группы.

Пример 6. Исследование влияния иммобилизированных олигонуклеотидов на продукцию оксида азота в культуре перитонеальных макрофагах in vitro. Исследуемый препарат (табл.6) дозозависимо стимулировал продукцию оксида азота в концентрациях 3,3775 и 33,775 мкг/мл.

Таблица 6
Влияние иммобилизированных олигонуклеотидов на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами Концентрация
им-ОГН (мкг/мл) NO (нитриты, мкМ) контроль(без добавления препарата) 19,0±1,0 0,00034 21,4±1,9 0,00338 19,9±1,3 0,03378 19,7±1,5 0,33775 18,9±1,7 3,37750 27,0±2,5* 33,7750 49,5±3,2* Примечание: * - достоверные различия с контролем (р<0,05).

Для выяснения роли рецептора TLR-9 в стимуляции оксида азота препаратом были использованы коммерческий лиганд TLR-9 (CpG-олигонуклеотид ODN1826) и блокатор TLR-9 (ингибиторный олигонуклеотид ODN2088). Результаты исследования представлены в таблице 7. Стимулирующее действие CpG-олигонуклеотида дозозависимо отменялось при блокировании рецептора TLR-9. Действие исследуемого препарата также отменялось ингибиторным олигонуклеотидом ODN2088.

Таким образом, исследуемый препарат обладает стимулирующим действием в отношении макрофагов. Это действие опосредуется макрофагальным рецептором TLR-9.

Таблица 7
Роль TLR-9 в стимуляции продукции оксида азота перитонеальными макрофагами иммобилизированными олигонуклеотидами Условия культивирования Продукция оксида азота в присутствии: контроль-1 2,5 мкМ лиганда TLR-9 3,3775 мкг/мл им-ОГН 33,775 мкг/мл им-ОГН - контроль-2 0 14,3±0,5* 6,7±1,0* 10,4±0,6* + блокатор TLR-9 1,25 мкМ 0 7,8±0,6*# 0# 4,0±0,5*# + блокатор TLR-9 2,5 мкМ 0 0# 0# 0# Примечания: * - достоверные различия с контролем-1 (р<0,05); # - достоверные различия с контролем-2 (р<0,05).

Пример 7. Исследование влияние иммобилизированных олигонуклеотидов на восстановление кроветворения, подавленного введением 5-фторурацила. Введение им-ОГН способствовало значительному приросту абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови в период постцитостатического восстановления гемопоэза (9-е, 11-е, 13-е сутки) (табл.8). Обнаруженный в опыте лейкоцитоз был следствием накопления числа лимфоцитов и нейтрофилов в указанные сроки. Курсовое введение исследуемого препарата в дозе 250 мг/кг увеличивало содержание незрелых (на 3-и и 5-е сутки) и зрелых (на 7-е сутки) форм нейтрофильных гранулоцитов в сравнении с аналогичными параметрами цитостатического контроля (табл.9). Курсовое введение им-ОГН способствовало увеличению количества ретикулоцитов (на 13-е сутки) и тромбоцитов (на 9-е и 13-е сутки) в периферической крови после применения 5-ФУ (табл.10, 11).

Таблица 10
Влияние препарата иммобилизированных олигонуклеотидов в дозе 250 мг/кг на динамику содержания ретикулоцитов в периферической крови мышей линии CBA/CaLac, получавших 5-фторурацил (‰) Сроки исследования, сутки Экспериментальные группы 5-фторурацил Иммобилизированные олигонуклеотиды Интактный контроль 30,17±1,92 30,17±1,92 3 16,29±1,38* 13,57±1,19* 5 15,5±3,06* 14,78±3,10* 7 11,78±1,25* 14,20±1,40* 9 17,56±1,23* 18,16±1,36* 11 22,85±2,73* 18,65±2,07*
Р<0,02 13 17,93±5,58* 31,59±3,45
Р<0,02

Таким образом, использование предложенного способа физической иммобилизации олигонуклеотидов ДНК молок лососевых рыб на полиэтиленоксиде, массой 1,5 кДа, позволяет получить препарат для перорального применения, который проявляет существенную иммуностимулирующую активность, которая выражается в стимуляции фагоцитарных реакций in vivo и in vitro, повышении продукции ИФН-γ in vitro, усилении цитотоксической активности естественных киллеров, повышении спонтанной пролиферативной активности лимфоидных клеток экспериментальных животных и индекса стимуляции В-лимфоцитов, повышении продукции оксида азота, а также гемостимулирующие свойства при введении per os.

Источники литературы

1. Гончаров А.Г., Фрейдлин И.С., Смирнов B.C. и др. Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса: Практикум. - Калининград: Изд-во КГУ, 1997. - 73 с.

2. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введению в фармакотерапию злокачественных опухолей. - Санкт-Петербург, 1999. - 143 с.

3. Пашук Л.К., Апрышко Г.Н., Трещалина Е.М. Препараты ДНК как потенциальные терапевтические средства // Хим.-фарм. журнал. - 1995. - №6. - С.61-64.

4. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему // Успехи современной биологии. - 2001. - №121. - С.160-171.

5. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Эксперим. и клиническая фармакология. - 2008. - Т.71, №1. - С.61-69.

6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.- М., 2005 - 832 с.

7. Кузовкова Н.А. Оценка активности естественных киллеров колориметрическим методом // Иммунология. - 1991. - №4. - С.59-61.

8. Scudiero P.A. et al. // Cancer Res. - 1988. - Vol.48. - P.4827-4833.

9. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. Analysis of nitrate, nitrit and nitrat in biological fluids // Anal. Biochem. - 1982. - V.126. - P.131-138.

10. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

Предложено применение иммобилизированных олигонуклеотидов в качестве иммуностимулирующего и гемостимулирующего средства для перорального введения. Иммобилизированные на полиэтиленоксиде олигонуклеотиды ДНК молок лососевых рыб проявляют иммуно- и гемостимулирующую активности в условиях in vivo при пероральном применении у экспериментальных животных и in vitro, что проявляется в стимуляции фагоцитарных реакций in vivo и in vitro, повышении продукции ИФН-γ in vitro, усилении цитотоксической активности естественных киллеров, повышении спонтанной пролиферативной активности лимфоидных клеток экспериментальных животных и индекса стимуляции В-лимфоцитов, повышении продукции оксида азота, а также в усилении регенерации гемопоэза в ранние сроки после цитостатического воздействия. Иммобилизированные физическим способом олигонуклеотиды защищены от деструкции в желудочно-кишечном тракте, что облегчает их проницаемость через стенку кишечника и повышает биодоступность. 11 табл.

Применение иммобилизированных олигонуклеотидов, представляющих собой фрагменты ДНК молекулярной массой 500-700 кДа, высокоочищенные протеолитическими ферментами, полученные из экстракта молок лососевых, иммобилизованных на полиэтиленоксиде путем облучения 10%-ного водного раствора полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад и внесения в облученный раствор олигонуклеотидов ДНК молок лососевых рыб до конечной концентрации 10 мг в 1 мл, в качестве иммуностимулирующего и гемостимулирующего средства для перорального введения.