ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛИСТЕРИОЗА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и культивирования листерий.

При бактериологическом исследовании на возбудителя листериоза используют питательную среду триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEA), включающую, г/л: ферментативный гидролизат казеина - 170,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,04; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15; дистиллированной воды 1 л. (Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. Методически указания МУК 4.2.1122-02. Москва, 2002).

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для выделения листерий, содержащая, г/л: пептон на основе мяса говяжьего - 23,0; кукурузный крахмал - 1,0; лития хлорид - 15,0; натрия хлорид - 5,0; эскулин - 1,0; железа цитрат аммонийный - 0,5; агар-агар - 12,0 и ингибирующую добавку - 10,0 мл (циклогексимид - 0,4; колистина сульфат - 0,02; фосфомицина - 0,01; акрифлавина - 0,005; цефотетан - 0,002). (Питательные среды для медицинской микробиологии// Под ред. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. - Санкт-Петербург, 2003 г., с.134-135).

Недостатком данной среды является то, что для отечественной практики пропись ингибирующей добавки не всегда доступна, приобретение ее представляет определенную сложность.

Целью изобретения является получение качественной, простой и дешевой питательной среды для культивирования возбудителя листериоза.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат соевых бобов и стимулирующую добавку - ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, в следующим соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат плодов бобов сои   с содержанием аминного азота 0,08% 60,0-160,0 Ферментативного гидролизата из активированной   эмбрионально-яичной массы перепелов 6,0-10,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 1,0-3,0 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 Агар микробиологический 7,0-11,0 Дистиллированная вода до 1 л

В качестве сырья используют сою, плоды которой - бобы - содержат в среднем 40% белка, кроме того, соя богата микроэлементами и витаминами. Как известно (Y.P.Yupta, 1987), соевые белки характеризуются повышенным содержанием глютаминовой и аспарагиновой кислот, поставляющих макроэргические связи. Соевые белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как лизин, лейцин, аргинин. Имеются также сведения о способности лейцина как аминокислоты с разветвленной белковой цепью инициировать синтез белка (Е.И.Чазов, X.С.Морган, /США/ 1989).

Включение в состав среды фосфатного буфера (состав фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ является компонентом нуклеиновых кислот, фосфолипидов и нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1989).

Технология приготовления ферментативного гидролизата из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов

Десять перепелиных яйц с эмбрионами помещали в холодильную камеру бытового холодильника при температуре 2-8°C на 7 суток (методика приготовления тканевых препаратов по Филатову В.П., 1946). Яйца извлекали и обрабатывали 5% спиртовым раствором йода. Для дополнительной стерилизации яйца подвергали облучению в стерильном боксе источником УФ-излучения в течение 20 минут на расстоянии 1 метра. Затем осуществлялась гомогенизация извлеченных перепелиных эмбрионов из скорлуповой оболочки в размельчителе тканей в течение 5 минут до однородной жидкости желтого цвета. Полученная масса впоследствии подвергалась ферментативному гидролизу по классической методике Козлова Ю.А. (1950) в собственной модификации, которая заключается в следующем.

Гомогенат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов разбавляли питьевой водой, подогретой до температуры (45±1°C) в отношении 1:3. Полученную смесь подщелачивали Na₂CO₃ до pH 8,2-8,3 по фенолфталеину и помещали в трехлитровый стеклянный баллон. Затем добавляли дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу крупного рогатого скота (12,5%) и 1% хлороформа (к объему жидкости), баллон помещали в термокамеру при тeмпературе (45±1°C). Первые сутки смесь перемешивали через каждые 15 минут по 5 минут, в дальнейшем через каждые 2 часа по 5 минут.

Динамику ферментативного процесса определяли по нарастанию аминного азота. На 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращалось, термокамеру отключали, гидролизат отстаивали 2 суток. Гидролизат фильтровали через фильтровальное полотно, затем фильтровальную бумагу. Амминный азот в готовом гидролизате равен 421±6 мг%, сухой остаток равен 5,25±0,05%. Ферментативный гидролизат содержит следующие аминокислоты: треонин, цистин, изолейцин, аспарагин, аспарагиновая кислота, валин, лизин, аргинин и метионин, а также комплекс макро- и микроэлементов - цинк, медь, железо, натрий, калий.

Для консервации гидролизата добавляли 1% хлороформа (к объему жидкости), хранили герметично закрытым при температуре 5±3°C.

Приготовление питательной основы для выращивания микроорганизмов заключается в следующем.

Плоды сои - бобы - в количестве 0,5 кг пятикратно вымачивают в 5 л горячей воды в течение 1 суток, причем последний настой с бобами кипятят в течение 40 мин. Затем настой сливают в 10 л баллон, охлаждают, бобы измельчают мясорубкой и помещают в настой. Добавляют поджелудочную железу КРС из расчета 20,0 на 1 л, устанавливают pH до 8,2 20%-ным раствором натрия гидроокиси в количестве 3 мл, добавляют 1% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 37°C в течение 3 сут. Первые 2 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин по 5 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч по 5 мин. Ежедневно измеряют уровень аминного азота, который на 3 сутки составил 0,6±0,05%.

Питательную среду на ферментативной основе сои бобов для выращивания возбудителя листериоза готовят следующим образом. Ферментативный гидролизат из соевых бобов, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,08% - 100 мл; натрий хлористый - 5,0; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 4,0; ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов - 8,0; агар микробиологический - 9,0; дистиллированная вода до литра.

Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем устанавливают pH 7,2±0,1 с помощью 20%-ного раствора натрия гидроокиси. Готовую среду разливают в 0,5 л бутылки по 400,0±10,0 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 мин. Согласно методических рекомендаций №11 (Москва, 2011 г.) и (МУ 4.2.1122-02) по определению качества питательных сред для выращивания возбудителя листериоза готовят культуры вирулентных штаммов Listeria monocytogenes №1-2. Для этого культуры, хранящиеся на скошенной поверхности агара Хоттингера, высевают в бульон Хоттингера pH 7,2. Через 24-48 ч при температуре 37°C 18-20 ч роста с бульона отбирают по 0,1 мл взвеси, засевают на чашки Петри с кровяным агаром, в случае видимого роста на пластинках агара, бактериологической петлей засевают в пробирки с агаром Хоттингера, пересевают их на агаровые пластинки. Культуру выращивают 24 ч при 37°C, после чего используют для контроля. Из суточной культуры готовят взвесь м.т., равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности по ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до содержания в 1 мл 1000 и 100 м.к. Из данных разведений, взвеси культур высевают по 0,1 мл стерильной бактериологической пипеткой по 3 чашкам Петри опытной и контрольной среды. В качестве последней используют кровяной агар. Выращивание производят при 37°C. Питательная среда плотная считается пригодной в том случае, если при посеве 100 и 10 м.к. тест-штамма через 24-48 ч выращивания вырастает соответственно не менее 50% колоний диаметром 1 мм на всех чашках, дающих бета-гемолиз на пластинках кровяного агара.

Пример 1. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) - 60,0; ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов - 6,0; натрий хлористый - 4,0; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 1,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12- водный - 3,0; агар микробиологический - 7,0; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для листерий при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило соответственно 45 и 3 колонии диаметром 1,0 мм. На контрольном кровяном агаре наблюдался бета-гемолиз.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) - 100,0; ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов - 8,0; натрий хлористый - 5,0; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12- водный - 4,0; агар микробиологический - 9,0; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для листерий при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило соответственно 59 и 6 колоний диаметром 1,3 мм. На контрольном кровяном агаре наблюдался бета-гемолиз.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) - 160,0; ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов - 10,0; натрий хлористый - 6,0; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 3,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12- водный 5,0; агар микробиологический - 11,0; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинах агара, для листерий при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило соответственно 47 и 4 колонии диаметром 1,0 мм. На контрольном кровяном агаре наблюдался бета-гемолиз.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования возбудителя листериоза (пример 2), приготовленная на ферментативных гидролизатах сои (бобы) и ферментативном гидролизате из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, может применяться для культивирования возбудителя листериоза. Среда качественная, простая в приготовлении и экономически выгодная. Рентабельность питательной среды плотной для культивирования возбудителя листериоза составляет 28,4%.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред для культивирования возбудителя листериоза. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат бобов сои, ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, натрий хлористый, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет упростить питательную среду для культивирования возбудителя листериоза. 3 пр.

Питательная среда плотная для культивирования возбудителя листериоза, содержащая, г/л:
Ферментативный гидролизат плодов бобов сои   с содержанием аминного азота 0,08% 60,0-160,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Ферментативный гидролизат из активированных   эмбрионально-яичной массы перепелов 6,0-10,0 Калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 1,0-3,0 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 Агар микробиологический 7,0-11,0 Дистиллированная вода до 1 л