ШТАММ LACTOCOCCUS LACTIS-ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА НИЗИНА Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12P1/04 C12R1/46 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, молочной, кожевенной, овощесушильной и хлебопекарной промышленности. Свежеприготовленные пищевые продукты подвержены порче, вызываемой жизнедеятельностью микроорганизмов, и срок их хранения измеряется часами. Все способы обработки пищевых продуктов, позволяющие удлинить их срок хранения, относятся к консервированию, и добиться его можно различными путями: термообработка, варка с сахаром, посол, квашение, маринование и другие.

Многие химические антисептики, подавляющие развитие микроорганизмов, вредны для здоровья человека, например уротропин, борная кислота, которые используют при консервировании икры и других продуктов. Концентрации их выше 0,1-0,3% вызывают у человека рвоту, понос, раздражение почек и мочевого пузыря. Сорбиновая кислота в концентрации 0,05-0,1% используется для консервирования хлебобулочных и кондитерских изделий, для предотвращения плесневения сыров, полукопченых колбас и других продуктов.

Антибиотики, как и антисептики, представляют собой химические вещества бактерицидного характера. Однако, несмотря на применение их несколькими десятитысячными долями процента, они опасны и медики возражают против их применения. Из числа антибиотиков, не имеющих применения в медицине и в то же время представляющих интерес для пищевой промышленности, наибольшее значение имеет низин. Низин задерживает рост стафилококков, стрептококков, клостридий и других микроорганизмов. В отличие от сорбиновой кислоты низин совершенно не подавляет дрожжевую микрофлору. Его антибиотическая активность действительна лишь по отношению к споровым бактериям. Низин является очень удачным дополнением к химическому консерванту - сорбиновой кислоте, так как вместе они оказывают бактерицидное действие на достаточно широкий спектр, подлежащий уничтожению вредной микрофлоры. Важной особенностью низина является его способность снижать сопротивляемость спор термоустойчивых бактерий к нагреванию, благодаря чему увеличивается эффективность промышленной стерилизации консервов, позволяя при этом снижать температуру стерилизации, что в свою очередь способствует повышению качества и пищевой ценности консервных продуктов и снижению энергозатрат в пищевой промышленности. Низин синтезируется молочнокислыми бактериями и представляет не индивидуальное вещество, а семейство близких по структуре и физико-химическим свойствам полипептидов. Известны низины A, B, C, D, E, L и Z, которые отличаются аминокислотным составом и биологическим действием. Известен мутантный штамм Streptococcus lactis ВКПМ-В- 4591 - продуцент антибиотика низина (авторское свидетельство СССР N 1687616 МКИ C 12 P 21/00, С 12 N 1/20, БИ N 40 1991).

Антибиотическая активность данного рекомбинантного штамма на минеральной среде с глюкозой или мальтозой равна 4000-4200 МЕ/мл при времени ферментации 8-9,5 ч. Недостатком известного мутантного штамма является относительно низкая активность конечного целевого продукта - низина - и недостаточная устойчивость его в производственных условиях.

Известен штамм Streptococcus lactis ВКПМ-В-6793 - продуцент бактериоцина низина (патент РФ N 2061042 МКИ⁶ С 12 N 1/20, С 12 Р 1/04, С 12 R 1:46 БИ N 15 1996).

Недостатком этого известного штамма является относительно низкая активность низина - 4800 МЕ/мл и меньший спектр сбраживания сахаров и спиртов.

Известен штамм Streptococcus lactis ВКПМ-В-6795 - продуцент бактериоцина низина (патент РФ N 2059716 МКИ⁶ С 12 N 1/20, С 12 Р 1/04 БИ N 13 1996), который обеспечивает активность 5600 МЕ/мл, продуктивность 2520 МЕ/см³ч при скорости протока среды Д = 0,45 ч^-1. Недостатком его использования в производстве является меньший спектр сбраживания углеводов и относительно меньшая активность синтеза низина на гидролизованном молоке.

Наиболее близким по техническому решению и производственным показателям является штамм Streptococcus lactis 47-28 ВКПМ-В-7430 (патент РФ N 2115724 МКИ⁶ С 12 N 1/20, С 12 Р 1/04, С 12 R 1:46 БИ N 20 1998), который обеспечивает сбраживание более широкого спектра различных сахаров и спиртов, довольно высокую активность 11500-12500 МЕ/мл. Недостатком известного штамма являются резкие колебания активности на производственной среде от 6000 до 12500 МЕ/мл при длительной ферментации и небольших нарушениях по технологическому режиму приготовления, стерилизации питательной среды и культивирования, что ставит для промышленного производства актуальные задачи:
1) селекции стабильного нового штамма продуцента низина, не изменяющего так резко содержание конечного целевого продукта на всех стадиях ферментации и выделения, что позволяет получить в производстве качественный продукт по содержанию консерванта и количество его будет стабильно на всех стадиях производства;
2) найти более экономичный фермент, который обеспечивал бы меньший его расход и сократил бы время гидролиза производственной среды. Предлагаемый нами фермент мегатерин обеспечил в камеральных условиях в два раза меньший его расход (0,5 г/л против 1 г/л) и сократил время гидролиза до 3 часов против 5-6 часов при использовании фермента протосубтилина.

Технический результат заключается в получении стабильного штамма при длительной ферментации по синтезу низина и сокращении расходов фермента и времени гидролиза при приготовлении питательной среды, что улучшает экономические показатели в целом всего производства пищевого консерванта - низина.

Lactococcus lactis 58-16 хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером ВКПМ-В-7699. Штамм получен путем длительного отбора с периодического и непрерывного процесса варианта активного и стабильного по синтезу низина. Проверка активности селекционированного штамма проведена, начиная с лабораторной стадии культивирования молочнокислой культуры, на 12% стерильном обезжиренном молоке в пробирках, качалочных колбах, а из последней 2-х литровой колбы засевной материл переносится стерильно в производственную среду, которая готовится с новым ферментом мегатерином, при концентрации его в среде в два раза ниже - 0,5 г/л против 1 г/л протосубтилина, ранее использовавшегося для гидролиза молочных компонентов питательной среды.

Приготовление: сухое обезжиренное молоко разводят водой до содержания сухих веществ 30 г/л, добавляют 20 г/л сыворотки, кипятят, охлаждают до 45-50^oC , доводят до pH 7,2-7,5 единиц, вносят мегатерин, растворенный в небольшом количестве теплой дистиллированной воды из расчета 0,5 г/л среды. Гидролиз проводят при температуре 50^oС в течение 3 часов. По окончании гидролиза доводят pH среды до 7,0 единиц и стерилизуют 30 мин при 0,8 ати.

Питательная среда может быть использована для качалочных колб и ферментеров различных конструкций и объемов. Регулирование pH среды в колбах производится добавкой 10% раствора NaOH. Активность образования низина проводится микробиологическим методом диффузии в агар с тест организмом Bacillus coagulans.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699: на мясо-пептонном агаре образует мелкие выпуклые блестящие колонии серовато-беловатого цвета с ровными краями диаметром до 0,5 мм. Клетки овальные кокки до 0,7 х 0,7; 0,7 х 0,9; 1,05 х 1,05 мкм в диаметре, реже одиночные, в основном образующие диплококки или цепочки до 4-6-8 клеток. Бактерии грамположительные, бесспоровые, неподвижные, желатину не разжижают, нитраты не восстанавливают, каталазо- оксидазоотрицательные, сбраживают из углеводов: глюкозу, лактозу, галактозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, слабо - маннозу, рамнозу; из спиртов: сорбит, глицерин; слабо - маннит. Индола, сероводорода не образуют. Молоко быстро свертывают, не пептонизируют, продолжительность свертывания молока при внесении 1% инокулянта - 13-14 ч. Факультативный анаэроб, температура выращивания 28-31^oС, pH среды 6,8-7,0. Содержание Г+Ц в ДНК варьируется в пределах 33-42 мол.%.

Культура хранится в сублимационно высушенном состоянии в ампулах при температуре -4 ±2^oC не менее трех лет и в виде молочного сгустка в 12% обезжиренном стерильном молоке с ежемесячным пересевом и хранением в бытовом холодильнике при температуре 4-6^oC.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Штамм Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699 восстанавливают следующим образом: содержимое ампулы вносят в пробирку со стерильным обезжиренным 12% молоком с добавкой 0,1% дрожжевого автолизата и инкубируют при температуре 30^oС в течение 16-18 часов, из полученного сгустка молочнокислого штамма бактерий делают 3 пассажа. Из последнего пассажа восстановленной культуры готовят инокулянт на обезжиренном молоке в пробирках или маленьких колбочках, 10% инокулянта вносят в качалочные колбы объемом 750 мл и проводят периодическое культивирование на качалке при 220 об/мин в течение 14-16 часов. Активность штамма Lactococcus lactis ВКПМ В-7699 составила 1950 МЕ/мл в пробирках, в колбе на 100 мл - 2055 МЕ/мл, в качалочной колбе - 2075 МЕ/мл.

Пример 2. Штамм Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699 выращивали на производственной среде. В качестве производственной среды используют гидролизованное молоко и сыворотку. Приготовленное сухое обезжиренное молоко разводят водой до содержания сухих веществ 30 г/л, добавляют 20 г/л сыворотки, кипятят, охлаждают до 45-50^oC, доводят до pH 7,2-7,5 единиц, вносят мегатерин, растворенный в небольшом количестве теплой дистиллированной воды из расчета 0,5 г/л среды. Гидролиз проводят при температуре 50^oC в течение 3 часов. По окончании гидролиза pH среды доводят до 7,0 единиц и стерилизуют 20 мин при 0,8 атм. Питательная среда может быть использована для качалочных колб и ферментеров различного объема. Регулирование pH среды в колбах и ферментерах производят добавкой 10% раствора щелочи (NaOH). Активность образования низина штаммом Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699 в периодическом режиме в колбах составила 10350 МЕ/мл, в то время как при использовании протосубтилина для гидролиза питательной производственной среды активность составила 8750 МЕ/мл, причем время гидролиза было в два раза продолжительнее 5-6 часов, а расход фермента составил 1 г/л среды.

Пример 3. Выращивание штамма Lactococcus lactis ВКПМ- В-7699 осуществляли в периодическом, полунепрерывном и непрерывном процессе в аппаратах Биостат, Марубиши рабочим объемом 10 и 20 л при температуре 28-30^oC, pH среды 6,7-7,0 единиц. Засевной материал, выращенный в термостате в качалочных колбах или 2-х литровой колбе, переносили под факелом в засевную колбу с нижним отводом для засева аппарата, регулирование pH проводили путем непрерывной подачи 10% раствора щелочи (NaOH). В результате в конце логарифмической фазы роста молочнокислой бактерии образуется наибольшее количество низина 12800 МЕ/мл.

Таким образом, предлагается более активный стабильный штамм Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699, обеспечивающий высокий выход конечного целевого продукта низина на всех стадиях культивирования в аппаратах Биостат и Марубиши 12800 МЕ/мл. При приготовлении производственной среды используется фермент мегатерин, обеспечивающий меньший период гидролиза 3 часа вместо 5-6 часов при использовании протосубтилина, что обеспечивает более высокий экономический эффект производства за счет снижения электроэнергии и меньшего расхода фермента 0,5 г/л вместо 1 г/л у протосубтилина.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет новый штамм Lactocoсcus lactis ВКПМ-В-7699 - продуцент пищевого полипептидного консерванта низина. Данный штамм обеспечивает стабильный синтез и высокий выход целевого продукта. Использование: при приготовлении производственной среды фермента мегатерина приводит к сокращению периода гидролиза и расхода фермента.

Штамм бактерий Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699 - продуцент пищевого полипептидного консерванта низина.