СПОСОБ СОЧЕТАННОЙ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/569 A61K39/00 

Изобретение относится к исследованию биологических материалов и может быть использовано для оценки иммунологического состояния организма при воздействии возбудителя бруцеллеза
Цельная кровь живого организма, перенесшего заболевания бруцеллезом обладает высокой фагоцитарной активностью в отношении бактерий группы бруцелл, в основе которой лежат опсонины и бактериотропины.

Фагоцитарная реакция крови при бруцеллезе в высокой степени специфична и сохраняется на протяжении длительного периода и после исчезновения симптомов болезни.

Попытки использовать свойства крови в нарастании титров опсонинов в процессе бруцеллезной инфекции в целях диагностики бруцеллеза известны с 1912 г.

При изучении опсонофагоцитарной реакции (ОФР) на больных в комплексе с реакциями Райта и Бюрне, выявлено, что оно чувствительнее реакции Райта, но она может быть положительной и у лиц, не больных бруцеллезом и наоборот, у 7 - 8% больных бруцеллезом - стойко отрицательна. В процессе болезни ОФР подвержена значительным колебаниям, что соответствует волнообразному течению болезни. Показатель ОФР до некоторой степени может служить критерием реактивности организма, отражая его защитные свойства, но не являясь показателем стойкого выздоровления и не отражая стойкого иммунитета. Интенсивность ОФР неодинакова при различных формах инфекции (Первушин Б.П. Вопросы микробиологической иммунологической диагностики бруцеллеза у человека. М., 1962, с. 151).

Известно, что судьба антигенов, поглощенных нейтрофилами, в значительной степени зависит от состояния микробицидных систем и гидролитических ферментов этих клеток. Среди микробицидных факторов важное место занимает кислородзависимая (пероксидазная) и кислороднезависимая (лизосомально-катионные белки) системы (Klebanoff Blood 1975, v. 45, p. 699 - 707).

Известно, что повышение фосфатазной активности нейтрофилов при инфекционно-воспалительных заболеваниях связано с усилением фагоцитарной функции лейкоцитов.

Ряд исследователей свидетельствуют о том, что лизосольмано-катионный тест в сочетании с определением показателей фагоцитоза может быть рекомендован для прогнозирования течения болезни и оценки эффективности терапии (Морозов Р.П. Архив патологии 1985, N 10, с. 31 - 36).

При изучении бруцеллезной инфекции фагоцитарная реакция проводится в сочетании с традиционными диагностическими тестами (серологическая реакция и кожно-аллергическая проба) без учета того фактора, что фагоцитоз представляет собой сложнейший биохимический процесс, сопровождающийся перестройкой клеточного метаболизма фагоцитирующих клеток, поэтому изучая только фагоцитирующую способность нейтрофилов невозможно полностью охарактеризовать функциональные возможности нейтрофила в связи с чем затруднено прогнозирование течения болезни и возникновение рецидивов заболевания.

Известен классический способ постановки ОФР по Хеддельсону выбранный нами в качестве прототипа, который заключается в следующем. Равные количества цитратной (0,8% лимоннокислого натрия) крови испытуемого субъекта и густой (4 млрд. КОЕ) суспензии живых бруцелл смешивают в пробирке и смесь инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем готовят мазки.

Степень опсоно-цитофагической активности определяют из подсчета фагоцитированных бактерий в 25 нейтрофильных гранулоцитах в различных секциях препарата и обозначают как отрицательная, если фагоцитоз отсутствует, "слабая", если в клетке от 0 до 20 бактерий, "умеренная" если в клетке от 21 до 40 бактерий и "выраженная", если в клетке свыше 40 бактерий. Интерпретацию результатов проводят в сочетании с результатами реакции аглютинации и кожно-аллергической пробой (Первушин Б.П. с. 149 - 150).

Известны некоторые модификации этого метода, в частности по приемам учета фагоцитированных клеток, подготовки и окрашивания мазков, изменении концентрации бактериальной массы, варьировании типов антигенов, использовании убитых при 70^oC в течение 30 мин бактериальных клеток (Первушин Б.П. с. 152, 153, 155, 157, 158, 162).

Однако все известные способы постановки ОФР имеют недостаточную степень информативности, не обеспечивают возможность прогнозирования течения и возможного исхода бруцеллезного заболевания.

Целью изобретения является получение дополнительных тестов для оценки иммунологического состояния организма при воздействии возбудителя бруцеллеза.

Поставленная цель достигается тем, что исследуется функциональная активность нейтрофилов периферической крови при воздействии возбудителя бруцеллеза путем смешивания исследуемой крови с гепарином, внесением в кровь живой культуры возбудителя инкубированием смеси при 37^oC, двухкратного приготовления мазков через 30 и 100 - 120 мин и учета результатов реакции по количеству поглощенных клеток на первом мазке, по активности ферментов на первом и втором мазках и по количеству лизированных форм бруцелл на 2-ом мазке, а оценку функциональной активности - относительным показателем количества лизированных клеток к общему числу поглощенных.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование в качестве коагулянта гепарина, что исключает ингибирование ферментативных процессов в клетках крови. Проведение дополнительного учета активности энзимов и ферментов и количества лизированных клеток, обеспечивает информацию о состоянии ферментативной системы, а также более объективно оценивать иммунологическое состояние организма.

Временной интервал 30 и 100 - 120 мин выбран исходя из того что через 30 мин практически заканчивается поглощение микробов нейтрофилами, а до 100 - 120 мин происходит их лизирование.

Заявляемый способ осуществлялся следующим образом. Подопытные морские свинки и крысы линии Фишер были разделены на 2 группы. Животным первой группы подкожно вводили вирулентный штамм Б. мелитензис в дозе 10 тыс. КОЕ, второй группе - вакцинный штамм Б. абортус, в дозе 1 млрд. КОЕ. Кровь на исследование бралась на 15, 30, 45, 60 и 90 сутки с начала исследования. К 1 мл гепаринизированной крови (10 Ед гепарина на 1 мл крови) добавляли 0,1 мл 4 млрд. взвеси микробных клеток Б. мелитензис 565 на физиологическом растворе и ставили в термостат при 37^oC. В приготовленных мазках велся учет двух показателей интенсивности фагоцитоза, т. е. количества микробных клеток, поглощенных нейтрофилом и число погибших микробов. Из этих двух показателей выводили переваривающий индекс, отражающий отношение лизированных форм бактерий к общему количеству поглощенных. Первый показатель учитывали через 30 мин с момента постановки опыта, второй через 2 часа, когда нейтрофилы уже не поглощали микробы, а начинали перерабатывать и лизировать их.

В нейтрофилах крови цитохимически определяли содержание катионных белков, миелопероксидазы и кислой фосфатазы, с последующим учетом результатов и выделением цитохимического показателя. Реакции проводились до постановки ОФР и после. Это делалось для выяснения состояния ферментативной системы нейтрофилов в процессе фагоцитоза.

У зараженных животных (1 гр) м.свинки на 15 и 21 сутки развития инфекционного процесса не наблюдалось достоверных изменений интенсивности фагоцитоза, на 30 сутки происходило резкое повышение фагоцитарной активности нейтрофилов. Во все последующие сроки этот показатель был недостаточно высок. У крыс линии Фишер этот показатель значительно возрастал на 15 сутки развития инфекционного процесса этот процесс продолжался до 45 суток, когда достигал своего максимального значения.

По активности цитохимических показателей, на 15 сутки после заражения, достоверных отличий между крысами и м.свинками не выявлено, т.е. содержание катионных белков и кислой фосфатазы незначительно уменьшалось. Через 30 мин после постановки ОФР активность ферментов продолжала понижаться, но более интенсивно у м.свинок.

На 30 сутки развития инфекционного процесса в крови крыс линии Фишер начинает увеличиваться активность кислой фосфатазы и миелопероксидазы и достигает максимального значения на 45 сутки, после чего этот показатель достоверно не изменялся.

При учете цитохимических показателей через 2 часа после постановки ОФР активность ферментов достоверно не изменилась, но при этом выявлялось большое количество лизированных форм бруцелл.

У м.свинок активность цитохимических показателей продолжала уменьшаться. При учете результатов через 30 мин 2 часа после ОФР резко снижалось количество катионных белков и активность мнелопероксидазы, кислой фосфатазы.В то же время наряду с высокой поглотительной способностью нейтрофилов их лизирующая активность была не высокой.

В последующие сроки развития инфекционного процесса активность ферментов в крови м.свинок оставалась без достоверных изменений, а с 60 суток начинала повышаться, не достигая однако исходного уровня.

У вакцинированных животных фагоцитирующая способность нейтрофилов достоверно повышает начиная с 30 - 45 суток. У м.свинок на ранних сроках развития инфекционного процесса через 30 мин после постановки ОФР наблюдалось резкое понижение активности цитохимических показателей, которые достоверно не изменялись через 2 часа. У крыс максимальное понижение цитохимических показателей проходилось на 2 часа постановки ОФР. При этом периваривающий индекс был значительно выше, чем у м.свинок. Начиная с 45 суток в крови крыс начинает понижаться активность ферментов и достигает своего минимума к 60 суткам, в дальнейшем оставаясь без изменений.

Учет цитохимических показателей в сочетании с постановкой ОФР выявил тенденцию к значительному понижению активности ферментов в крови м.свинок на ранних сроках инкубации культуры бруцелл с кровью, у крыс эти изменения были выражены не так ярко и достигали своего пика на более поздних сроках постановки ОФР.

Сопоставление цитохимических показателей у животных исследованных групп выявило их зависимость от сроков развития инфекционного и вакцинного процессов, от характера антигенов и от вида животного. У резистентных к бруцеллезу животных (крысы линии Фишер) изменения цитохимической активности в нейтрофилах крови были выражены в меньшей степени, нежели у м.свинок, чувствительных к данной инфекции. В то же время переваривающая способность нейтрофилов последних была значительно ниже.

Таким образом изобретение практически осуществимо, использование заявленного способа в исследовании крови живых организмов, находящихся под воздействием возбудителя бруцеллеза позволит создать дополнительный тест для оценки тяжести течения инфекционного процесса, эффективности лечения и состояния иммунной системы.

Изобретение предназначено для оценки иммунологического состояния организма при воздействии возбудителя бруцеллеза. Исследуемую кровь смешивают с гепарином и вносят живую культуру возбудителя. Инкубируют смесь при 37^oC. Затем приготавливают мазки дважды: через 30 и 100 - 120 мин. Учет результатов реакции проводят по количеству поглощенных клеток на первом мазке, по активности энзимов и ферментов на первом и втором мазках и по количеству лизированных форм бруцелл на втором мазке. При этом оценку функционального состояния характеризуют относительным показателем количества лизированных клеток к общему количеству поглощенных и изменением цитохимических показателей в процессе постановки опсонофагоцитарной реакции (ОФР). Способ обладает высокой степенью информативности и обеспечивает оценку иммунологического состояния организма при воздействии возбудителя бруцеллеза.

Способ сочетанной оценки функциональной активности нейтрофилов периферической крови при воздействии возбудителя бруцеллеза, включающий смешивание исследуемой крови с антикоагулянтом с внесением в смесь живой культуры возбудителя, инкубированием смеси при 37^oC, приготовлением мазков через 30 мин с последующим учетом результатов реакции по количеству поглощенных клеток, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта используют гепарин, мазки приготавливают через 30 и 100 - 120 мин инкубирования смеси и дополнительно ведут учет активности энзимов и ферментов до инкубации на первичных и вторичных мазках, а на вторичных мазках - количества лизированных клеток, при этом активность нейтрофилов оценивают по относительному показателю количества лизированных клеток к общему количеству поглощенных.