СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНОГО К ТУБЕРКУЛЕЗУ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Известен способ прогнозирования развития туберкулезного процесса по иммунологическим показателям (см. патент РФ №2173457, кл. МКИ G 01 N 33/48, опуб. 10.09.2001), заключающийся в исследовании нейтрофилов периферической крови, определении фагоцитарного индекса завершенности фагоцитоза, поглотительной способности, исследовании моноцитов-макрофагов периферической крови и определении Fcy-рецепторов и лизосомов.

Однако способ предназначен только для человека и используется для прогнозирования течения туберкулезного процесса уже инфицированных людей.

Известен способ оценки иммунного состояния организма, основанный на иммунологическом исследовании крови при аллергии у людей к промышленным химическим соединениям (см. Алексеева О.Г., Дуева Л.А. Аллергия к промышленным химическим соединениям.// М.: Медицина. - 1978. - С.179), заключающийся в смешивании цитратной крови больного с аллергеном, растворенном в физиологическом растворе, инкубировании смеси, приготовлении мазков, окрашивании их и определении индекса агломерации лейкоцитов как отношение числа склеенных лейкоцитов к выбранному анализируемому их количеству. Оценка реакции основана на сравнении процента агломерированных (по 3 и более) лейкоцитов в пробе с аллергеном с процентом таковых в контрольной пробе. Реакцию считают положительной, если в опытной пробе процент агломерированных лейкоцитов превышает таковой в контроле не менее чем на 1/3.

Данный способ основан на специфическом усилении склеивания (агломерации) лейкоцитов при добавлении к крови сенсибилизированного индивидуума in vitro аллергена, вызвавшего сенсибилизацию. Феномен агломерации является первой фазой аллергической реакции организма.

Однако способ предназначен только для исследования аллергии у людей и не может быть использован для исследования иммунной защиты животных при отсутствии специфических антигенов в организме животного, в частности микобактерий.

Известен способ оценки иммунного состояния организма животных при туберкулезе, заключающийся в постановке серологических реакций: реакции связывания комплемента, реакции агглютинации, реакции гемолиза и иммунологических исследований крови (см. статья Козин А.И., Овдиенко Н.П. Значение серологических методов в диагностике туберкулеза КРС. - Бюл. ВИЭВ, вып.65. - М.: ВИЭВ, 1988. - С.48-51).

Однако данные реакции не выявляют устойчивых и восприимчивых к туберкулезу животных, а только позволяют обнаруживать уже инфицированных животных и удалять их с ферм.

Наиболее близким к заявляемому является способ отбора крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу (см. патент РФ №2080061, кл. МКИ А 01 К 67/02, опуб. 27.05.97), включающий иммуногенетический анализ крови и отбор животных по комплексу аллелей групп крови и антигенов BoLA-системы, маркирующих устойчивость. Данный метод направлен на решение задачи определения генетической устойчивости животных и позволяет отбирать для воспроизводства животных конкретной породы - крупный рогатый скот.

Однако способ не учитывает иммунологических показателей и не позволяет определять устойчивость к туберкулезу других видов животных (свиней, овец), включая и лабораторных (морских свинок, мышей, крыс, кроликов). Кроме этого, способ длителен и сложен в исполнении, требует большого количества ингредиентов и не учитывает возрастную устойчивость животных.

Изобретение направлено на решение задачи создания простого в исполнении способа определения устойчивости организма животного к туберкулезу, позволяющего качественно и с минимальными затратами производить дифференциацию различных групп животных как сельскохозяйственных, так и лабораторных, на восприимчивых и устойчивых к туберкулезу.

Для решения поставленной задачи в способе определения устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови, согласно изобретению к цитратной крови животного добавляют комплемент морской свинки и физиологический раствор в соотношении комплемент морской свинки к физиологическому раствору и цитратной крови 1:2:10, смесь инкубируют, готовят мазки и окрашивают, затем определяют индекс агломерации лейкоцитов и при его значении до 2,5% делают вывод об устойчивости организма животного к туберкулезу, а при значении более 2,5% - о восприимчивости к данному заболеванию.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано простого в исполнении, дешевого способа определения устойчивости организма животного к туберкулезу, позволяющего качественно и с минимальными трудозатратами проводить дифференциацию животных на восприимчивых и устойчивых к заболеванию туберкулезом по индексу агломерации лейкоцитов, определяемому путем постановки реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ).

Известно использование РАЛ для оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов (см. Федотов В.Б., Ласкавый В.Н. Сравнительное определение иммуногенности эшерихий методом агломерации лейкоцитов. - Бюл. ВИЭВ, вып.5. - М.: ВИЭВ. - 1985. - С.24-25). Данный способ направлен на решение задачи оценки иммуногенности эшерихий по определению К-антигена и не предназначен для дифференциации животных на восприимчивых и устойчивых к туберкулезу.

Данное изобретение основано на выявленной авторами неизвестной ранее закономерности изменения иммунной защиты животных от туберкулеза при отсутствии специфических антигенов микобактерий в организме животных, обусловленной способностью лейкоцитов крови интактных животных при взаимодействии с комплементом на стадии первичного иммунного ответа определять устойчивость или восприимчивость их к заражению туберкулезом. Авторами установлено, что изменение агрегативной способности лейкоцитов зависит от вида, возраста животных и сезона года.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии «изобретательского уровня» в заявляемом изобретении.

Способ осуществляется следующим образом.

К цитратной крови животного добавляют комплемент морской свинки и физиологический раствор для достижения необходимого объема. При этом соотношение комплемента морской свинки к физиологическому раствору и цитратной крови должно составлять 1:2:10. Смесь инкубируют, после чего наносят на предметные стекла и осуществляют фиксацию мазков метиловым спиртом в течение 5 минут (для мышей, морских свинок, кроликов, КРС, овец), или высушивание их в течение суток при комнатной температуре (для крыс). Затем мазки окрашивают 0,1%-ным раствором метиленовой сини.

Полученные мазки анализируют при увеличении х450. Для этого выбирают от 200 до 500 лейкоцитов, среди которых подсчитывают число склеенных. При этом агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Определяют индекс агломерации как отношение числа склеенных в общем объеме числа выбранных для анализа лейкоцитов.

Для доказательства восприимчивости или устойчивости к заболеванию туберкулезом лабораторных животных подвергали контрольному подкожному заражению вирулентной культурой M.bovis в концентрации 0,1 мг/мл.

Результаты оценивали по количеству павших животных, наличию характерных патолого-анатомических изменений и путем бактериологических исследований патматериала.

Пример 1.

В опыте было использовано 13 белых крыс, у которых брали кровь и стабилизировали ее гепарином.

В пробирки вносили по 0,2 мл цитратной крови животного, затем в каждую пробирку добавляли по 0,02 мл комплемента морской свинки и по 0,04 мл физиологического раствора для достижения необходимого объема (0,26 мл). Соотношение объемов указанных компонентов было подобрано экспериментальным путем и является оптимальным для постановки данной реакции по определению индекса агломерации лейкоцитов. Смесь выдерживали при 37°С в течение 1 часа, встряхивали и выдерживали при тех же температурных режимах еще в течение 1 часа. Смесь из пробирок наносили на предметные стекла и делали мазки. При этом мазки сушили при комнатной температуре в течение суток и окрашивали 0,1%-ным раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривали под микроскопом при увеличении х450 и выбирали для анализа 500 лейкоцитов. Агломерированными лейкоцитами считали те, которые склеивались в количестве не менее трех.

Среднее значение индекса агломерации лейкоцитов для крыс составило 1,0±0,3%.

Затем осуществляли контрольное заражение животных путем подкожного введения вирулентной культуры M.bovis в дозе 1 мл.

Диагностический убой животных осуществляли через 100 дней. По результатам патолого-анатомических исследований признаков заболевания туберкулезом не выявлено. Бактериологические исследования по изоляции M.bovis от крыс были отрицательными.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Пример 2.

Для доказательства того, что агрегативная способность лейкоцитов влияет на восприимчивость животных к заболеванию туберкулезом, были проведены опыты на крысах, которые были устойчивы к заболеванию (см. пример 1).

Для этого перед заражением культурой M.bovis 4 крысам вводили внутримышечно однократно либо туберкулин в дозе 0,5 мл, либо гипериммунную сыворотку в дозе 1 мл.

Исследования крови проводили спустя 7 дней. Среднее значение индекса агломерации лейкоцитов у крыс составило 9,9±4,5%.

После контрольного заражения вирулентной культурой M.bovis и убоя животных у всех крыс регистрировались характерные изменения во внутренних органах и была выделена культура M.bovis.

Такими образом, повышение индекса агломерации лейкоцитов является доказательством восприимчивости животных к заболеванию.

Пример 3.

Также на крысах проводили исследования, доказывающие, что агрегативная способность лейкоцитов, а соответственно и восприимчивость животных к заболеванию туберкулезом, меняется в зависимости от сезона года. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что животные зимой не подвержены заболеванию (индекс агломерации лейкоцитов составляет 1,0±0,3%), а в другие периоды года (весна, лето, осень), когда среднее значение индекса агломерации лейкоцитов составляет от 3,5% до 7,0%, крысы восприимчивы к туберкулезу.

Пример 4.

В опыте была подобрана группа аналогов мышей в количестве 33 головы, из которых у 21 мыши брали кровь для определения индекса агломерации лейкоцитов, а остальные 12 голов подвергались контрольному заражению культурой M.bovis в дозе 0,2 мл и последующему диагностическому убою спустя 100 дней.

Опыт по постановке реакции и определению индекса агломерации на 21 мыши проводили аналогично описанному в примере 1, за исключением технологии приготовления мазков. После нанесения мазков на предметные стекла их фиксировали метиловым спиртом в течение 5 минут, а затем также окрашивали 0,1%-ным раствором метиленовой сини.

Среднее значение индекса агломерации лейкоцитов для мышей составило 2,1±0,6%.

По результатам паталого-анатомических исследований 12 мышей, подвергшихся контрольному заражению, признаков заболевания туберкулезом не выявлено. Бактериологические исследования по изоляции M.bovis от мышей были отрицательными.

Пример 5

Проводились опыты на других лабораторных животных - морских свинках и кроликах. Было использовано 28 морских свинок, 30 голов взрослых кроликов и 10 голов молодняка до 2,5-недельного возраста. Опыт проводили аналогично описанному в примере 1, за исключением технологии приготовления мазков. Мазки готовили аналогично описанному в примере 4, т.е. с фиксацией их метиловым спиртом в течение 5 минут.

Результаты проведенных исследований и сведения о восприимчивости к заражению туберкулезом на кроликах и морских свинках приведены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что морские свинки имеют высокий индекс агломерации лейкоцитов (среднее значение его составляет 14,2±2,2). Их заражение сопровождалось проявлением клинических признаков туберкулеза. Результаты паталого-анатомических исследований подтвердили наличие характерных изменений во внутренних органах, а при проведении бактериологических исследований была выделена культура M.bovis. Таким образом, морские свинки, имеющие высокий индекс агломерации лейкоцитов, восприимчивы к заражению туберкулезом.

Результаты исследований кроликов показали, что молодняк устойчив к заражению (значение индекса 0,0±0,0%).

Значение индекса агломерации лейкоцитов взрослых кроликов колебалось в пределах от 0,0% до 10,0%, при этом:

- у 13,3% кроликов значение индекса составляло 0,0%;

- у 36,7% кроликов значение индекса было в пределах от 1,0% до 3,0%;

- 33,3% кроликов имели индекс агломерации от 3,1% до 7,0%;

- 17% животных имели индекс агломерации 7,1%-10,0%.

Для проверки на восприимчивость к заражению были взяты 2 кролика: один с индексом агломерации 1,5%, другой - 7,5%. Оба кролика заражали подкожно вирулентной культурой M.bovis в концентрации 0,1 мг/мл в дозе 1 мл.

Результаты патолого-анатомических исследований подтвердили наличие характерных изменений во внутренних органах у кролика с индексом агломерации 7,5% и отсутствие каких-либо изменений у кролика с индексом 1,5%.

В таблице 4 приведены результаты исследований на сельскохозяйственных животных - крупном рогатом скоте и овцах. Из данных таблицы видно, что телята и ягнята до 10 дневного возраста имеют низкое значение индекса агломерации, что позволяет делать вывод об их устойчивости к заражению туберкулезом.

Телята старше 2-х месяцев и ягнята старше 14 дней, а также взрослые животные имели индекс агломерации, соответственно, крупный рогатый скот - от 15,9±4,2 до 17,0±4,6; овцы - от 6,6±3,2 до 7,3±1,5, что позволяет сделать вывод о восприимчивости животных к заражению туберкулезом.

Таким образом, проведенные исследования доказывают, что значение индекса агломерации лейкоцитов позволяет осуществлять дифференциацию животных на восприимчивых или устойчивых к заболеванию туберкулезом, оценивая тем самым иммунное состояние организма животных до заражения.

Установленная закономерность позволит по-новому подойти к оценке эпизоотического состояния хозяйств, своевременно и правильно проводить комплекс оздоровительных мероприятий и специфическую профилактику туберкулеза.

Таблица 1
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ВЛИЯНИЮ ИНДЕКСА АГЛОМЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ БЕЛЫХ КРЫС НА ВОСПРИИМЧИВОСТЬ ИХ К ЗАРАЖЕНИЮ ТУБЕРКУЛЕЗОМВид животныхВозрастная группаКоличество животныхИндекс агломерации лейкоцитов, %Восприимчивость к подкожному заражениюКРЫСЫМолодняк110-Взрослые (зима)131,0±0,3-Взрослые (весна, лето, осень)145,4±1,1+Таблица 2
СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИНДЕКСА АГЛОМЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ И ВОСПРИИМЧИВОСТИ БЕЛЫХ КРЫС К ПОДКОЖНОМУ ЗАРАЖЕНИЮ М.BOVISВремя взятия кровиКоличество животныхИндекс агломерации лейкоцитов, %Наличие туберкулезных измененийЗима131,0±0,3-Весна65,6±1,5+Лето47,0±3,2+Осень43,5±1,2+

Таблица 3
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ВЛИЯНИЮ ИНДЕКСА АГЛОМЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОЛИКОВ И МОРСКИХ СВИНОК НА ВОСПРИИМЧИВОСТЬ ИХ К ЗАРАЖЕНИЮ ТУБЕРКУЛЕЗОМВид животныхВозрастная группаКоличество животныхИндекс агломерации лейкоцитов, %Восприимчивость к подкожному заражениюКроликиМолодняк (до 2,5 недель)100,0±0,0-Взрослые303,7±0,3+ -Морские свинкиВзрослые2814,2±2,2±Таблица 4
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЗМЕНЕНИЯ ИНДЕКСА АГЛОМЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУППВид животныхВозрастная группаКоличество животныхИндекс агломерации лейкоцитов, %КРСТелята до 10 дней100,9±0,5Телята 2 месяца815,9±4,2Взрослые717,0±4,6ОВЦЫЯгнята до 10 дней110,0±0,0Ягнята старше 14 дней116,6±3,2Взрослые97,3±1,5

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения состоит в том, что к цитратной крови животного добавляют комплемент морской свинки и физиологический раствор в соотношении комплемент морской свинки к физиологическому раствору и цитратной крови 1:2:10, смесь инкубируют, готовят мазки и окрашивают, затем определяют индекс агломерации лейкоцитов и при его значении до 2,5% определяют устойчивость организма животного к туберкулезу, а при значении более 2,5% восприимчивость к данному заболеванию. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего с высокой точностью оценить устойчивость организма животного к туберкулезу и провести дифференциацию различных групп животных по критерию устойчивости и восприимчивости к туберкулезу. 4 табл.

Способ определения устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови, отличающийся тем, что к цитратной крови животного добавляют комплемент морской свинки и физиологический раствор в соотношении комплемент морской свинки к физиологическому раствору и цитратной крови 1:2:10, смесь инкубируют, готовят мазки и окрашивают, затем определяют индекс агломерации лейкоцитов и при его значении до 2,5% делают вывод об устойчивости организма животного к туберкулезу, а при значении более 2,5% - о восприимчивости к данному заболеванию.