СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2011 года по МПК A61K39/00 C12N1/20 

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигенсодержащих фракций микобактериальных культур для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) сывороток крови.

При диагностике туберкулеза крупного рогатого скота основным, массовым и общепринятым методом является внутрикожная проба с применением ППД - туберкулина для млекопитающих. Одной из важных проблем при диагностике туберкулеза внутрикожной туберкулиновой пробой остается проблема неспецифических реакций на туберкулин. Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год.

В качестве прототипа изобретения мы рассматриваем способ получения микобактериального антигена (1), включающий удаление свободных липидов микобактериальных клеток ацетоном; разрушение клеточных стенок микобактерий путем обработки их диметилсульфоксидом (ДМСО); диализ полученного экстракта против 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,3) и выделение антигена осаждением компонентов клеточных стенок этанолом при -20°С.

Получение микобактериального антигена, обладающего высокой специфичностью, для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА сывороток крови.

Предлагаемый метод получения антигена отличается от прототипа способом экстрагирования специфических антигенсодержаших фракций микобактериальных культур.

Антиген ДМСО-м для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ИФА сывороток крови получали следующим образом.

Пример 1. Исходным сырьем для получения антигенов использовали убитые автоклавированием культуры микобактерий. Антигенсодержащую фракцию из микобактериальных клеток выделяли, предварительно отмыв их ацетоном от свободных липидов, обработкой клеток диметилсульфоксидом (ДМСО). При этом:

1. Навеску автоклавированной и высушенной массы микобактериальной культуры гомогенизировали и промывали физиологическим раствором в центрифужных пробирках при 3000 об/мин в течение 20 минут.

2. Микробные клетки заливали ацетоном из расчета 1:2 и инкубировали в термостате при 37°С в течение 3-х часов при периодическом перемешивании, после чего центрифугировали при названных выше условиях и ацетон сливали. Микобактерии подсушивали на воздухе.

3. Обработанные ацетоном микробные клетки заливали раствором диметилсульфоксида (коммерческий препарат - «Димексид»), подогретым до 37°С, из расчета 6 мл на 1 г бактерий и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 40 минут при 37°С. Микробные клетки отделяли центрифугированием в том же режиме, супернатант диализировали против дистиллированной воды в течение 3 суток при комнатной температуре.

4. Диализат центрифугировали при 6000 об/мин 20 минут. Супернатант оставляли в стеклянных пробирках (высотой не менее 10 см) на 3 месяца в холодильнике (+4°С). За время выдержки, видимо за счет естественных процессов коагуляции, в пробирке выпадает осадок.

5. Супернатант отделяли с помощью центрифугирования при выше названном режиме и концентрировали против силикагеля L 100/250 до желеобразного состояния. Полученную массу растворяли в 2 мл 0,01 М карбонатного буфера (pH 9.6), центрифугировали в том же режиме и использовали в качестве антигена (ДМСО-м антиген) при постановке реакций ИФА.

Пример 2. Получены антигены из клеток убитых автоклавированием M.Bovis, M.Avium, M.Scotochromogenes, M.Nonchromogenes и M.phlei. Методом диск-электорофореза по Laemmli (1970) (2) был изучен белковый спектр антигенов. Электрофорез проводили в пластинчатом 12,5% полиакриламидном геле (ПААГ). Результаты фракционирования представлены на чертеже: «Электрофорез антигенных препаратов по Laemmli", где треки 1-4, соответственно, ДМСО-м антигены из M.bovis, M.avium, M.non., M.scot. Треки: 5-туберкулин; 6-полный клеточный лизат M.tuberculosis; 7-белки-маркеры.

Из чертежа видно, что ДМСО-м антигены имеют четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 46,5-38,5 кД. В электрофореграммах окрашенных кумасси G 250 четко выраженных белковых фракций антигенов выявить не удалось.

Пример 3. Полученные антигены использовались в ИФА для исследования проб сывороток крови коров из различных хозяйств РТ. Результаты исследований представлены в таблице 1. Все пробы получены от животных, положительно реагирующих на туберкулин. Всего исследовано 335 проб. Иммуноферментный анализ выполняли в непрямом твердофазном варианте по методу, описанному Voller A., et., (1978) (3). Учет результатов реакции проводили на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), который определялся отношением величины оптической плотности (ОП) исследуемой пробы на величину ОП контрольной пробы. Положительно реагирующими считали пробы с К≧2 при разведении 1:200.

Для подтверждения данных, полученных в ИФА, и дифференциации туберкулиновых реакций был проведен ряд дополнительных диагностических мероприятий. Проводились исследования с применением противогельминтозных препаратов, использовали симультанную аллергическую пробу, пробу Коха, производился контрольный убой животных с последующим исследованием патматериала на выделение чистой культуры возбудителя.

Таблица 1 Результаты ИФА сывороток крови от положительно реагирующих на туберкулин коров против различных микобактериальных антигенов. Хозяйства Всего проб Кол-во проб, реагирующих с антигенами: M.bovis M.avium M.scot M.non M.phlei «Н-Кам.» Н-Кам. р-н 14 - - 1 2 6 «Южный» Бавлин. р-н 27 - - 10 4 - «Алга» Муслюм. р-н 10 - 1 - 7 - Буинский район:             «Память Ленина» 58 1 1 22 25 - КП «Волга» 54 22 9 2 16 3 «Искра» 28 15 11 3 10 1 «Алан» Тюлячин. р-н 3 - 3 - 1 - «Максабаш» Тюлячин. р-н 48 - - - - - «Чулпан» Кайбиц. р-н 5 - - - - - «Урожай» Кайбиц. р-н 5 - - 3 - - «Кр.Октябрь» Н.Шиш. р-н 47 26 5 2 8 - «АПХ им.Горького» К-Усть. р-н 4 4 - - - - «Кам-Усть.» К-усть. р-н 10 - - 3 4 1 «Зеленодол.» З-дол. р-н 13 - - - 5 - «Овощевод» З-дол. р-н 9 - - - 3 - ВСЕГО 335          

Как видно из результатов, представленных в таблице, большинство проб сывороток крови из хозяйств КП «Волга», «Искра» Буинского района, «Красный октябрь» Новошишминского района и «АПХ им. Горького» Камско-Устьинского района в ИФА показывают положительные результаты против M.bovis. Бактериологическими методами исследований путем выделения чистой культуры микобактерий в этих хозяйствах в дальнейшем был установлен туберкулез крупного рогатого скота, тем самым результаты ИФА сывороток крови полностью подтвердились.

В совхозе «Нижнекамский» Нижнекамского района реакция на ППД туберкулин была установлена у 14 (1,1%) коров. Пробы сывороток крови от этих коров были исследованы в ИФА, и в 6 пробах установлена положительная реакция против антигена M.phlei. Дальнейшая дифференциация неспецифической реакции на туберкулин у животных в этом хозяйстве симультанной аллергической пробой, реакция на аллерген КАМ обнаружена у 110 голов (8,9%). Коровы с реакциями кожной складки на ППД-туберкулин 3 мм и на КАМ 5 мм были подвергнуты диагностическому убою. В органах и лимфатических узлах изменения, характерные для туберкулеза, не были обнаружены, за исключением гиперплазии заглоточных и бронхиальных лимфоузлов. Проведенными лабораторными исследованиями биоматериала на выделение чистой культуры были изолированы кислотоустойчивые микобактерии с желто-оранжевого цвета колониями. Проведенной идентификацией они были отнесены в группу быстрорастущих атипичных микобактерии, что полностью подтверждает результаты иммуноферментного анализа.

Парааллергические реакции на туберкулин, обусловленные сенсибилизацией организма атипичными микобактериями, аналогичным способом были установлены и в совхозе «Камско-Устьинский» Камско-Устьинского района. В КП «Алан» Тюлячинского района причиной туберкулиновых реакций животных являлась зараженность микобактериями птичьего вида.

Сыворотки крови из хозяйств «Память Ленина» Буинского района, «Южный» Бавлинского района, «Овощевод» и «Зеленодольский» Зеленодольского района в иммуноферментном анализе в основном реагировали с антигенами скотохромогенной и нефотохромогенной группы микобактерии. Однако анализ дальнейших исследований и эпизоотической ситуации в хозяйствах показал, что в основе туберкулиновых реакций у животных лежит полиэтиологический фактор - гельминты, ретикуло-перекардиты и др. Проведение дегильментизации коров в данных хозяйствах, применение симультанной аллергической пробы показали, что туберкулиновые реакции крупного рогатого скота не связаны с туберкулезом. Послеубойным осмотром туши и внутренних органов убитых животных и исследованием биоматериала от них лабораторными методами выделить возбудителя туберкулеза также не удалось. В указанных хозяйствах крупный рогатый скот был поражен эхинококкозом и другими гельминтами. Однако при этом нужно отметить, что одна проба из КП «Память Ленина» положительно реагировала в ИФА против M.bovis.

Из КП «Максабаш» Тюлячинского района было исследовано 48 проб сывороток крови от положительно реагирующих на туберкулин коров. При этом ни одна проба не обнаруживала наличие микобактериальных антител в диагностируемых титрах. Дополнительными диагностическими тестами, включая исследования патматериала лабораторными методами, также не удалось выяснить причину ложноположительных туберкулиновых реакций у животных.

Источники информации

1. Хазипов Н.Э. Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / Н.З.Хазипов, А.А.Нуруллин, В.П.Коксин, Р.П.Тюрикова // Авторское свидетельство №1638853, 1990.

2. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T₄ // U.K.Laemmli // Nature. - London, 1970. - V.227. - P.680-685.

3. Voller A. Ensyme immunoassay with special reference to ELISA techniques / A.Voller, A.Bartlett, D.B.Bidwell // J. Clin. Path., 1978. - V.31. - P.507-520.

При диагностике туберкулеза крупного рогатого скота основным, массовым и общепринятым методом является внутрикожная проба с применением ППД - туберкулина для млекопитающих. Способ получения микобактериального антигена включает удаление свободных липидов микобактериальных клеток ацетоном; разрушение клеточных стенок микобактерий путем инкубирования в шестикратном объеме диметилсульфоксидом (ДМСО) при 37°С. Полученный супернатант подвергают диализу, который проводят в течение 3 суток против дистиллированной воды. После диализа супернатант выдерживают при плюс 4°С в течение 3 месяцев и отделяют от осадка. Проведенные производственные испытания показали высокую специфичность полученных (ДМСО-м) антигенов и возможность использования их в прижизненной дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сывороток крови. 1 ил., 1 табл.

Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, включающий обработку инактивированных автоклавированием микобактериальных клеток ацетоном, инкубирование в 6-кратном объеме диметилсульфоксида при температуре 37°С с последующим диализом супернатанта, отличающийся тем, что диализ проводят в течение 3 суток против дистиллированной воды, после диализа супернатант выдерживают при 4°С в течение 3 месяцев с последующим отделением от осадка.