Настоящее изобретение относится к новым вакцинным препаратам, способам их получения и их применению в медицине. В частности, настоящее изобретение относится к новым препаратам для лечения инфекций гепатита и к комбинированным защитным препаратам, заключающим компонент вакцины против гепатита.
Вирусный гепатит, вызываемый вирусами гепатита A, B, C, D и E, является очень распространенным вирусным заболеванием. Что касается вирусов B и C, то при их участии, в частности, во многих случаях развивается рак печени. Таким образом, создание эффективных вакцин имеет важнейшее значение, и несмотря на заметный успех в этой области, тем не менее остается задачей дня. Обзор современных вакцин против гепатита, включающий ряд ключевых ссылок можно найти в статье: 12-го мая 1990 г., 1142 ff (Проф. A.L. W. F. Eddleston) см. также "Вирусный гепатит и заболевания печени" (Vyas B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H. ред. Грун энд Стратон, Инк. (1984) и "Вирусный гепатит и заболевания печени" (Труды Международного симпозиума, 1990 г., ред. F.B. Hollinger, S.M. Lemon and H. Margolis публикация Вильямс энд Вилкинс.
В применяемом здесь значении выражение "антиген гепатита" относится к любому антигенному материалу, происходящему из вируса гепатита, который может быть использован для создания иммунности к вирусу у человека. Антиген гепатита может представлять собой, например, полипептид, синтезированный методами биотехнологии, или ослабленный штамм вируса гепатита, возможно дезактивированный известными способами. Изобретением охватываются все антигены гепатита, будь то гепатит A, B, C, D и E, примеры которых приводятся ниже.
Инфицирование вирусом гепатита A (ГАВ) является широко распространенной проблемой, но существуют и вакцины, которые могут быть использованы для массовой иммунизации, например, продукт под названием "Хаврикс" (Hawrix) (Смит Клайн Бичам Байолоджикалс), представляющий собой умерщвленную ослабленную вакцину, полученную из штамма НМ-175 ГАВ (см. "Дезактивированные вероятные вакцины против гепатита A", FE. Andre, A. Hepburn. E.D. Hondt. Prog. Med. Virol., т.37, стр. 72-95 (1990) и монографию о продукте Хаврикс", опубликованную компанией Смит Клайн Бичам Байолоджикалс (1991).
В работе Fleming и др. (местн. ссылка, стр. 56-71) сделан обзор клинических аспектов, вирусологии, иммунологии и эпидемиологии гепатита A, и рассматриваются пути создания вакцин против этой обычной вирусной инфекции.
В применяемом здесь значении выражение "ГАВ антиген" относится к любому антигену, способному стимулировать в человеческом организме нейтрализацию антител и ГАВ. ГАВ антиген может представлять собой живую ослабленную вирусную частицу или дезактированную ослабленную вирусную частицу, или может быть, например, ГАВ капсидой или ГАВ вирусным белком, который обычно получают методами биотехнологии.
Инфицирование вирусом гепатита B (ГАВ) является широко распространенной проблемой, но вакцины, которую можно было бы использовать для массовой иммунизации, не создано. В качестве примера можно указать созданный методами биотехнологии продукт под названием "Энжкрикс-Б "Engeris - B" (Смит-Клайн Бичам).
Получение поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) хорошо документировано. См. например: Harford и др., Develop. Biol. Standard 54, стр. 125 (1983), Greog и др., Biotechnology, 5, стр. 479 (1987), EP-A-O 226846, EP-A-O 299108 и ссылки в этих публикациях.
В применяемом здесь значении выражение "поверхностный антиген вируса гепатита B" или "HBsAg" заключает любой антиген HBsAg или его фрагмент, проявляющие антигенность поверхностного антигена ГВВ. Необходимо указать, что помимо последовательности из 226 аминокислот HBsAg антигена (см. Tiollais и др., Nature, 317, 489, (1985) и прилагаемые к работе ссылки) HBsAg, упоминаемый здесь, может при желании содержать всю или часть предпоследовательности, описанной в вышеприведенных ссылках и в EP-A-O 278940. В частности, HBsAg может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, включающей остатки 12 - 52, за которыми следуют остатки 133-145 и затем остатки 175 - 400 L-белка HBsAg относительно открытой рамки считывания вируса гепатита Bad серотипа (данный полипептид получил образование L*, см. EP 0414374)/ HBsAg в объеме изобретения может включать также пред S1-пред S2-S полипептид, описанный в EP 0198474 (Endotronics) или его аналоги, например, аналоги, описанные в EP 0304578 (Мс Cormick и Jones). Упоминаемый здесь HBsAg может также относится к мутантам, такому как например, "ускользнувший" мутант, раскрытый в WO 91/14703 или заявке на Европейский патент, N публикации 0511855 A1, особенно HBsAg, в котором замещение аминокислоты в положении 145 представлено заменой глицина на аргинин.
Обычно HBsAg имеет вид частицы. Частицы могут состоять, например, из одного только S-белка или это могут быть составные частицы, например (L*, S), где L* принимает вышеуказанные значения и S представляет S-белок HBsAg. Указанная частицы предпочтительно имеет ту форму, в которой она экспрессируется в дрожжах.
Вирус гепатита C (ГСВ) подробно рассмотрен в GB 2212511B и приведенных в нем ссылках. Указано, что вакцины могут быть получены из одного или нескольких иммуногенных полипептидов, происходящих из ГСВ и ДНК.
Вирус гепатита D обсуждается в издании "Вирусный гепатит и заболевания печени" (Симпозиум 1990 г. (см. выше)).
Вирус гепатита E (ГЕВ) подробно рассмотрен в WO 89/12462 и приведенных в нем ссылках. Пример вакцинного препарата включает рекомбинантный белок или белковую смесь, происходящую из ГЕВ, в фармакологически приемлемом адъюванте.
Хотя экспериментальные и промышленные вакцины гепатита, например: Хаврикс и Энгерикс-Б дают прекрасные результаты, общепризнано, что нужна оптимальная вакцина, которая не только бы стимулировала нейтрализующие антитела, но также возможно более эффективно стимулировала клеточную иммунность, передаваемую через Т-клетки. Кроме того существует необходимость в комбинированных вакцинах, содержащих гепатитный компонент, предназначенный стимулировать указанным путем клеточную иммунность. Настоящим изобретением указанные цели достигаются.
Настоящим изобретением дается вакцина, содержащая антиген гепатита в сочетании с 3-0-дезацилированным монофосфориллипидом A (сокращенно МФЛ) и приемлемым носителем.
3-0-Дезацилированный монофосфорил-липид A (или 3-дез-0-ацилированный монофосфорил-липид A) ранее обозначался, как ЗД-МФЛ иди д3-МФЛ для указания на то, что положение 3 восстанавливающего конца дез-0-ацилировано. Его получение см. GB 2220211 A. С химической точки зрения он представляет собой смесь 3-дезацилированного монофосфорил-липида A с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В данном описании обозначение ЗД-МФЛ (или д3-МФЛ) сокращено до МФЛ, поскольку ("MPL") - это зарегистрированное фирменное наименование для выпускаемого фирмой Риби Иммунокем., Монтана в качестве готового продукта 3-0-дезацилированного монофосфорил-липида A.
В GB 2220211 A упоминается, что эндотоксичность ранее применяемых энтеребактериальных липополисахаридов (ЛПС) уменьшается с сохранением при этом иммуногенных свойств. Однако в GB 2220211 эти открытия указаны всего лишь в связи с бактериальными (грамм-отрицательными) системами. Ко времени даты приоритета данного изобретения 3-дезацилированного монофосфорил-липида A в качестве адъюванта для вакцины, содержащей вирусный антиген гепатита, и не предполагалось.
Однако неожиданно было обнаружено, что вакцинные препараты изобретения, содержащие вирусные антигены гепатита, обладают особыми преимуществами, как будет показано ниже.
Их главное преимущество состоит в том, что вакцинные составы изобретения очень эффективны в создании защитной иммунности даже при очень низких дозах антигена.
Составы создают прекрасную защиту против первичной инфекции и с успехом стимулируют как специфичную гуморальную (нейтрализирующие антитела), так и передаваемую эффекторными клетками (D TH) иммунные реакции.
Еще одно важное преимущество состоит в том, что вакцинные препараты изобретения могут быть также использованы и в качестве лечебных вакцин.
Вышеуказанный МФЛ обычно присутствует в интервале концентраций 10 - 100 уг, предпочтительно 25 - 50 уг с одновременным присутствием антигена гепатита в интервале 2 - 50 уг на дозу.
Носителем может служить эмульсия типа масло в воде, липидный носитель или алюминат (соль алюминия).
Неядовитые эмульсии типа масло в воде предпочтительно содержат неядовитое масло, например, сквален и эмульгатор, например, Твин 80 в водной среде. Водная среда может представлять собой, например, фосфатный буферный солевой раствор.
Одно из воплощений изобретения представлено ГАВ антигеном (например, таким, как в Хавриксе) и в смеси с МФЛ и гидроксидом алюминия (см. ниже).
Еще одно воплощение изобретения, описанное ниже, представлено HBsAg S антигеном (например, таким, как в Энгериксе-Б) в смеси с МФЛ и гидроксидом алюминия.
Другое характерное воплощение изобретения представлено HBsAg антигеном в виде (L*, S) частиц (определение см. выше) в смеси с МФЛ и гидроксидом алюминия.
В вышеприведенных воплощениях эмульсия типа масло в воде может быть использована вместо алюмината.
Другие воплощения изобретения показаны в нижеследующих примерах.
Изобретением в своем дополнительном аспекте предлагается вакцинный препарат, описанный выше и предназначенный для применения в медицине, в частности, для лечения или профилактики инфицирования вирусом гепатита. В предпочтительном аспекте изобретения вакцина изобретения является вакциной, применимой для лечения текущей инфекции гепатита, особенно в случае людей, инфицированных гепатитом B и/или гепатитом C.
Еще одним предпочтительным аспектом изобретения является вакцинный препарат для лечения или профилактики инфицирования гепатитом и/или гепатитом B.
Предпочтительно заявленный вакцинный препарат содержит другие антигены с тем, чтобы быть эффективным для лечения или профилактики одной или нескольких бактериальных, вирусных или грибковых инфекций.
Соответственно изобретенный вакцинный препарат предпочтительно содержит хотя бы другой компонент, выбранный из негативных антигенов, для которого известна способность обеспечивать защиту против одного или нескольких следующих заболеваний: дифтерии, коклюша, столбняка, гемофильного гриппа в (Ггв) и полиомиелита.
Рекомендуется, чтобы изобретенная вакцина включала вышеохарактеризованный HBsAg.
Конкретные комбинированные вакцины, охватываемые объектом изобретения, включают ДСК (дифтерия-столбняк-коклюш)-гепатит B комбинированный вакцинный состав, Ггв-гепатит B вакцинный препарат, ДСК-Ггв-гепатит B вакцинный состав и ИВП (инактивированная вакцина полиомиелита(-ДСК-Ггв-гепатит B вакцинный состав.
Вышеприведенные комбинации могут с успехом включать компонент, обеспечивающий защиту против гепатита A, особенно умерщвленный ослабленный штамм, происходящий из НМ-175 штамма, такого, как присутствующий в Хавриксе.
Приемлемые для применения в таких вакцинах компоненты уже запускаются промышленностью, и касающиеся их подробности могут быть получены во Всемирной Организации Здравоохранения. К примеру, ИВП компонентом может служить инактивированная вакцина полиомиелита Сальк. Вакцина коклюша может состоять из целых клеток или бесклеточного продукта.
Вакцина против гепатита или комбинированная вакцина изобретения предпочтительно является педиатрической вакциной.
Вакцинные препараты в целом описаны в издании "Новые направления в создании вакцин", под ред. Voller и др., Университи Парк Пресс, Балтимор, Мерилэнд, США, 1978. Капсулирование в липосомы описано, например, Fullerton, патент США 4235877. Конъюгирование белков с макромолекулами, раскрыто, например: Likhite патент США, 4372945 и Armor и др., патент США 4474757.
Количество антигена в каждой дозе вакцины подбирают такое, чтобы это было количество, индуцирующее иммунозащитную реакцию без заметных нежелательных побочных эффектов типичных вакцин. Такое количество будет меняться в зависимости от применяемых специфичных иммуногенов. Как правило, ожидается, что каждая доза будет содержать 1 - 1000 кг общего иммуногена, предпочтительно 2 - 100 уг, наиболее предпочтительно 4 - 40 уг. Оптимальное количество для конкретной вакцины может быть выявлено стандартными исследованиями, включающими определение титров антител и других реакций у субъектов. После начальной вакцинации субъекты примерно через 4 недели могут быть подвергнуты бустерному инъектированию.
В своем дополнительном аспекте настоящим изобретением дается способ получения вакцины, обладающей эффективностью в предотвращении или лечении инфекции гепатита. Способ состоит в смешивании антигена гепатита (определение см. выше) с МФЛ и носителем.
Применяя данный способ, рекомендуется смешивать с HBsAg один или несколько дополнительных компонентов с получением комбинированной вакцины, предпочтительно применяемой в педиатрии.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение и его преимущества.
Пример 1. Вакцинный препарат против гепатита B.
МФЛ получен от фирмы Риби Иммунокем. Рисерч Инч. Гидроксид алюминия получен от фирмы Суперфос (Альгидрогель).
МФЛ суспендируют в зоне для инфекций по концентрации в интервале 0,2 - 1 мг/мл путем обработки ультразвуком на водяной бане, пока размер частиц не достигнет 80 - 500 нм при определении фотокорреляцией светорассеивания.
HBsAg (S - антиген такой, как в Энгериксе-Б, 1 - 20 уг) в фосфатном буферном солевом растворе (1 мг/мл) адсорбируют на 30 - 100 кг гидроксида алюминия (раствор с концентрацией Al3+ 10,38 мг/мл) перемешиванием один час при комнатной температуре. Затем к раствору добавляют 30 - 50 уг ДМФЛ (концентрация раствора 1 мг/мл). Объем и осмолярность устанавливают до 600 уг добавлением воды для инъекций и фосфатного буфера в 5х концентрации. Раствор выдерживают один час при комнатной температуре и хранят при 4oC до момента применения. Созревание состава происходит в ходе хранения. В результате получают 10 доз для инъекций, предназначенных для испытания на мышах.
Аналогичный состав может быть получен применением в качестве HB Ao компонента составного (L*,S) антигена, охарактеризованного выше.
Пример 2. Вакцинный препарат против гепатита A.
МФЛ получен от фирмы Риби Иммунокем. Рисерч Инк. Гидроксид алюминия получен от фирмы Суперфос (Альгидрогель).
ГАВ (360 - 22 ЭЕ на дозу) предварительно адсорбируют на 10% гидроксида алюминия до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Затем к раствору добавляют МФЛ (12,5 - 100 уг на дозу).
К раствору добавляют остальное количество гидроксида алюминия и оставляют на один час при комнатной температуре. Объем устанавливают добавлением фосфатного буфера (фосфат 10 мм, NaCl 150 мм) и конечный состав хранят при 4oC до момента применения.
Пример 3. Комбинированный вакцинный препарат: гепатит B + гепатит A.
HBsAg адсорбируют на 90% конечного количества гидроксида алюминия (0,5 мг/мл) и выдерживают в течение ночи при комнатной температуре. Устанавливают pH 6,2 и препарат оставляют на 14 дней при комнатной температуре для вызрезания.
Антиген гепатита A (360-22 ЭЕ на дозу) в виде инактивированного производного штамма HM-175 (как в Хавриксе) предварительно адсорбируют на 10% гидроксида алюминия с конечной концентрацией 0,5 мг/мл. Затем к раствору добавляют остальное количество гидроксида и перемещают один час при комнатной температуре.
После этого к составу HBsAg добавляют адсорбированный на гидроксиде алюминия ГАВ.
К раствору ГАВ-HBsAg добавляют МФЛ при конечной концентрации 12,5 - 100 уг на 1 мл дозы, объем доводят до конечного объема дозы и состав хранят при 4oC до момента применения.
Пример 4. Комбинированные вакцины, содержащие дополнительные антигены.
Комбинированные вакцины, содержащие ДСК, ИНП, Ггв, бесклеточных или полноклеточных антигеноз коклюша, получают добавлением одного или несколько целевых антигенов к составам, описанным в вышеприведенных примере 1, примере 2 или примере 3.
Пример 5. Повышение гуморальной иммунности и индуцирование передаваемой клетками иммунности иммунизацией мышей HBsAg в препаратах с гидроксидом алюминия и МФЛ
A. Влияние Al (OH)3+МФЛ на индуцирование анти-ГB антител
Мышей линии Balb/c иммунизируют подкожно или внутрикожно рекомбинантным HBsAg, адсорбированным на Al(OH)3 с МФЛ в качестве адъюванта. Мышей иммунизируют дважды HBsAg/Al/МФЛ составами и реакцию антител определяют после введения первой и второй доз. Общий Иг определяют методом ФИСА (EL ISA) или применением набора AUSAB (Аббот. Лаб., ИЛ), при этом особое внимание обращают на индуцирование антител ИгГ2а изотипа, поскольку данный изотип в основном индуцируется секретированием г-интерферона. Таким образом, индуцирование данного изотипа косвенно отражает активацию передаваемого клеткам иммутитета, а именно, активацию ThI.
Определяют отношение HBsAg/МФЛ, а также размер частиц МФЛ, поскольку суспендирование МФЛ может привести к частицам размером < 100 нм или > 500 нм.
Опыт 1. влияние дозы МФЛ (> 500 нм) на иммуногенность рек. HB Ao, адсорбированного на Al(OH)3
Группам из 10 самок Balb/c мышей инъектируют подкожно 2,5 мкг рек. Hb Ao, адсорбированного на 50 мкг Al++ ( в виде Al(OH)3), и возрастающими количествами МФЛ (3,1 - 50 мкг) с размером частиц > 500 нм. Мышей инъектируют дважды в объеме 100 мкл и с интервалом в 2 недели. Мышам пускают кровь через 2 недели после первой инъекции (частичное кровопускание) и через неделю после бустерной инъекции. Методом ФИСА определяют общий анти-ГВ ИгГ и специфичный ИгГ2а применением рек. HBsAg в качестве антигена захвата. Титры выражают в виде обратной величины разбавления, соответствующего 50% максимальной величины (разбавление в средней точке). Полученные результаты приведены в таблице 1. Результаты указывают на повышение как ИгГ, так и ИгГ2а с ростом доз МФЛ, особенно для доз в интервале 12,5 - 50 мкг. Это влияние показано и для первичной, и для вторичной реакций и особенно очевидно в случае ИгГ2а (вплоть до 20-ти кратного повышения), что косвенно указывает на секретирование г-интерферона, индуцируемое иммунизацией МФЛ.
Опыт II. Сравнение клинических лотов адсорбированного рек. HBsAg, содержащего или не содержащего МФЛ ( > 500 нм).
Получено 3 клинических лота рек. HBsAg, адсорбированного на Al(OH)3: лот DSAH16 не содержал МФЛ и служил в качестве контроля. Лоты DSAR501 и 502 получены одинаковым путем (20 мкг рек. HBsAg, адсорбированного на 0,5 мг Al в виде Al(OH)3, но содержат 50 мкг МФЛ (> 500 нм).
Три лота инъектируют подкожно в группах из 10 мышей (200 мкл, содержащих 2,5 мкг HBsAg, 100 мкг Al+++ и 6,25 мкг МФЛ) дважды с интервалом в 2 недели. Кровь у мышей берут на 14-ый день и неделю спустя после бустерной инъекции. Анти-ГВ антитела определяют либо для ИгГ, либо для ИгГ2а применением набора AUSAB или самодельного ФИСА. Полученные результаты приведены в таблице 2. Результаты показывают, что 2 недели спустя после первой инъекции два содержащих МФЛ лота индуцируют весьма существенную анти-ГВ реакцию (12,4 и 41,9 мИЕ/мл), в то время как несодержащий МФЛ лот индуцирует всего лишь маргинальную реакцию. (0,75 мИЕ/мл). Число мышей, показывающих результаты, также более высоко в случае МФЛ (9/10 и 9/10 против 1/10 в отсутствие МФЛ). Действие МФЛ подтверждено после бустерной инъекции, поскольку титры, полученные для лотов DSAR501 и 502, были в 6 раз выше, чем наблюдаемые без МФЛ.
Результаты показывают, что по меньшей мере для мышей МФЛ (> 500 нм) способен улучшить как кинетику анти-ГВ реакции, так и уровень анти-ГВ-реакции.
Полученные результаты определением специфичных ИгГ и ИгГ2а после иммунизации лотами DSAH16 (без МФЛ) и DSAR502 (с МФЛ): титр анти-ГБ ИгГ в 5 раз (первичная реакция) и 3 раза (вторичная реакция) выше в случае присутствия МФЛ.
Что касается ИгГ2а реакции, то действие МФЛ еще более поразительно, по крайней мере, после второй дозы, указывая на преимущественное индуцирование ИгГ2а. Это косвенно отражает активацию передаваемого клетками иммунитета (секретирование г-интерферона) содержащим МФЛ препаратом.
Опыт III. Действия дозы МФЛ (< 100 нм) на иммуногенность рек. HBsAg, адсорбированного на Al(OH)3
Поскольку МФЛ гораздо проще получить в воспроизводимом режиме в виде частиц размером < 100 нм, а не частиц размером > 500 нм, исследовано влияние частиц МФЛ размером < 100 нм на иммуногенность рек. HBsAg, предварительно адсорбированного на Al(OH)3.
Группы из 10 мышей (Balb/c, самки, возраст 7 недель) инъектируют подкожно 1 мкг рек. HBsAg, адсорбированного на 50 мкг Al+++ (в виде Al(OH)3), и в присутствии увеличивающихся количеств (3,1 - 25 мкг) МФЛ (< 100 нм). Мышей инъектируют дважды с интервалом в 2 недели и в объеме 200 мкл. Кровь у мышей берут через 2 недели после первой инъекции и неделю спустя после бустерной инъекции. Анти-ГВ реакцию выявляют методом ФИСА (общий Иг, ИгГ, ИгГ2а) на объединенной сыворотке. Титры выражают в виде разбавлений в средних точках (обратная величина разбавления, дающего 50% от наивысших величин). Полученные результаты показывают, что уже 3,1 мкг МФЛ индуцируют сильное повышение реакции, как в случае первичной реакции, так и в случае вторичной реакции. Максимум реакции наблюдается при дозе 6,25 мкг, после чего понижается и становится равной реакция без МФЛ при более высоких применяемых дозах МФЛ (25 мкг). Характер реакции антител аналогичен для ИгГ, ИгГ2а и общего Иг. В этом отличие от результатов, полученных для МФЛ с большим размером частиц (> 500 нм) (см. опыт I), и это наталкивает на мысль о том, что МФЛ с меньшим размером частиц (< 100 нм) более эффективен, чем МФЛ с более крупными частицами (> 500 нм) (по меньшей мере для гуморального иммунитета), поскольку для достижения максимального эффекта требуется меньше МФЛ. Наивысшая активность МФД с меньшим размером частиц подтверждена в нескольких экспериментах.
Как показано для частиц МФЛ большего размера (> 500 нм), действие МФЛ в качестве адъюванта более эффективно для ИгГ2а, чем для общего Иг и ИгГ. При максимальном проявлении вторичной реакции (6,25 мкг МФЛ) наблюдается 25-ти кратное повышение ИгГ2а, в то время как повышение или ИгГ и для общего Иг составляет соответственно 7,6 и 4,3 раза.
B. Индуцирование передаваемого клетками иммунитета рек. HBsAg, адсорбированным на Al(OH)3. Влияние МФЛ.
Если гуморальный иммунитет достаточен для защиты от гепатита B, то индуцирование передаваемого клетками иммунитета (CTL, ThI) может быть особо важно для лечения болезни.
Поэтому требуются новые составы для лечебных вакцин, поскольку Al(OH)3 способен улучшить гуморальный иммунитет, но не передаваемый через клетки иммунитет.
Нами исследовано влияние МФЛ на индуцирование ThI- клеток, способных секретировать ИЛ-2 и г-(т. е. гамма) интерферон у Balb/c мышей, иммунизированных адсорбированном на Al(OH)3 рек. HBsAg.
Опыт I. Влияние МФЛ (< 500 нм) на индуцирование ThI клеток после иммунизации Balb/c мышей адсорбированным на Al(OH)3 HBsAg.
Группу из Balb/c мышей (самки, возраст 5 недель) иммунизируют инъекцией в подошвы каждой лапки 30 мкл, содержащей 10 мкг HBsAg, 15 мкг Al+++ (в виде Al(OH)3) и 15 мкг МФЛ. Контрольных мышей инъектируют аналогично тем же количеством рек. HBsAg, смешанным либо с ПАФ (положительный контроль), либо адсорбированным на Al(OH)3 без МФЛ (отрицательный контроль).
Через шесть дней после иммунизации мышей убивают и у них удаляют подколенные лимфатические узлы. Клетки лимфатических узлов (КЛУ, 2105 клеток/мл) культивируют различное время (от 24 часов до 74 часов) в RPMI-среде с добавкой 1% отрицательной мышиной сыворотки и содержащей 5 мкг/мл рек. HBsAg. После прекращения культивирования определяют количество секретируемых в среду ИЛ-2, ИНФ-г и ИЛ-4. ИЛ-2 выявляют по его способности стимулировать пролиферацию (устанавливают введением 3Н-тимидина) ИЛ-2-зависимой CTL-линии (VDA2 клетки) и титр выражают в виде индекса стимулирования (ИС = количеству 3Н-тимидина, введенного в стимулированные клетки/количество 3Н-тимидина, введенного в нестимулированные клетки). Количества ИЛ-4 и ИНФ-г определяют промышленных ФИСА наборов (Холланд Биотекнолоджи для ИФН-г и Эндоген для ИЛ-4). Титры выражают в пг ИНФ-г/мл.
Полученные результаты показывают, что ИЛ-2, ИЛ-4 или ИНФ-г не секретируются в заметных количествах КЛУ от мышей, иммунизированных адсорбированным на Al(OH)3 HBsAg. Напротив, отмечен высокий уровень секреции ИЛ-2 (ИС = 38 за 48 ч) и значительные количества ИНФ г КЛУ от мышей, иммунизированных HBsAg, адсорбированным на Al(OH)3 + МФЛ. Секретирование аналогично (ИНФ-г) или выше (ИЛ-2) в сравнении с наблюдаемым для мышей, иммунизированных HBsAg + ПАФ, и секретирование in vitro происходит раньше.
Никакого ИЛ-4 не обнаружено после иммунизации HBsAg, адсорбированным на Al(OH)3, даже в присутствии МФЛ.
Такой характер секретирования указывает, что специфичные ThI-клетки (ИЛ-2, ИНФ-г) индуцируются иммунизацией адсорбированным HBsAg в присутствии МФЛ, но не в отсутствие МФЛ. Тем не менее в данных условиях иммунизации никаких Th2-клеток (ИЛ-4) не обнаружено.
ОПЫТ II. Влияние дозы МФЛ (< 100 нм) на индуцирование ThI- клеток после иммунизации Balb/c мышей адсорбированным на Al(OH)3 рек.HBsAg
Группы из 5 Balb/c мышей иммунизируют инъекции в подошвы каждой из 2 лапок 30 мкл, содержащих 10 мкг рек HBsAg, адсорбированного на 15 мкг Al+++ (в виде Al(OH)3), и возрастающие количества МФЛ (100 нм, 0 - 15 мкг).
Через шесть дней после инъектирования и подколенные клетки лимфатических узлов (КЛУ) культивируют в концентрации 2106 клеток/мл в RPMI-среде с добавкой 1% отрицательной мышиной сыворотки. Культивирование ведут различное время (от 24 часов до 96 часов) в присутствии 5 мкг/мл рек. HBsAg.
Секретирование ИЛ-2 определяют стимулированием пролиферации VDA2 клеток и концентрацию ИЛ-2 выражают в виде индекса стимулирования (ИС); секретирование ИНФ-г определяют с помощью промышленного набора и выражают в пг/мл.
Обнаружено, что секретирование ИЛ-2 резко возрастает при самой низкой дозе МФЛ (7,5 мкг), и максимальный эффект достигается при 15 мкг МФЛ.
Секретирование ИЛ-2 в целом более важно через 24 ч, чем через 48 ч или 72 ч.
Секретирование ИНФ-г не происходит, если HBsAg адсорбирован на Al(OH)3 в отсутствие МФЛ. Небольшая доза МФЛ (7,5 мкг) индуцирует секретирование ИНФ-г, и в этом случае максимальный эффект достигается при 15 мкг МФЛ. В отличие от результатов, наблюдаемых для ИЛ-2, секретирование ИНФ-г замедлено и возрастает со временем вплоть до 96 часов.
Суммируя полученные данные, можно сказать, что МФЛ (100 нм) является эффективным индуктором Th1 клеток в сочетании с HBsAg, адсорбированным на Al(OH)3.
C. Заключение.
Исследовано действие препарата, содержащего HBsAg, адсорбированного на Al(OH)3, и МФЛ, как гуморальный, так и передаваемый клетками иммунитет у Balb/c мышей. Результаты показывают, что МФЛ явно улучшает кинетику анти-ГВ реакции, поскольку после как первичной, так и вторичной иммунизации наблюдается гораздо больше анти-ГВ антител. Меняется также и качество антител и наблюдается преимущественное индуцирование ИгГ2а, косвенно отражающего секретирование ИНФ-г, т.е. индуцирование передаваемого клетками иммунитета.
Прямое исследование индуцирования Th1 клеток составами, содержащими HBsAg, Al(OH)3 и МФЛ, четко указывает на то, что МФЛ является эффективным индуктором TT1 клеток, секретирующих и ИЛ-2, и ИНФ-г. Таким образом, составы такого типа имеют важное значение для создания лечебных вакцин.
Что касается таблиц, показывающих результаты вышеописанных экспериментов, см. нижеследующие таблицы 1 - 6.
Пример 6. Клиническое применение МФЛ в качестве адъюванта к HBsAg.
Предварительные результаты.
Исследование МФЛ-ГВВ-002 (продолжается).
Данным исследованием HBsAg сравнивается с Энгериксом-Б в экспериментах на молодых здоровых добровольцах.
Иммуногенность: величина реакции анти-ГВ антител.
Кинетика реакции анти-ГВ антител.
Передаваемый клетками иммунитет, индуцируемый обеими вакцинами (in vitro и in vivo).
Реактогенность, токсикология и безопасность.
Материалы и методы.
а) Вакцины (табл.A).
b) Контингент.
* Здоровые взрослые добровольцы в возрасте 18 - 30 лет.
* Добровольцы должны быть отрицательными на маркеты ГВВ и никогда прежде не вакцинированными против гепатита B.
c) Методика.
Дважды слепой неупорядоченный метод исследования.
План вакцинации: 0, 1, 6 месяцев.
Наблюдение до 12-го месяца.
Образцы крови.
Тест на анти-ГВ антитела проводят до, 7 дней, 15 дней, 30 дней после каждой вакцинации.
Биохимию и гематологические параметры определяют до и 2 дня спустя после каждой дозы.
Кровь на определения передаваемого клетками иммунитета берут до и после курса первичной вакцинации и бустерной инъекции.
Реактогенность.
Необходимо регистрировать в карте вакцинации субъектов появление местных и общих признаков и симптомов в день вакцинации и в течение 7 последующих дней.
Результаты.
Результаты исследований вплоть до 2 месяцев после второй дозы приводятся ниже.
Контингент.
Всего 29 субъектов дали свое информированное согласие, но только 27 (15 мужчин и 12 женщин) отвечали предъявляемым требованиям. 15 субъектов образовали группу I и 12 - группу II.
Безопасность.
Никаких серьезных нежелательных проявлений не отмечено, и ни один из субъектов не был выведен или должен быть выведен из эксперимента. Никаких клинически значимых изменений в гематологических или биохимических параметрах не наблюдалось. Частота и тяжесть общих и местных признаков и симптомов была одинаковой в обеих группах.
Иммуногенность.
Титры анти-ГВ антител определялись вплоть до 90-го дня после введения второй дозы. Степень сероконверсии (СС в %) определяется, как появление антител у первоначально сероотрицательных субъектов.
Степень сероконверсии определяется, как процент субъектов с титрами защитных анти-ГВ антител. Очевидно, если не наблюдается четкой разницы в величине реакции антител с ГЗТ, сравнимы для двух групп, в этом случае кинетика реакции будет различной, и в этом явное преимущество содержащей МФЛ вакцины. В самом деле, через 7 дней после введения второй дозы 93% и 80% субъектов, вакцинированных МФЛ-ГВВ, оказались серопревращенными и соответственно защищенными. В этом случае степень сероконверсии составляет 95%. Для сравнения степень сероконверсии в группе, вакцинированной Энгериксом-Б, составляет 58%. Эта разница сохраняется и через два месяца после введения второй дозы и особенно очевидно в случае степени сероконверсии. В указанный момент времени все субъекта, вакцинированные МФЛ ГВВ, были защищены в сравнении с 58% субъектов, вакцинированных вакциной с алюминатом в качестве адъюванта.
Исследование МФЛ-ГВВ-003 (продолжается).
Материалы и методы аналогичны тем, которые применялись при исследовании СФЛ-ГВВ-002 (см. выше). Но схема вакцинации была другой (табл.B).
Результаты.
Хотя кинетика реакций анти-ГВ антител не изучалась столь же тщательно, как в предыдущем исследовании, в настоящем исследовании, видимо, можно сделать те же выводы. Субъекты, вакцинированные вакциной с МФЛ в качестве адъюванта, дают лучшую реакцию по сравнению с субъектами, инъектированными вакциной без МФЛ. Все, кроме одного субъекта (95,8%) имеют защитные титры через месяц после введения второй дозы МФЛ-ГВВ в сравнении с 72,7% в группе, вакцинированной Энгериксом-Б. Более того, в отличие от предыдущего исследования МФЛ-ГВВ вакцина, видимо, индуцирует более высокие титры антитела по сравнению с Энгериксом-Б (214 и 72 мИЕ/мл соответственно). Возможно важную роль играет увеличение интервала между двумя дозами.
Выводы.
В этих двух исследованиях на здоровых взрослых добровольцах испытана вакцина против гепатита B (содержит HBsAg такой, как в Энгериксе-Б, и алюминат) с МФЛ в качестве адъюванта, которая сравнивалась с Энгериксом-Б (HBsAgS - антиген в смеси с алюминатом) с применением различных схем вакцинации. Если, видимо, не существует разницы в иммуногенности между двумя вакцинами после одной дозы, то МФЛ-ГВВ вакцина показывает явное преимущество после второй дозы, особенно с точки зрения более высокого процента субъектов с титрами защитного антитела. ГЗТ также более высоко в этой группе, если интервал между двумя дозами два месяца, а не один.
Это могло бы указывать на лучшее примирование реакции при добавлении к антигену МФЛ. Поэтому такая вакцина могла бы иметь большую ценность для субъектов с замедленной или низкой реакцией на вакцинацию против гепатита B, например, людей старшего возраста или иммунокомпромиссных субъектов.
Что касается таблиц, в которых приведены результаты вышеописанных экспериментов, см. нижеследующие таблицы 7 и 8.
Пример 7. Гепатит A, исследования МФЛ на мышах.
Следующий эксперимент показывает, что добавление МФЛ к вакцине против гепатита A оказывает благоприятное воздействие. Это показано более низкими значениями ЭД 50 (доза, выраженная в ФИСА единицах (ФЕ), вызывающая серологическую реакцию у 50% инъектированных животных).
Метод.
Мышей линии NMRI инъектируют I дозой экспериментальной вакцины против ГАВ, содержащей 360, 120, 40, 13,3 ФЕ/дозу в сочетании с различными концентрациями МФЛ (0, 1,5, 6, 12,5 мкг/дозу). Через 20 дней после инокуляции берут образцы крови и сыворотку анализируют в HAVAB анализе (с применением 20%-го отброса). Подсчитывают ЭД50 (выраженную в ФЕ), которая соответствует дозе, индуцирующей серологическую реакцию у 50% испытуемых животных.
Результаты.
Результаты суммированы в нижеследующей таблице С. Вакцина, не содержащая МВЛ, имела ЭД50 в 123,7, в то время как вакцина, содержащая 1,5 мкг/мл МФЛ, имела значение ЭД50 в 154. Более высокие дозы МФЛ оказывают благоприятное воздействие (ЭД50 наблюдались при более низких значениях ФЕ). При 12,5 мкг МФЛ на дозу наблюдаемая ЭД50 составляет 47,1 ФЕ.
Выводы.
Комбинация соответствующего количества МФД с вакциной против ГАВ улучшает действие данной вакцины при испытании ее эффективности на мышах (0 - 6 месяцев).
Изобретение относится к медицине. Предложен вакцинный препарат для лечения или профилактики инфекции гепатита, особенно гепатита В, состоящий из антигена гепатита и приемлемого носителя, например алюмината с 3-0-дезацилированным монофосфорил-липидом А. Описаны также комбинированные вакцины, включающие указанный вакцинный препарат, и способ профилактики гепатита. Вакцинный препарат эффективен в создании защитной реакции даже при очень низких дозах антигена. 2 c. и 12 з.п ф-лы, 11 табл.
| Адъювант | 1975 |
|
SU596241A1 |
| SU 1297285 A, 27.05.96 | |||
| Способ иммунокоррекции при затяжных формах гепатита | 1989 |
|
SU1678373A1 |
| СПОСОБ ВЫПЛАВКИ СТАЛИ В ЭЛЕКТРОДУГОВОЙ ПЕЧИ | 2001 |
|
RU2220211C2 |
