КОМПЛЕКСНАЯ ИНДИКАТОРНАЯ СРЕДА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА LISTERIA Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к бактериологическому контролю за инфицированностью пищевых продуктов, а также животных и человека.

Начиная с конца 80-х годов и до настоящего времени в ряде стран Европы и Америки, были отмечены многочисленные вспышки листериоза у людей, связанные с употреблением в пищу инфицированных пищевых продуктов. Однако в нашей стране процент выявления больных листериозом остается сравнительно невысоким, что можно объяснить несовершенством лабораторной диагностики, а также широким полиморфизмом листериозного микроба. В связи с этим проблема дифференциации листериозного микроба, выделенного из пищевых продуктов, а также от животных и человека, в настоящее время является достаточно актуальной, несмотря на то что существует достаточное количество питательных сред для диагностики листерий.

Известно использование питательной среды УСС (Универсальный скошенный столбик Серова (Серов Г.Д. - Лаб. дело. - 1978. - №11. - с.15-18)) для дифференциации листерий от других сопутствующих им микроорганизмов (Е.А. Зайцева, В.Е. Терехова "Эколого-эпидемические особенности Listeria monocytogenes в Приморском крае" // Тихоокеанский мед. журнал. Спец. выпуск. - 2001. - №2. - С.29-31).

Недостатком данной питательной среды явилось то, что ряд сопутствующих микроорганизмов (Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Pseudomonadae spp.), как и листерий, изменяют цвет среды в лимонно-желтый цвет за счет ферментирования глюкозы, лактозы, сахарозы до кислоты без образования газа, а также то, что в состав среды входит много компонентов, в которых нет необходимости для дифференциации листерий и что увеличивает стоимость самой среды.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является комплексная индикаторная среда для быстрой дифференциации возбудителей заболеваний с природной очаговостью с использованием комплексного индикатора, предложенная Л.А. Тимофеевой (1957) (А.А. Триполитова с соавт. «Листериоз», 1965 г.), в состав которой входит: 1% лактозы, 1% мочевины, 2% комплексного индикатора (на 100 мл индикатора Андреде - 0.4 мг бромтимолового синего). Среда скашивается в пробирке так, чтобы оставался столбик. Цвет среды зеленый. При росте листерий он и в столбике, и в скошенном участке переходит в красно-оранжевый.

Недостатком данной питательной среды является ее низкая разрешающая способность, т.к. отношение листерий к лактозе вариабильно, часть штаммов листерий не разлагают лактозу, у других - ферментация лактозы идет замедленно (в более поздние сроки), а также за счет недостатка питания для листериозного микроба.

Задачей данного изобретения является увеличение разрешающей способности питательной среды для дифференциации листерий от других микроорганизмов, расширение ассортимента питательных сред для дифференциации листерий.

Поставленная задача решается тем, что комплексная индикаторная среда для экспресс-дифференциации листерий, содержащая агар, мочевину, источник углеводов, комплексный индикатор и воду, согласно изобретению дополнительно содержит дрожжевой экстракт и пептон, а в качестве углеводов используют глюкозу при следующем соотношении компонентов в г/л:

Агар32,0-35,0 гДрожжевой экстракт6,0-10,0 гГлюкоза1,0-5,0 гМочевина10,0 гПептон5,0-10,0 гКомплексный индикатор2,0 млДистиллированная водаостальноерН среды7,0-7,1

Предлагаемое техническое решение соответствует критериям «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленное применение».

Новым является то, что заявляемая питательная среда дополнительно содержит дрожжевой экстракт, пептон и глюкозу. При этом дрожжевой экстракт, присутствующий в питательной среде, является источником витаминов группы В, пептон - источник дополнительного белкового питания, а глюкоза одновременно работает как источник углеводов, так и в сочетании с комбинированным индикатором как биохимический тест. Использование глюкозы в качестве биохимического теста позволяет значительно ускорить процесс дифференциации листерий, кроме того, по отношению к глюкозе листерии отличаются определенным и постоянным поведением.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», ввиду того что впервые для дифференциации листерий от других микроорганизмов используется глюкоза не только как поставщик углерода, но и как биохимический тест - за счет ферментации ее до кислоты без газа происходит изменение цвета комплексной индикаторной среды (индикатор Андреде и бромтимоловый синий) из зеленого до красно-оранжевого, что характерно только при росте листерий.

Заявленное техническое решение «промышленно применимо», так как заявляемая питательная среда проста в приготовлении и доступна практическим лабораториям, занимающимся диагностикой листериоза.

Заявляемые количественные параметры являются существенными признаками, и отклонение от них не позволяет решить поставленной перед изобретением задачи.

Для приготовления 1 л комплексной индикаторной питательной среды берут 32.0-35.0 г сухого питательного агара (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), 6.0-10.0 г дрожжевого экстракта, 1.0-5.0 г глюкозы, 10 г мочевины, 5 г пептона, 2,0 мл комплексного индикатора и добавляют дистиллированной воды до 1 л. Комплексный индикатор готовят отдельно: к 100 мл индикатора Андреде добавляют 0,4 мг бромтимолового синего.

Смесь тщательно перемешивают, доводят до кипения, варят на медленном огне 2-3 минуты рН среды 7,0-7,1. Среду разливают по пробиркам по 7 мл, стерилизуют текучим паром в течение 30 минут. Среда скашивается в пробирках так, чтобы оставался столбик. Цвет застывшей среды зеленый.

Использование этой питательной среды позволяет сократить сроки дифференциации подозрительных колоний рода Listeria, а также расширить ассортимент индикаторных питательных сред для дифференциации листерий.

Примеры конкретного выполнения.

Пример №1.

Для приготовления 1 л питательной индикаторной среды берут 32.0 г сухого питательного агара, 5.0 г пептона, 10.0 г мочевины, 2,0 мл комплексного индикатора и остальное - дистиллированная вода до 1 л. Смесь тщательно перемешивают, доводят до кипения, варят на медленном огне 2-3 минуты. рН среды 7,0-7,1. Среду разливают по пробиркам по 7 мл, стерилизуют текучим паром в течение 30 минут. Среда скашивается в пробирках так, чтобы оставался столбик. Цвет застывшей среды зеленый.

Комплексный индикатор готовят отдельно: к 100 мл индикатора Андреде добавляют 0,4 мг бромтимолового синего.

Пример №2.

Питательную среду готовят аналогично примеру 1, только используют 35.0 г сухого питательного агара, 10.0 г дрожжевого экстракта, 5.0 г глюкозы.

Пример №3.

Питательную среду готовят аналогично примеру 1, только используют 33.0 г сухого питательного агара, 8.0 г дрожжевого экстракта, 3.0 г глюкозы.

На приготовленную питательную среду высевали уколом и «лесенкой» типовые штаммы листерий - Listeria monocytogenes (сероварианты 1/2а, 1/2b, 4b), L. innocua, L. ivanovii, L. zeeligeri, L. welshimeri, L.grayi. Пробирки помещали в термостат на 24-48 часов при температуре 37°С. Через 24-48 часов цвет среды в скошенном индикаторном столбике при росте листерий и в столбике, и в скошенной поверхности изменялся на красно-оранжевый. Другие микроорганизмы давали иные соотношения цветов в разных участках среды.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой среды представлены в таблице и на фотографиях (1-4).

Таким образом, по сравнению с прототипом (А.А. Триполитова с соавт. «Листериоз», 1965 г.) предложенная индикаторная среда обладает более высокими ростовыми факторами и дифференциально-диагностическими свойствами.

Технико-диагностическая эффективность данного предложения заключается в следующем:

- повышается диагностическая эффективность и возможность дифференциации листерий от других микроорганизмов в сравнительно короткие сроки с минимальными затратами.

Это дает возможность ускорить процент обнаружения листериоза человека и животных, а также обнаружить возбудителя при контаминации ими продуктов питания.

ТаблицаИзменение цвета индикаторной комплексной среды для дифференциации листерий при росте различных видов микробовМикроорганизмы (серовариант)СтолбикКосякГазРост на косякеListeria monocytogenes NCTC 10527 (4b)красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria monocytogenes CLIP 75936 (серовариант 1/2а)красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria monocytogenes SLCC 2755 (серовариант 1/2b)красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria ivanovii NCTC 11846 (5 серовариант)красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria innocua SLCC 3379красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria seeligeri SLCC 5921красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria welshimeriкрасно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийListeria grayi 17красно-оранжевыйкрасно-оранжевый-ХорошийEscherihia coliоранжевыйжелто-оранжевый+ХорошийStaphylococcus aureusгрязно-зеленыйголубовато-зеленый-ХорошийYersinia pseudotuberculosis 222зелено-голубойзелено-голубой-ХорошийYersinia enterocolitica 2012зелено-голубойзелено-голубой-ХорошийShigella flexneriоранжевыйзеленый-ХорошийSalmonella enteritidisжелтыйзеленый+ХорошийSalmonella typhimureum 5369желтыйзеленый+ХорошийSalmonella paratyphiжелтыйзеленый+Хороший

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в бактериологическом контроле за инфицированностью пищевых продуктов, а также животных и человека. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria содержит: агар - 32,0-35,0 г, дрожжевой экстракт - 6,0-10,0 г, глюкоза - 1,0-5,0 г, мочевина - 10,0 г, пептон - 5,0-10,0 г, комплексный индикатор - 2,0 мл, дистиллированная вода - остальное. Изобретение обеспечивает увеличение разрешающей способности индикаторной среды для дифференциации листерий от других микроорганизмов, расширяет ассортимент питательных сред для дифференциации листерий. 4 фото, 1 табл.

Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода листерий, содержащая агар, мочевину, источник углеводов, комплексный индикатор и воду, отличающаяся тем, что комплексная индикаторная среда дополнительно содержит дрожжевой экстракт и пептон, а в качестве углеводов используют глюкозу при следующем соотношении компонентов, г/л:

агар32,0-35,0дрожжевой экстракт6,0-10,0глюкоза1,0-5,0мочевина10,0пептон5,0-10,0комплексный индикатор2,0 млдистиллированная вода остальное