ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЦИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У БАКТЕРИЙ РОДА Listeria Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии и может быть использовано как в научно-исследовательской, так и в практической работе для санитарно-эпидемиологического и ветеринарного контроля зараженности продуктов питания, объектов окружающей среды в центрах Госсанэпиднадзора, пищевой промышленности.

Многочисленные вспышки заболевания листериозом в ряде стран мира, связанные с употреблением в пищу инфицированных листериями продуктов питания, а также частота носительства возбудителя у людей и его широкое распространение в окружающей среде требуют на современном этапе разработки новых подходов к их типированию с целью быстрого выявления наиболее значимых, вирулентных штаммов листерий в инфекционной патологии. В настоящее время для дифференциации патогенного вида L.monocytogenes (согласно ГОСТ Р 51921-2002) используют питательную среду ГРМ №1 (г.Оболенск), содержащей 10% эмульсии желтка куриного яйца с (или без) добавлением 0,5% активированного угля, на которой определяют гидролиз лецитина. L.monocytogenes показывает гидролитическую активность в отношении лецитина только в присутствии активированного угля в течение 48 ч при инкубировании культур при 37°С. Эта питательная среда состоит из белковой основы, где используют панкреатический гидролизат рыбной муки, панкреатический гидролизат казеина, а также дрожжей и глюкозы.

Среда ГРМ №1 (г.Оболенск) (г/л):

Панкреатический гидролизат рыбной муки - 15,0 Панкреатический гидролизат казеина - 10,0 Экстракт пекарных дрожжей - 2,0 Натрий хлористый - 3,5 Глюкоза - 1,0 Агар 10,0±2,0

рН 7,4±0,2

Дополнительно вносят (г/л):

50 мл 10% эмульсию яичного желтка

0,5% активированного угля.

Основным недостатком данной среды является ее низкая чувствительность и длительность процедуры - лецитиназную активность L.monocytogenes проявляет лишь через 24-48 часов. Как показали наши исследования, не всегда L.monocytogenes проявляет лецитиназную активность на данной среде (Зайцева Е.А. «Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes»: дис. докт. мед. наук. - М., 2010. 299 с.). Другим недостатком этой питательной среды является трудоемкость приготовления белковой основы, в качестве которой используют белковые гидролизаты.

Задача, решаемая данным изобретением, - сокращение сроков выявления лицитиазной активности листерий.

Поставленная задача решается путем приготовления питательной среды для определения лецитиназной активности у листерий, содержащей белковую основу, микробиологический агар, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, глюкозу, активированный уголь, эмульсию яичного желтка, дистиллированную воду, согласно изобретению питательная среда в качестве белковой основы содержит сухой концентрат отвара молок лососевых рыб при следующем соотношении компонентов, г /л:

Сухой концентрат отвара молок лососевых рыб 2,7-3,2 Микробиологический агар 10,0±2,0 Хлорид натрия 5,0 Глюкоза 1,0 Дрожжевой экстракт 4,0-10,0 Активированный уголь (порошок) 2,5-5,0 Дистиллированная вода остальное

рН среды 7,2-7,4,

в которую, после стерилизации, добавлена 30% эмульсия яичного желтка из расчета 50 мл/л стерильной среды.

Эту среду можно приготовить самостоятельно как в условиях лаборатории, так и в промышленном масштабе. Способ ее приготовления простой, дешевый и быстрый. В качестве сырья для приготовления белковой основы используют молоки лососевых рыб VI стадии зрелости, которые являются отходами рыбного производства. Данное сырье доступное и недорогое.

Известно, что в молоках лососевых рыб обнаружены белки специфического состава - протамины (сальмины), которые обладают высокой биологической активностью (В.П.Зайцев, И.В.Кизеветтер и др. «Технология рыбных продуктов». //Изд-во «Пищевая промышленность». - М. 1965. с.72-74; Ю.И.Касьяненко, Т.Н. Пивненко. «Сравнительные физико-химические характеристики низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из морских гидробионтов». //Известия ТИНРО. 1999. т.125. с.152-158; Н.Б.Серебряная, А.А.Новик. «ДНК как иммуностимулятор». //Медицинская иммунология. 2001. т.3, №1. с.27-34).

При этом существенными признаками предложения следует считать качественный и количественный состав питательной среды, т.к. величины содержания компонентов в заявляемой питательной среде являются оптимальными и обусловливают относительную сбалансированность стоимости среды с ее ростовыми характеристиками при выявлении лецитиназной активности листерий. Лецитиназная активность L.monocytogenes и L.ivanovii проявляется уже через 16-18; 24 часа инкубации исследуемых культур при 37°С.

Питательную среду готовят следующим образом.

Сначала готовят белковую основу из молок лососевых рыб. Для этого берут 500 г измельченных молок лососевых рыб, добавляют водопроводную воду в соотношении 1:2. Кипятят 1 ч на медленном огне. Получают отвар, который сушат вакуумной сушкой. Сухой отвар из молок рыб хранят в бытовом холодильнике (4-8°С) или при комнатной температуре, герметично упакованным, от 6 мес до 1 года.

Полученный сухой концентрат отвара молок используется в качестве белковой основы для приготовления питательной среды следующего состава, г/л:

Сухой концентрат отвара молок лососевых рыб - 2,7-3,2 Микробиологический агар - 10,0±0,2 Хлорид натрия - 5,0 Глюкоза - 1,0 Дрожжевой экстракт - 4,0-10,0 Активированный уголь (порошок) - 2,5-5,0 Дистиллированная вода - остальное

рН среды 7,2-7,4

Дополнительно в питательную среду добавлена 30% эмульсия яичного желтка из расчета 50 мл/л стерильной среды.

Заявляемая питательная среда соответствует критериям изобретения: «новизна» (в качестве белковой основы в питательной среде для определения лецитиназной активности бактерий рода Listeria используют сухой концентрат отвара молок лососевых рыб); «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Для сравнения свойств заявляемой среды со средой-прототипом (ГРМ №1 производство г.Оболенск) исследовали лецитиназную активность следующих микроорганизмов: Listeria monocytogenes NCTC 10527 (4b серовариант); L.monocytogenes CLIP 75936 (1/2a серовариант); L.ivanovii NCTC 11846; L.innocua SLCC 3379; L.seeligeri SLCC 5921; L.grayi 17; L.welchimeri SLCC 5334, Staphylococcus aureus 192 и Escherichia coli 284.

На чашки Петри с заявляемой средой и средой прототипом штрихом засевали исследуемые культуры и культивировали при температуре 37°С. Учет результатов проводили путем визуального осмотра чашек через 16-18, 24 и 48 ч культивирования. На заявляемой среде через 16-18, 24 ч вокруг культур L.monocytogenes NCTC 10527 (4b серовариант); L.monocytogenes CLIP 75936 (1/2a серовариант); L.ivanovii NCTC 11846 наблюдался гидролиз лецитина, проявляющийся в виде появления плотного ореола шириной 0,2-1,5 мм. На среде прототипе через 24 ч ореола вокруг культур L.monocytogenes NCTC 10527 (4b серовариант); L.monocytogenes CLIP 75936 (1/2a серовариант); L.ivanovii NCTC 11846, не отмечалось. Здесь гидролиз лецитина наблюдался только к 48 часам культивирования. Это подтверждает более высокую разрешающую способность заявляемой среды.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

К 3,0 г сухого концентрата отвара молок лососевых рыб добавляют 7,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы, 5,0 г хлорида натрия, 2,5 г активированного угля и разводят питательную среду до 1 л дистиллированной водой. Смесь перемешивают, 20% NaOH доводят рН среды до 7,2-7,4. Полученную питательную среду разливают по емкостям и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 минут. Полученную среду охлаждают до 45-55°С. Далее в емкость с питательной средой дополнительно добавляют стерильную 30% эмульсию яичного желтка из расчета 5 мл эмульсии на 100 мл питательной среды.

Для приготовления эмульсии яичного желтка желток одного яйца соединяют с 50,0 мл стерильного физраствора и эмульгируют. Для длительного хранения добавляют в эмульсию 1-2 капли хлороформа. Хранят при температуре 4-8°С в течение 30 дней.

Готовую питательную среду разливают в чашки Петри.

Питательная среда представляет собой гель черного цвета, без запаха.

На чашки штрихом засевали исследуемые культуры и культивировали их при температуре 37°С. Учет результатов проводили путем визуального осмотра через 16-24 часа. Гидролиз лецитина проявляется в виде плотного мутного ореола вокруг штрихового посева шириной 0,2-1,5 см.

Пример 2

К 2,7 г сухого концентрата отвара молок лососевых рыб добавляют 10,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы, 5,0 г хлорида натрия, 5,0 г активированного угля и разводят питательную среду до 1 л дистиллированной водой. Смесь перемешивают, 20% NaOH доводят рН среды до 7,2-7,4. Полученную питательную среду разливают по емкостям и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. Полученную среду охлаждают до 45-55°С. Далее в емкость с питательной средой дополнительно добавляют стерильную 30% эмульсию яичного желтка из расчета 5 мл эмульсии на 100 мл питательной среды.

Готовую питательную среду разливают в чашки Петри.

Питательная среда представляет собой гель черного цвета, без запаха.

На чашки штрихом засевали исследуемые культуры и культивировали их при температуре 37°С. Учет результатов проводили путем визуального осмотра через 16-24 часа. Гидролиз лецитина проявляется в виде плотного мутного ореола вокруг штрихового посева шириной 0,2-1,5 см.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как в научно-исследовательской, так и в практической работе для санитарно-эпидемиологического и ветеринарного контроля зараженности продуктов питания, объектов окружающей среды в центрах Госсанэпиднадзора, пищевой промышленности. Питательная среда содержит сухой концентрат отвара молок лососевых рыб, микробиологический агар, хлорид натрия, глюкозу, дрожжевой экстракт, активированный уголь (порошок), дистиллированную воду в заданных количествах и 30%-ную эмульсию яичного желтка, которую добавляют после стерилизации питательной среды из расчета 50 мл/л стерильной среды. Изобретение позволяет сократить сроки выявления лецитиназной активности листерий.

Питательная среда для определения лецитиназной активности у листерий, содержащая белковую основу, микробиологический агар, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, глюкозу, активированный уголь, эмульсию яичного желтка, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что питательная среда в качестве белковой основы содержит сухой концентрат отвара молок лососевых рыб при следующем соотношении компонентов, г/л:
Сухой концентрат отвара молок лососевых рыб 2,7-3,2 Микробиологический агар 10,0±2,0 Хлорид натрия 5,0 Глюкоза 1,0 Дрожжевой экстракт 4,0-10,0 Активированный уголь (порошок) 2,5-5,0 Дистиллированная вода остальное рН среды 7,2-7,4,