ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза животных и человека и для выделения листерий из объектов окружающей среды.

Актуальность проблемы заключается в том, что листериоз животных и человека широко распространен по всем мире. Однако по сравнению с развитыми странами процент выявления заболеваемости людей листериозом в нашей стране сравнительно невысокий, причем главной причиной является несовершенство лабораторной диагностики вследствие отсутствия недорогих отечественных, эффективных дифференциально-диагностических сред для диагностики и выделения листерий. В нашей стране в настоящее время в основном используют дорогостоящие зарубежные селективные среды.

Известна импортная селективная среда PAL CAM (по прописи Merck) (Бактериологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий, Бакулов И. А. , - Ульяновск, 1999, с. - 22) содержащая следующие компоненты: пептон, крахмал, хлористый натрий, агар-агар, эскулин, аммоний железа (III) сульфат, Д-маннит, феноловый красный, глюкоза, хлористый литий.

Недостатком этой среды является ее очень высокая цена - цена одного килограмма равна 226 $.

Известна отечественная "Питательная среда для выделения листерий", заявка 95-1099695/13, МКИ 12 Q 1/04, С 12 N 1/20, авторы Ибрагимов Ф.Х., Бойко О. В. , Бойко А.В., содержащая гидролизат казеина, сухой питательный бульон, мочевину, теллурит калия, агар-агар и воду.

Недостатком данной среды является: во-первых, довольно большая стоимость, за счет использования гидролизата казеина, во-вторых, низкая разрешающая способность, т.к. теллурит калия ингибирует не только сопутствующую микрофлору, но и некоторые штаммы листерий.

Наиболее близкой к предлагаемому техническому решению является селективная питательная среда (автореферат "Психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколого-эпидемиологическое значение", Беленева И.А. - Владивосток, 1996, с. 9), состоящая из питательного агара КД (г.Махачкала), трипафлавина, налидиксовой кислоты и полимиксина В.

Недостатком данной среды является ее низкая разрешающая способность, т. к. она не дифференцирует колонии листерий от колоний сопутствующей микрофлоры, а также из-за недостатка питательных веществ в среде колонии вырастают очень мелкие (0,4-0,5 мм) и их трудно различить на желтоватом фоне среды.

Задачей данного изобретения является получение недорогой отечественной питательной среды с высокой разрешающей способностью, не уступающей зарубежным средам.

Это достигается тем, что питательная среда, содержащая источники азота, агар-агар, налидиксовую кислоту и воду дополнительно содержит дрожжевой экстрат, глюкозу, эскулин, цитрат железа трехвалентного и метиленовый синий, а в качестве источника азота она содержит панкреатический рыбный гидролизат по Хоттингеру с содержанием аминного азота 110 мг % при следующем соотношении компонентов, л:
Дрожжевой экстрат - 10,0
Глюкоза - 1,0
Агар-агар - 10,0
Эскулин - 0,6
Цитрат железа - 0,5
Налидиксовая к-та - 0,04
Метиленовый синий - 0,03
Панкреотический рыбный гидролизат - Остальное
Приготовление среды.

Заранее готовят:
1. Панкреотический рыбный гидролизат по Хоттингеру по известной методике (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, Биргер О.М., Москва, 1967, с.53-54);
2. 10% раствор дрожжевого экстрата, используя сухой коммерческий препарат. Стерилизуют его при 0,5 атм, 20 мин;
3. 1% раствор налидиксовой кислоты - 0,05 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1N NaOH и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды;
4. 1% раствор метиленового синего - 1 г вещества растворяют в 100 мл дистиллированной воды;
Затем готовят питательный агар, при этом из основного перевара по Хоттингеру готовят сначала питательный бульон, разводят дистиллированной водой до содержания в нем аминного азота 123 мг %. Затем в 1 л питательного бульона добавляют 12 г агар-агара и 0,5-0,6 NaCl. Стерилизуют при 1 атм (121^oС) в течение 20 мин.

Для приготовления 1л питательной среды берут 100 мл 10% стерильного дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 0,6 г эскулина, 0,5 г цитрата железа (III), 3 мл 1% раствора метиленового синего и остальное питательный агар. Смесь доводят до кипения, варят на медленном огне 2-3 мин, затем добавляют 4 мл налидиксовой кислоты. Среду тщательно перемешивают, разливают по чашкам Петри по 13-20 мл (в зависимости от размера чашки). Цвет застывшей питательной среды голубовато-синий. рН среды 7,2-7,4.

Предлагаемый панкреатический рыбный гидролизат в качестве питательной основы, являясь продуктом глубокого расщепления белков, содержит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме микроорганизмов. Кроме того, содержание амминного азота в данной питательной среде в количестве 110 мг % в сочетании с глюкозой и дрожжевым экстрактом в предлагаемых количествах способствует интенсивному росту листерий, так как дрожжевой экстракт является поставщиком витаминов группы В, а глюкоза - источником углерода.

Применение метиленового синего в сочетании с налидиксовой кислотой в предложенных количествах позволяет подавить сопутствующего микрофлору, при этом не оказывает ингибирующего действия на рост листерий. Также метиленовый синий окрашивает питательную среду в голубовато-синий цвет. На этом фоне колонии листерий очень хорошо видны. Использование эскулина и цитрата железа (III) позволяет дифференцировать колонии листерий от сопутствующих бактерий по биохимическому тесту-гидролиз эскулина. Колонии листерий серебристо-серого цвета, слегка выпуклые с черным ареалом хорошо выделяются на синем фоне среды. Величина колоний 1,2-1,5 мм. Агар-агар используется в качестве уплотнителя среды.

Заявленное техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень" ввиду того, что впервые для дифференциации листерий используют панкреатический рыбный гидролизат с содержанием аминного азота 110 мг % в сочетании с дрожжевым экстрактом и глюкозой в предлагаемых концентрациях и метиленовый синий в сочетании с налидиксовой кислотой в качестве селективной добавки в питательной среде для выделения листерий, а также использование биохимического теста, присущего большинству серотипов Listeria monocytogenes - способность гидролизовать эскулин.

Существенным отличием предложенного технического решения является
- возможность использования предлагаемой среды для более точной дифференциации листерий;
- замена дорогостоящих импортных питательных основ на недорогую отечественную;
- использование метиленового синего в качестве ингибитора посторонней микрофлоры и красителя самой среды.

В результате этого достигается
- интенсификация роста листерий;
- индикация и дифференциация листерий;
- удешевление питательной среды;
- расширение ассортимента отечественных питательных сред для дифференциации листерий.

Пример конкретного выполнения
Для приготовления 1 л питательной среды берут 100 мл 10% стерильного дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 0,6 г эскулина, 0,5 г цитрата железа (III), 3 мл 1% раствора метиленового синего и остальное питательный агар с содержанием аминного азота 123 мг %. Смесь доводят до кипения, варят на медленном огне 2-3 мин, затем добавляют 4 мл 1% раствора налидиксовой кислоты. Среду тщательно перемешивают, разливают по чашкам Петри по 13-20 мл (в зависимости от размера чашки). Цвет застывшей питательной среды голубовато-синий, рН среды 7,2 - 7,4. На приготовленную среду высевали штаммы 4 b, 1/2 а е 546 L. Monocytogenes в количестве 10²КОЕ в 0,1 мл физиологического раствора, а также в смеси с почвенной болтушкой в количестве 10²KOE в 0,1 мл почвенной взвеси. Через 48 ч культивирования при 37^oС на чашках с чистой культурой выросло 42 колонии штамма 4 b, 62 колонии штамма 1/2 а е 54 колонии штамма 546. Колонии круглые, величина колоний 1,2-1,5 мм, цвет серебристо-серый с четко выраженным черным ореолом на синем фоне среды.

В смеси с почвенной болтушкой колонии листерий четко дифференцировались от колоний почвенных возбудителей. Колонии сопутствующей микрофлоры выросли мелкие (0,4-0,6 мм), бесцветные в незначительном количестве.

Для сравнительного изучения ростовых и дифференциально-диагностических свойств известных технических решений и предлагаемой среды были использованы среды, взятые в качестве аналогов и прототипа. Результаты исследований представлены в таблице. Предложенная питательная среда по своим ростовым и дифференциально-диагностическим свойствам не уступает зарубежной питательной среде (1) и дешевле ее по стоимости в 8 раз. По сравнению с прототипом предлагаемая питательная среда обладает более высокими ростовыми факторами, ярко выраженными дифференциально-диагностическими свойствами, а также более высокой ингибирующей способностью по отношению к сопутствующей микрофлоре, при этом не угнетая рост листерий.

Технико-экономическая эффективность данного предложения заключается в следующем:
- повышается диагностическая эффективность и возможность дифференциации листерий в сравнительно короткие сроки с минимальными затратами;
Это дает возможность отказаться от использования дорогостоящих зарубежных питательных сред и увеличить процент обнаружения листериоза человека и животных в стране для успешной борьбы с этим заболеванием.

Изобретение относится к микробиологии. Может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза животных и человека и для выделения листерий из объектов окружающей среды. Среда содержит следующие компоненты, г/л: дрожжевой экстракт - 10,0; глюкоза - 1,0; агар-агар - 10,0; эскулин - 0,6; цитрат железа трехвалентного - 0,5; налидиксовая кислота - 0,04; метиленовый синий - 0,03; панкреатический рыбный гидролизат c содержанием аминного азота 110 мг % - остальное. Среда обладает более высокими ростовыми и дифференциально-диагностическими свойствами. 1 табл.

Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий, содержащая источники азота, агар-агар, налидиксовую кислоту, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит дрожжевой экстракт, глюкозу, эскулин, цитрат железа трехвалентного и метиленовый синий, а в качестве источника азота - панкреатический рыбный гидролизат с содержанием аминного азота 110 мг% при следующем соотношении компонентов, г/л:
Дрожжевой экстракт - 10,0
Глюкоза - 1,0
Агар-агар - 10,0
Эскулин - 0,6
Цитрат железа трехвалентного - 0,5
Налидиксовая кислота - 0,04
Метиленовый синий - 0,03
Панкреатический рыбный гидролизат с содержанием аминного азота 110 мг% - Остальное